Name: real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells
Uploaded: 2019-01-29T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Эта работа была поддержана от грантов от Уэллком траст (101067/Z/13/Z (СПР), 109657/Z/15/Z (ТЗ), 615KIT/J22738 (ТЗ), Великобритания) и MRC (MR/N022556/1 (СПР, ТЗ), Великобритания). НОК и DDS признать поддержки со стороны национальных фенотипические скрининг центр Phenomics обнаружения инициативу и Великобритании исследования рака (NOC)

<ol>
	<li>Barry, M., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocytes:+all+roads+lead+to+death.">Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death.</a> Nature Reviews in Immunology. 2, 401-409 (2002).</li><li>Durgeau, A., Virk, Y., Corgnac, S., Mami-Chouaib, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+targeting+CD8+T-cell+immunity+for+more+effective+cancer+immunotherapy.+Frontiers+in+Immunology.">Recent advances in targeting CD8 T-cell immunity for more effective cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology.</a> 9. , 14 (2018).</li><li>Tanaka, A., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+in+cancer+immunotherapy.">Regulatory T cells in cancer immunotherapy.</a> Cell Research. 27, 109-118 (2017).</li><li>Fleming, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+myeloid-derived+suppressor+cells+to+bypass+tumor-induced+immunosuppression.">Targeting myeloid-derived suppressor cells to bypass tumor-induced immunosuppression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 398 (2018).</li><li>Cassetta, L., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+targeting:+opening+new+possibilities+for+cancer+immunotherapy.">Macrophage targeting: opening new possibilities for cancer immunotherapy.</a> Immunology. 155, 285-293 (2018).</li><li>Chahroudi, A., Silvestri, G., Feinberg, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+fluorogenic+caspase+substrates.">Measuring T cell-mediated cytotoxicity using fluorogenic caspase substrates.</a> Methods. 31, 120-126 (2003).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Azimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+functional+assay+of+regulatory+T+Cells.">Identification, isolation, and functional assay of regulatory T Cells.</a> Immunological Investigation. 45, 584-602 (2016).</li><li>Bruger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+the+immunosuppressive+activity+of+MDSC:+assays,+problems+and+potential+solutions.">How to measure the immunosuppressive activity of MDSC: assays, problems and potential solutions.</a> Cancer Immunology Immunotherapy. , (2018).</li><li>Qian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+macrophage+population+mediates+metastatic+breast+cancer+cell+extravasation,+establishment+and+growth.">A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth.</a> PLoS One. 4, e6562 (2009).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+differentiate+to+immune+suppressive+precursors+of+metastasis-associated+macrophages+in+mouse+models+of+metastatic+breast+cancer.">Monocytes differentiate to immune suppressive precursors of metastasis-associated macrophages in mouse models of metastatic breast cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 2004 (2018).</li><li>Bronte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+myeloid-derived+suppressor+cell+nomenclature+and+characterization+standards.">Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards.</a> Nature Communications. 7, 12150 (2016).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2-induced+chemokine+cascade+promotes+breast+cancer+metastasis+by+enhancing+retention+of+metastasis-associated+macrophages.">CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages.</a> Journal of Experimental Medicine. 212, 1043-1059 (2015).</li><li>Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+from+subcutaneously+grown+E0771+medullary+breast+adenocarcinoma.">Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma.</a> AnticancerResearch. 25, 3905-3915 (2005).</li><li>Choppa, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+the+detection+of+Mycoplasma+fermentans,+M.+hominisandM.+penetransin+cell+cultures+and+blood+samples+of+patients+with+chronic+fatigue+syndrome.">Multiplex PCR for the detection of Mycoplasma fermentans, M. hominisandM. penetransin cell cultures and blood samples of patients with chronic fatigue syndrome.</a> Molecular and Cellular Probes. 12, 301-308 (1998).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current protocols in immunology. , (2001).</li><li>Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+colorimetric+cell+proliferation+assays+in+immune+cells.">A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells.</a> Cytotechnology. 68, 1489-1498 (2016).</li><li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived-suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system.">Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 9, 162-174 (2009).</li><li>Cassetta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+and+human+tumor-associated+macrophages.">Isolation of mouse and human tumor-associated macrophages.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 899. 899, 211-229 (2016).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Этот метод основан на двух отдельных совместно культуры шаги: совместного культивирования CD8 клетки+ T с потенциальными клетки подавитель, и совместного культивирования «предварительно кондиционером» CD8+ T клетки с целевой опухолевых клеток (рис. 1). Первым этапом совместного культуры довольно похож на CD8+ T мобильных распространения анализов, обычно используется для определения влияния клетки супрессоры CD8+ функции Т-клеток. Однако пролиферацию клеток T не всегда коррелирует с их цитотоксичности. Например, мы обнаружили, что Сопредседатель культура с M-MDSCs или MAMs увеличилась, а не снижение количества CD8+ T-клеток присутствии CD3/CD28 активации антител (дополнительный рис. 3), тогда как эти предварительно кондиционером CD8+ Т-клетки продемонстрировали снижение цитотоксичность против целевой раковые клетки (рис. 4, Рисунок 5, Рисунок 6). Эти результаты подчеркивают важность оценки функциональной активности, подтверждается целевой рак клеток апоптоза, предлагаемые этой CD8 assay цитотоксичности клетки T+ .
В этот assay, мы определили что CD8+ T клетки требует приблизительно 15 h совместно культуры с целью побудить максимальная апоптоз клеток молочной железы опухоль E0771-LG мыши (рис. 5). Эта задержка может быть из-за запаздывания между первоначальный контакт эффекторных клеток с целей и сопровождающих формирование иммунной синапса, а также время, необходимое для побудить apoptotic сигналов в цели, как измеряется активацию caspase-3 (Дополнительные фильм 1 ). Мы также определили которые количество apoptotic опухолевых клеток достигли плато через 24 часа, который, вероятно, из-за ликвидации целей Т-клеток и/или потеря флуоресцентного сигнала от мертвых клеток. Эта возможность определить время пик апоптоз является одним из основных преимуществ этого анализа, поскольку определение оптимального времени точки имеет важное значение для соответствующих сопоставлений между различными условиями. В нашем случае например, разница в цитотоксичности между управления CD8+ T клетки и CD8 MDSC/MAM-образование+ T клетки была гораздо больше, в 15-18 ч, по сравнению с 72 h (рис. 5), и таким образом конечную экспериментировать с использованием 72 h инкубационный период принесет заблуждение результаты.
Этот метод также позволяет визуализации реального времени эффекторных в целевой ячейке взаимодействия, которая обеспечит большее понимание механизм, лежащие в основе ограниченных цитотоксичность CD8+ T клетки предварительно инкубировали с супрессорной клеток. Например, мы наблюдали что CD8+ T клетки, предварительно инкубировали с M-MDSCs или MAMs столкнулся и взаимодействовали с целевой опухолевых клеток, но не всегда вызывает апоптоз (Дополнительные фильм 4, дополнительные фильм 5, дополнительные фильм 6). Хотя мы не сделали количественно это событие, было бы целесообразно и интересным для количественной оценки и сравнения доля встречи и время их взаимодействия в корреляции с индукции апоптоза. Другим большим преимуществом является, что этот метод требует небольшое количество клеток (например, 1 x 103 цели) и 4 x 103 клеток-эффекторов за хорошо. В самом деле этот протокол может далее миниатюрных для формат пластины 384-ну при желании. Таким образом этот assay подходит для высокой пропускной способности скрининг и экспериментов где числа клеток являются ограниченными, такие, как в vitro тестирования с использованием драгоценных клеток, полученных от в естественных условиях или ex vivo образцы.
С другой стороны ограничение текущего анализа является наличие значительного числа погибших эффекторных клеток в некоторых условиях. Для того, чтобы повысить точность в распознавании апоптоз раковых клеток-мишеней, эффекторные CD8+ T клеток, ядер цели, которыми помечены клетки и ядер, что ограничение на размер (что исключает эффекторных клеток) применяется для анализа данных в этой проба (рис. 2). Однако есть некоторые случаи, где оверлея агрегатов (зеленый) apoptotic CD8+ T клетки на не apoptotic целевой раковые клетки, которые могут сбить с толку результаты. Это ограничение может быть смягчены путем использования столбца удаления мертвых клеток на эффекторные клетки перед культуры совместно с целевой опухолевых клеток, предполагая, что достаточное количество клеток-эффекторов доступны. С более сложными системами микроскопии, он также может быть возможным сократить ложный положительный сигнал, снабдив эффекторных CD8+ T-клеток с Флюорофор отличается от целевой клеточных ядер и субстрата fluorogenic каспазы-3.
До настоящего времени этот протокол был использован расследовать активации неспецифических антигена CD8+ T клетки. Хотя MDSCs и ТАМС в микроокружения опухоли подавить функций клеток T через антиген неспецифических механизмов, MDSCs в периферических лимфоидных тканей подавить Т-клеток ответов в антиген конкретным образом18. Расследовать подавляющей иммунные функции таких типов клеток, в пробирке распространения assay с помощью CD8+ T клетки от ОП-1 обычно используется трансгенных мышей. В этот assay, OT-1 Т-клетки (выражая овальбумина (OVA) конкретные Т-клеточный рецептор) совместно культивируемых с супрессорной MDSCs присутствии OVA пептиды, которая применима для первой культуры в нашей цитотоксичность assay (т.е.., активация Т-клеток в наличие или отсутствие супрессоров). Это также возможно для манипулирования целевой раковые клетки выразить OVA, которые могут вызвать рак антиген специфические клетки убийства OT-1 Т-клеток. Таким образом assay позволит также расследование подавления мам/MDSC-опосредованной активации антиген специфические Т-клеток. Это также можно применять assay расследовать человеческих клеток, как активация антител против человека CD3 и CD28 коммерчески доступных, и протокол изолировать человека ТАМС из клинических образцов был установленным19.
Коллективно этот assay довольно универсальна и может использоваться для изучения цитотоксичность других типов иммунных клеток. В настоящее время в наших лабораториях, он расширяется для изучения цитотоксичность антиген зависимой ячейки в различных условиях и является также разрабатывается для высокой пропускной способности скрининга.

Известно, что CD8+ T клетки могут устранить опухолевых клеток, когда они оказывают их полной цитотоксичности. После активации Т-клеточных рецепторов (TCR), CD8+ T клетки размножаются и дифференцироваться в цитотоксических эффекторных клеток. Расширенный и активированные CD8+ T клетки выделяют цитотоксические гранул, включая Перфорины и granzymes, который переводятся в клетки-мишени и инициировать различные литические пути, такие как каспазы-3 при посредничестве апоптоз1. CD8+ T клетки можно также вызвать апоптоз клеток опухоли, активировав рецепторов на клетки-мишени, таких как приемные устройства для α фактор некроза опухоли (ФНО α), первый апоптоз сигнал лиганда (FasL), или ФНО связанных лигандов индуцировать апоптоз (TRAIL). Кроме того активированные CD8+ T клетки секретируют интерферона гамма (ИФН γ), можно подавлять пролиферацию опухолевых клеток и повысить чувствительность клеток опухоли CD8+ T-клеток через вверх регулирование FasL приемного устройства1. Учитывая потенциал для CD8+ T были созданы опухоли убийство способности, несколько стратегий для повышения их цитотоксичности (например, контрольно-пропускной пункт ингибиторы, вакцинация рака и приемным передачи химерных антигена рецепторов (автомобиль) выражая Т-клетки) и показали значительный терапевтический эффект на некоторые виды рака2. Однако, накапливая доказательства предполагает, что проникновения опухоли иммунной клетки таких нормативных Т-клеток, миелоидной производные подавитель клетки (MDSCs), и опухольассоциированных макрофагов (ТАМС) можно подавить CD8+ T мобильных функций и ограничивают эффективность 3,immunotherapies4,5. Для улучшения такой immunotherapies, важно понять как иммунной супрессоров клетки предел CD8+ Т клеточной цитотоксичности. Идентификацию из CD8 клетки T+ механизмы подавления, а также druggable цели, чтобы преодолеть его, потребует разработки и использования в пробирке анализов.
Золотой стандарт метод измерения CD8+ цитотоксичность клеток T является пробирного выпуска хрома, в котором выпуска радиоактивных зонд (51Cr), от целевой ячейки, лизированы, CD8+ T клетки, определяется6. Однако этот assay имеет ряд недостатков, в том числе относительно низкая чувствительность, высокий фон, неспособность обнаруживать ранние apoptotic события, проблемы утилизации опасных и ограниченная совместимость с автоматизированной обработки жидких и обнаружения для поддержки выше производительность приложения. Еще одним распространенным методом является анализ гранулярных потоков, в которых обнаруживается annexin V привязки7апоптоз опухолевых клеток-мишеней. В этот assay это можно обнаружить другие параметры, такие как целевой клеточной смерти с помощью пропидий йодидом (PI) или 7-aminoactinomycin D (7-AAD) и активации эффекторных клеток обозначается CD107a или CD69 выражения, в дополнение к apoptosis в клетки-мишени7 . Однако этот assay требует большого числа клеток супрессоров, по сравнению с Пробирной выпуска хрома. Он также требует отряда и дезагрегирования адэрентных целевых клеток, и это может исказить результаты. Действительно, хром релиз анализа или анализа потока гранулярных обычно не используются для расследования подавитель клеточные эффекты на функции Т-клеток. Вместо этого, измерение Т-клеточной пролиферации, указывается путем разбавления флуоресцентные краски (например, CFSE), предварительно загружаются в Т-клетки часто используется для оценки ингибирование CD8+ Т-клеток функции клеток супрессоров. Обнаружение ИФН γ производства от культивируемых клеток T является другой стандартный метод для оценки воздействия клеток супрессоров на Т-клеток активации8,9. Однако результаты этих анализов не обязательно коррелирует целевой ячейке убийство способности CD8+ T клетки.
Мы представляем здесь альтернативные функциональные assay оценить эффекты подавитель клеток, особенно макрофаги в метастатические опухоли, на цитотоксичность CD8+ T клетки. Этот метод определяет цитотоксичность CD8+ T клетки, предварительно культивируемых с или без клетки подавитель присутствии активирующих антител анти CD3/CD28, путем обнаружения апоптоза клеток опухоли, обозначается флуоресценции от fluorogenic каспазы-3 Субстрат6 с помощью автоматизированных покадровой микроскопии (рис. 1). Этот протокол имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами; Он требует только небольшое количество клеток, позволяет обнаружение гибели адэрентных опухолевых клеток с высокой чувствительностью, могут изображений в реальном времени эффекторных цель взаимодействия и поддаются скрининга высокой пропускной способности.
В этом протоколе связанные с метастазированием макрофагов (MAMs) и их предшественники monocytic-MDSCs (M-MDSCs) изолированный от метастатических опухолей у мышей используются как клетки супрессоры. В моделях мыши метастатическим раком молочной железы, собственный населения макрофагов характеризуется как F4/80высокогоLy6G–CD11bвысокойLy6Cнизкой накапливается в легких, содержащий метастатические опухоли. Это население макрофагов редко найти в обычных легких и таким образом называется метастазированием связанные макрофагов (MAMs)10. В этих моделях мыши, другой миелоидных клеток населения, определяется как F4/80высокогоLy6G–CD11bвысокойLy6Cвысокий, также накапливается преимущественно в метастатических легких, где она рождает MAMs11. На основе их характеристик, CD11bвысокойLy6Cвысокой MAM клетки-предшественники могут представлять М-MDSCs12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Freiner Bio-One</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Plystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (Flat bottom)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>165305</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>MCA497A647</td>
			<td>Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100730</td>
			<td>Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102111</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td>Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128026</td>
			<td>Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (100&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352360</td>
			<td>To smash the spleen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (40&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352340</td>
			<td>To filter the lung digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td>Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex Ready-to-Use</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1596-01</td>
			<td>Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4476</td>
			<td>Lenti viral particules encoding mKate2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Detector (fluorescence microscope)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM 2018A</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-927</td>
			<td>Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucView488</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10403</td>
			<td>Fluoregenic caspase-3 substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin Streptomycin for primary culture of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>212-12</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;: Nikon 10X objective (resolution 1.22 &#181;m) 
			&#160;: Green channel excitation: 440 - 480 nm 
			&#160;: Green channel emission: 504 - 544 nm 
			&#160;: Red channel excitation: 565-605 nm 
			&#160;: Red channel emission: 625 - 705 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells

Потенцирование опухоль убийство способности CD8+ T клеток в опухоли, а также их эффективного опухолевого инфильтрата, является ключевым элементом успешной immunotherapies. Несколько исследований показали, что инфильтрирующие миелоидных клеток опухоли (например, клетки миелоидного производные супрессор (MDSCs) и опухольассоциированных макрофагов (ТАМС)) подавить цитотоксичность CD8+ T-клеток в микроокружения опухоли и что ориентация Эти нормативные миелоидных клеток может улучшить immunotherapies. Здесь мы представляем в пробирке пробирного системы для оценки иммунного подавляющее воздействие, monocytic-MDSCs и ТАМС на способность опухоли убийство CD8+ T клетки. С этой целью мы впервые культивировали наивно селезеночной CD8+ T клетки с анти CD3/CD28 активация антител в присутствии или отсутствии клеток супрессоров, а затем совместно культивируемых предварительно активированных Т-клеток с цели раковых клеток в присутствии fluorogenic Субстрат каспазы-3. Флуоресценции от субстрата в раковых клетках был обнаружен в режиме реального времени флуоресцентной микроскопии как показатель Т-клеток индуцированной апоптоза клеток опухоли. В этот assay, мы можем успешно обнаружить увеличение апоптоз клеток опухоли, CD8+ T клетки и его подавления предварительно культуры с ТАМС или MDSCs. Этот функциональный assay полезен для расследования CD8+ T мобильных подавления механизмов регулирования миелоидных клеток и выявления druggable цели преодолеть его через показ высокой пропускной способности.

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Мы здесь описать протокол расследовать цитотоксичность предварительно активированные CD8 клетки+ T против раковых клеток путем обнаруживать apoptotic раковых клеток через реальном времени микроскопии. Этот протокол можно изучить механизмы за подавление миелоидных клеток индуцированной Т-клеток и оценивать соединений, направленных на пополнение T клетки через блокады иммунной подавляющих миелоидных клеток.

Режиме реального времени обнаружения в апоптоз клеток in Vitro опухоли индуцированные CD8 клетки+ T для изучения подавляющей иммунные функции проникновения опухоли миелоидных клеток

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Наш протокол оценивает влияние миелоидных клеток супрессоров и связанных с опухолью макрофагов при апоптозе опухолевых клеток, вызванных Т-клетками. Наряду с исследованием основных механизмов потенциальных терапевтических вмешательств. Этот протокол непосредственно оценивает Апоптоз опухолевых клеток, вызванных Т-клеток, с высокой чувствительностью и позволяет продольный анализ и визуализацию взаимодействий между клетками и клетками.Эффективность ингибитора контрольно-пропускных точки лучше всего рассматривать опухолевым проникновением миелоидных клеток в определенных типах опухолей. Этот метод может привести к выявлению новых методов лечения этих опухолей. Этот метод может не только продвинуть исследования иммунологии рака, но потенциально может также обеспечить понимание иммунодефицита и аутоиммунных заболеваний.Для активации и расширения селезенки изолированных CD8-положительных Т-клеток, первый aliquot один раз от 10 до пятого CD8-положительных Т-клеток в 50 микролитров E-DMEM в отдельных скважин 96-ну U-нижней пластины. Затем добавьте один раз 10 к пятой клетке супрессора в 50 микролитров E-DMEM, или 50 микролитров E-DMEM в одиночку, в каждый колодец Т-клеток. Затем добавьте 50 микролитров свежеприготовленной среды активации и 50 микролитров E-DMEM, с или без представляющих интерес испытательных реагентов, к соответствующим скважинам.И поместите пластину в 37-градусный по Цельсию и 5%углекислый газ инкубатор с 95% влажности в течение четырех дней. Чтобы создать предварительно активированный CD8-положительный Т-клеток целевой ячейки совместно культуры, сначала добавить 30 микролитров от 1 до 100 разбавленных роста-фактор-уменьшенный растворимый мембраны мембраны мембраны скважины 96-ну плоский дно пластины, подходит для микроскопии. Встряхните пластину, чтобы равномерно распределить матрицу, и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры, по крайней мере один час.Пока пластина уравновешена, подготовь клетки-мишени. Аспирировать средний, мыть с PBS, и добавить один миллилитр 05%Трипсин-ЭДТА при комнатной температуре в течение одной минуты. Добавьте девять миллилитров DMEM, дополненных сывороткой крупного рогатого скота плода, нежной трубой, и перенесите диссоциированные клетки в трубки.После центрифугирования клеток, повторно помыть поддон в 500 микролитров E-DMEM. Фильтр повторного перерасхода клеток через ситечко клетки, и рассчитывать живые клетки. Затем отрегулируйте плотность в четыре раза 10 до четвертой целевой ячейки на миллилитр в свежем E-DMEM на льду.Далее, пипетка предварительно активированных CD8-положительных Т-клеток несколько раз, чтобы повторно использовать клетки в одной клеточной подвески, и передачи плавающих Т-клеток в один 1,5-миллилитровую трубку в состоянии. Соберите все оставшиеся клетки с 200 микролитров PBS на колодец, перенесите моет в соответствующие 1,5-миллилитровые трубки и центрифугу. Аспирировать среду и добавить один миллилитр E-DMEM к каждой трубке для центрифугации.После центрифугации, повторное производство гранул в 100 микролитров свежих E-DMEM на трубку. После подсчета, настроить клетки в каждой трубке с плотностью 1,6 раза 10 до пятого предварительно активированного CD8-положительных Т-клеток на миллилитр среды, и место клеток на льду. Когда клетки будут готовы, аспирировать мембранную матрицу подвала из каждой скважины 96-хорошо микроскопии пластины, и добавить 50 микролитров целевых клеток в отдельных скважин во внутренних 60 скважин пластины с смешиванием.Добавьте 25 микролитров E-DMEM, дополненных четырьмя 10 раз на третью единицу на миллилитр IL2, и 10-микромолейный фторгенный субстрат-3 к соответствующим скважинам. Затем добавьте 25 микролитров предварительно активированных CD8-положительных Т-клеток в соответствующие скважины. И, наконец, добавить E-DMEM к соответствующим скважинам, чтобы сделать общий объем до 100 микролитров.Добавьте 200 микролитров PBS или стерильной воды во все пустые колодцы. Встряхните тарелку и оставьте тарелку на ровной поверхности на 10 минут. Для изображения клеток установите микроскоп для получения изображений в фазовом контрасте.А также флуоресцентные каналы, пригодные для ядерно-ограниченного флуоресцентного белка, а также флюорогенные активированные флуорофоры, активированные казпазы-3, используемые в эксперименте. Затем захватывать изображения каждой экспериментальной хорошо в фазовом контрасте и два канала флуоресценции каждые один-три часа, по крайней мере 72 часов. Для анализа захваченных изображений откройте изображение из контрольного хорошо содержащего только клетки-мишени и средние без подложки caspase-3 в канале флуоресценции, используемом для сигнала субстрата.Обратите время на то, излучается ли ядрам неуместный сигнал флуоресценции. Если сигнал субстрата очевиден в ядрах, используйте спектральное несмешие, чтобы увеличить процент сигнала субстрата, удаленного из сигнала ядер, до тех пор, пока сигнал субстрата не исчезнет. Далее, просмотреть контроль хорошо содержащие только ядра неоцеличные клетки эффектора в среде без каспазы-3 субстрата в двух каналах флуоресценции индивидуально.Следите за тем, излучается ли сигнал ядрами. Если в отдельных каналах нет сигнала, не требуется спектральное несмешие. Для разрешения флуоресцентных объектов в обоих каналах флуоресценции используйте метод вычитания фона флуоресценции с соответствующими параметрами для образца и соответствующими параметрами для расщепления края.Используйте изображения монокультуры целевых клеток для установления параметров ядерной флуоресценции клеток-мишеней. Используйте изображения монокультуры клеток-эффекторов для установления параметров субстрат-индуцированной апоптотической ядерной флуоресценции. Используйте изображения совместной культуры для проверки или уточнения параметров субстрат-индуцированной апоптотической ядерной флуоресценции в клетках-мишенях.Для определения минимального размера ядер-мишеней используйте изображения в сигнальных каналах ядер из скважин, содержащих только клетки-мишени с подложком каспаса. Для определения среднего размера ядра апоптотического эффектора используйте изображения в канале сигнала субстрата из скважин, содержащих только клетки-эффекторы с подложком каспаса. Чтобы подсчитать количество ядер клеток-мишеней флуоресценции, найте процедуру анализа с использованием соответствующего минимального ограничения размера.Используя монокультурные изображения клеток-эффекторов, найте вторую процедуру анализа для подсчета количества апоптотических ядер, которые больше среднего размера ядер апоптотических эффекторов. Затем была создана третья процедура анализа для подсчета количества апоптотических целевых ячеек путем подсчета количества ядер, в которых сигнал ядра и сигнал с ограниченным размером субстрата значительно ко локализуются. Как правило, раковые клетки увеличивают сигнал флуоресценции в своих ядрах после активации биосенсора каспазы, когда клетки впадают в контакт с CD8-положительными Т-клетками, предварительно активированными антителами при отсутствии супрессорных клеток.Размеры ядра CD8-положительных Т-клеток меньше, чем у раковых клеток. Таким образом, апоптотические клетки-эффекторы могут быть исключены из апоптотических целевых клеток с помощью метода анализа изображений ограничения размера. Хотя некоторые целевые раковые клетки обладают небольшой округлой формой без субстратной флуоресценции, это не влияет на анализ.Поскольку эти клетки претерпевают митоз, а не апоптоз и, таким образом, исключаются из апоптотических клеток-мишеней с помощью маски перекрытия ядерного субстрата. Со-культура целевых раковых клеток с предварительно активированными CD8-положительными Т-клетками увеличивает апоптоз опухолевых клеток выше уровня спонтанного апоптоза в монокультурах раковых клеток. Как правило, при использовании оптимального соотношения целевых раковых клеток к клеткам-эффекторам можно наблюдать пик числа апоптотических целевых раковых клеток.Этот пик становится более отчетливым, когда данные выражаются как апоптотическая доля целевой популяции клеток. Самое главное помнить при попытке этого протокола является настройка монокультур целевых клеток и монокультур клеток-эффекторов для использования в разработке аналитических масок. Этот метод может дать представление о продолжительности и частоте взаимодействия Т-клеток с раковыми клетками, а также об условиях, связанных с генозависимыми цитотоксичностью как в клетках человека, так и в клетках мыши.В настоящее время мы разрабатываем этот анализ в высокой пропускной способности экрана с использованием человеческих клеток для выявления соединений, которые подавляют миелоидных клеток опосредовано иммуносупрессии и тем самым повысить эффективность ингибитора контрольно-пропускного пункта.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Визуализация-резидентов CD8 Т-лимфоцитов в опухоли легких человека кусочки с помощью конфокальной микроскопии

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Обнаружение митохондрий мембранного потенциала для изучения CLIC4 сногсшибательно индуцированной HN4 клеток апоптоз в пробирке

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Протокол изоляции моноцитарных дендритных клеток мыши и их последующее в Vitro активации с опухоли иммунных комплексов

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Обнаружение потока гранулярных новообразованной груди Рак стволовых клеток как клеток после разворота апоптоз

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosal прививки плоскоклеточный рак клеток мышей для опухоли иммунной профилирования и оценки реакции лечение

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

В Vitro опухолевых клеток Rechallenge для прогнозирования оценки химерных антигена рецепторов Т-клеток противоопухолевые функции

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

В vitro Анализ для изучения опухоли макрофаг взаимодействия

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для поколения опухолевых антигенов конкретных Т-клеток

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Поколение ортотопических опухолей поджелудочной железы и Ex vivo Характеристика опухоли-проникновения T клеточной цитотоксичности

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Измерение в режиме реального времени ответ на наркотики в органотипической опухоли ткани фрагменты

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...