Name: real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells
Uploaded: 2019-01-29T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Detta arbete stöds av bidrag från Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK) och MRC (herr/N022556/1 (JWP, TK), UK). NOC och DDS erkänner stöd från nationella fenotypiska Screening centrum Phenomics Discovery initiativ och Cancer Research UK (NOC)

<ol>
	<li>Barry, M., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocytes:+all+roads+lead+to+death.">Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death.</a> Nature Reviews in Immunology. 2, 401-409 (2002).</li><li>Durgeau, A., Virk, Y., Corgnac, S., Mami-Chouaib, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+targeting+CD8+T-cell+immunity+for+more+effective+cancer+immunotherapy.+Frontiers+in+Immunology.">Recent advances in targeting CD8 T-cell immunity for more effective cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology.</a> 9. , 14 (2018).</li><li>Tanaka, A., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+in+cancer+immunotherapy.">Regulatory T cells in cancer immunotherapy.</a> Cell Research. 27, 109-118 (2017).</li><li>Fleming, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+myeloid-derived+suppressor+cells+to+bypass+tumor-induced+immunosuppression.">Targeting myeloid-derived suppressor cells to bypass tumor-induced immunosuppression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 398 (2018).</li><li>Cassetta, L., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+targeting:+opening+new+possibilities+for+cancer+immunotherapy.">Macrophage targeting: opening new possibilities for cancer immunotherapy.</a> Immunology. 155, 285-293 (2018).</li><li>Chahroudi, A., Silvestri, G., Feinberg, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+fluorogenic+caspase+substrates.">Measuring T cell-mediated cytotoxicity using fluorogenic caspase substrates.</a> Methods. 31, 120-126 (2003).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Azimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+functional+assay+of+regulatory+T+Cells.">Identification, isolation, and functional assay of regulatory T Cells.</a> Immunological Investigation. 45, 584-602 (2016).</li><li>Bruger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+the+immunosuppressive+activity+of+MDSC:+assays,+problems+and+potential+solutions.">How to measure the immunosuppressive activity of MDSC: assays, problems and potential solutions.</a> Cancer Immunology Immunotherapy. , (2018).</li><li>Qian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+macrophage+population+mediates+metastatic+breast+cancer+cell+extravasation,+establishment+and+growth.">A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth.</a> PLoS One. 4, e6562 (2009).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+differentiate+to+immune+suppressive+precursors+of+metastasis-associated+macrophages+in+mouse+models+of+metastatic+breast+cancer.">Monocytes differentiate to immune suppressive precursors of metastasis-associated macrophages in mouse models of metastatic breast cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 2004 (2018).</li><li>Bronte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+myeloid-derived+suppressor+cell+nomenclature+and+characterization+standards.">Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards.</a> Nature Communications. 7, 12150 (2016).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2-induced+chemokine+cascade+promotes+breast+cancer+metastasis+by+enhancing+retention+of+metastasis-associated+macrophages.">CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages.</a> Journal of Experimental Medicine. 212, 1043-1059 (2015).</li><li>Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+from+subcutaneously+grown+E0771+medullary+breast+adenocarcinoma.">Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma.</a> AnticancerResearch. 25, 3905-3915 (2005).</li><li>Choppa, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+the+detection+of+Mycoplasma+fermentans,+M.+hominisandM.+penetransin+cell+cultures+and+blood+samples+of+patients+with+chronic+fatigue+syndrome.">Multiplex PCR for the detection of Mycoplasma fermentans, M. hominisandM. penetransin cell cultures and blood samples of patients with chronic fatigue syndrome.</a> Molecular and Cellular Probes. 12, 301-308 (1998).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current protocols in immunology. , (2001).</li><li>Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+colorimetric+cell+proliferation+assays+in+immune+cells.">A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells.</a> Cytotechnology. 68, 1489-1498 (2016).</li><li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived-suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system.">Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 9, 162-174 (2009).</li><li>Cassetta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+and+human+tumor-associated+macrophages.">Isolation of mouse and human tumor-associated macrophages.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 899. 899, 211-229 (2016).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Denna metod är baserad på två separata samtidig kultur steg: samtidig odling CD8+ T celler med potentiella suppressor-celler, och samtidig odling av 'konditionerade' CD8+ T celler med målet tumörceller (figur 1). Det första steget för samtidig kultur är ganska liknande den för CD8+ T cell spridning analyser används vanligen för att bestämma effekten av suppressor celler på CD8+ T-cellsfunktion. Dock korrelerar T cell spridning inte alltid med deras cytotoxicitet. Exempelvis har vi funnit det samtidig kulturen med M-MDSCs eller MAMs ökade snarare än minskade spridningen av CD8+ T celler i närvaro av CD3/CD28 aktivera antikroppar (kompletterande figur 3), medan dessa pre luftkonditionerade CD8+ T-celler visat minskad cytotoxicitet mot målet cancerceller (figur 4, figur 5, figur 6). Dessa resultat betona vikten av utvärdering av funktionell aktivitet, framgår av målet cancer cell apoptos, erbjuds av denna CD8+ T cell cytotoxicitet analys.
I denna analys, vi har identifierat att CD8+ T celler kräver ca 15 h av samtidig kultur för att framkalla maximal apoptos av E0771-LG mus mjölkkörtlar tumörceller (figur 5). Denna försening kan bero på eftersläpning mellan första kontakten av effektor celler med mål och medföljande immun synaps bildas, samt tid som krävs för att framkalla apoptotiska signaler i mål mätt av aktivering av kaspas-3 (kompletterande film 1 ). Vi har även identifierat som antalet apoptotiska tumörceller nått en platå efter 24 h, vilket förmodligen beror på avskaffandet av mål av T-celler och/eller fluorescerande signalförlust från döda celler. Denna kapacitet att identifiera tiden av peak apoptos är en stor fördel med denna analys eftersom fastställandet av en optimal tidpunkt är viktigt för lämpliga jämförelser mellan olika förhållanden. I vårt fall till exempel skillnaden i cytotoxicitet mellan kontroll CD8+ T celler och MDSC/MAM-utbildas CD8+ T celler var mycket större på 15-18 h jämfört med 72 h (figur 5), och således en slutpunkt experimentera med en 72 h inkubationstid skulle ge missvisande resultat.
Denna metod gör det också möjligt för visualisering av realtid effektor-to-target cell interaktion, vilket skulle ge större insikter i mekanismen bakom begränsad cytotoxiciteten hos CD8+ T celler före inkuberas med suppressor celler. Till exempel, vi konstaterade att CD8+ T celler före inkuberas med M-MDSCs eller MAMs stött och interagerat med målet tumörceller men inducerade inte alltid apoptos (kompletterande film 4, kompletterande film 5, kompletterande film 6). Även om vi inte kvantifiera denna händelse, vore det genomförbart och intressant att kvantifiera och jämföra andelen möten och deras interaktion tid i samband med induktion av apoptos. En annan stor fördel är att den här metoden kräver ett litet antal celler (t.ex., 1 x 103 mål) och 4 x 103 effektor celler per brunn. I själva verket kan detta protokoll vara ytterligare miniatyriserade för plattan med 384 brunnar format om så önskas. Denna analys är därför lämplig för high throughput screening och experiment där cell nummer är begränsade som in vitro- tester med dyrbara celler härstammar från in vivo eller ex vivo prover.
Däremot, är en begränsning av nuvarande analysen förekomsten av betydande antal döda effektor celler i vissa förhållanden. För att öka träffsäkerheten i skilja apoptos mål cancerceller från det av effektor CD8+ T-celler, atomkärnor av målet celler är märkta och en nuclei storlek begränsning (som utesluter effektor celler) används för dataanalys i detta assay (figur 2). Det finns dock vissa fall där överlagring av aggregat av (gröna) apoptotiska CD8+ T celler till cancerceller icke-apoptotiska mål, som kan blanda ihop resultaten. Denna begränsning kan mildras genom användning av en död cell borttagning kolumn på effektor celler före samarbete kultur med målet tumörceller, förutsatt att tillräckligt antal effektor celler finns tillgängliga. Med mer komplexa mikroskopi system, kan det också vara möjligt att minska den falska positiva signalen genom märkning effektor CD8+ T celler med en fluorophore skiljer sig från målet cellen atomkärnor och fluorogenic kaspas-3 substrat.
Hittills har detta protokoll har använts för att undersöka antigen icke-specifik aktivering av CD8+ T celler. Även om MDSCs och TAMs i den tumör mikromiljö undertrycka T cellfunktioner genom antigen icke-specifika mekanismer, undertrycka MDSCs i perifera lymfoida vävnader T-cell svar i en antigen specifika sätt18. För att undersöka immun suppressiv funktioner sådana celltyper, en in vitro-spridning analys använder CD8 celler+ T från OT-1 transgena möss används ofta. I denna analys, OT-1 T-cellerna (uttrycker äggalbumin (OVA) specifik T-cells receptor) Co odlas med suppressor MDSCs i närvaro av OVA peptider, som är tillämpligt för den första kulturen i våra cytotoxicitet analys (i.e., aktivering av T-celler i närvaron eller frånvaron av dämpning). Det är också möjligt att manipulera mål cancerceller att uttrycka ägg, som kan framkalla antigen-specifika cancer cell dödande av OT-1 T-celler. Analysen möjliggör därför även utredning av MAM/MDSC-medierad dämpning av antigen-specifika T-cellsaktivering. Det är också möjligt att tillämpa den analysmetod för att undersöka mänskliga celler, aktiveringen antikroppar mot humant CD3 och CD28 är kommersiellt tillgängliga, och ett protokoll att isolera mänskliga TAMs från kliniska prover har varit etablerade19.
Sammantaget denna analys är ganska mångsidig och kan användas för att undersöka cytotoxiciteten hos andra immunceller typer. För närvarande i våra labb, det utvidgas för att undersöka antigen-beroende cell cytotoxicitet under olika förhållanden och är också utvecklas för high throughput screening.

Det är känt att CD8+ T celler kan eliminera tumörceller när de utövar sin fulla cytotoxicitet. Efter aktivering av T-cell receptor (TCR), CD8+ T celler föröka sig och differentiera till cytotoxiska effektor celler. Den utökade och aktiveras CD8+ T celler utsöndrar cytotoxiska granulat, inklusive perforin och granzymes, som överförs till målceller och initiera olika lytisk vägar såsom kaspas-3 medierad apoptos1. CD8+ T celler kan också inducera tumör cell apoptos genom att aktivera receptorer på målceller, såsom receptorer för tumörnekrosfaktor-α (TNF-α), första apoptos signal ligand (FasL) eller TNF-relaterade apoptos-inducerande ligand (TRAIL). Dessutom den aktiveras CD8+ T celler utsöndrar interferon-γ (IFN-γ) som kan undertrycka tumör cell spridning och öka känsligheten för tumörcellerna att CD8+ T celler via Uppregleringen av FasL receptor1. Tanke på potentialen för CD8+ T tumör dödande förmåga, flera strategier för att öka deras cytotoxicitet (t.ex. checkpoint-hämmare, cancer vaccination och överföring av chimära antigen receptorn (bil) uttrycker T-celler) har fastställts och visat betydande terapeutiska effekter på vissa typer av cancer2. Ackumulerande bevis antyder dock att tumör-infiltrera immuna celler såsom regulatoriska T-celler, myeloid-derived suppressor celler (MDSCs) och tumör-associerad makrofager (TAMs) kan undertrycka CD8+ T cell funktioner och begränsa effekten immunterapier3,4,5. För att förbättra sådan immunterapier, det är viktigt att förstå hur immun suppressor celler gräns CD8+ T cell cytotoxicitet. Identifiering av CD8+ T cell undertryckande mekanismer samt druggable mål att övervinna det, krävs utveckling och utnyttjande av in vitro-analyser.
Guld standard metoden att mäta CD8+ T cell cytotoxicitet är krom utgåva analysen där utsläpp av radioaktiva sonden (51Cr), från målet celler som är lyserat av CD8+ T celler, är beslutsam6. Denna analys har dock flera nackdelar inklusive relativt låg känslighet, hög bakgrund, oförmåga att upptäcka tidiga apoptotiska händelser, farliga förfogande problem och begränsad kompatibilitet med automatiserad vätskehantering och upptäckt att stödja högre genomströmning applikationer. En annan vanlig metod är flödescytometrisk flödesanalyser där apoptos av målceller tumör upptäcks av annexin V bindande7. I denna analys är det möjligt att upptäcka andra parametrar såsom mål celldöd med propidium jodid (PI) eller 7-aminoactinomycin D (7-AAD) och effektor cellaktivering indikeras av CD107a eller CD69 uttryck, förutom apoptos i målcellerna7 . Denna analys kräver dock stort antal suppressor-celler jämfört med krom utgåva analysen. Det kräver också den lösgörande och uppdelning av vidhäftande målceller och detta kan snedvrida resultaten. Faktiskt, krom release assay eller flöde flödescytometrisk analys används inte ofta att undersöka suppressor cell effekter på T-cellfunktioner. I stället mätning av T-cell spridning anges genom utspädning av ett fluorescerande färgämne (t.ex. CFSE) förinstallerad i T-celler är ofta används för att utvärdera hämning av CD8+ T-cellsfunktion av suppressor celler. Identifiering av IFN-γ-produktion från odlade T-celler är en annan vanlig metod för att utvärdera effekterna av suppressor celler på T-cell aktivering8,9. Men resultaten från dessa analyser inte nödvändigtvis korrelerar till målcellen dödande förmåga av CD8+ T celler.
Vi presenterar här ett alternativt funktionellt test för att utvärdera effekterna av suppressor celler, särskilt makrofager i metastaserande tumörer, på cytotoxiciteten hos CD8+ T celler. Denna metod bestämmer cytotoxiciteten hos CD8+ T celler, pre odlade med eller utan suppressor cellerna i närvaro av anti-CD3/CD28 aktiverande antikroppar, genom att upptäcka tumör cell apoptos, indikeras av fluorescens från en fluorogenic kaspas-3 substratet6 använder automatiserad time-lapse mikroskopi (figur 1). Detta protokoll har flera fördelar jämfört med andra metoder. den kräver endast ett litet antal celler, möjliggör detektering av vidhäftande tumörcelldöd med hög känslighet, kan bilden effektor-to-target interaktion i realtid och är mottagliga för high throughput screening.
I detta protokoll används metastas-associerade makrofager (MAMs) och deras stamfader monocytic-MDSCs (M-MDSCs) isolerade från metastaserande tumörer hos möss som suppressor celler. I musmodeller av metastaserande bröstcancer, kännetecknas en distinkt befolkning av makrofager som F4/80högLy6G–CD11bhögLy6Clåg ackumuleras i lungan som innehåller metastaserande tumörer. Detta makrofag befolkningen sällan återfinns i den normala lungan och således kallas metastaser-associerade makrofager (MAMs)10. I dessa mus-modeller, en annan myeloisk cell befolkningen, definieras som F4/80högLy6G–CD11bhögLy6Chög, ackumuleras också huvudsakligen i metastaserande lungcancer där det ger upphov till MAMs11. Baserat på deras egenskaper, kan de CD11bhögLy6Chög MAM stamceller representera M-MDSCs12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Freiner Bio-One</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Plystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (Flat bottom)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>165305</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>MCA497A647</td>
			<td>Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100730</td>
			<td>Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102111</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td>Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128026</td>
			<td>Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (100&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352360</td>
			<td>To smash the spleen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (40&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352340</td>
			<td>To filter the lung digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td>Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex Ready-to-Use</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1596-01</td>
			<td>Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4476</td>
			<td>Lenti viral particules encoding mKate2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Detector (fluorescence microscope)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM 2018A</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-927</td>
			<td>Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucView488</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10403</td>
			<td>Fluoregenic caspase-3 substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin Streptomycin for primary culture of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>212-12</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;: Nikon 10X objective (resolution 1.22 &#181;m) 
			&#160;: Green channel excitation: 440 - 480 nm 
			&#160;: Green channel emission: 504 - 544 nm 
			&#160;: Red channel excitation: 565-605 nm 
			&#160;: Red channel emission: 625 - 705 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells

Potentiering av tumör-dödande förmåga CD8+ T celler i tumörer, tillsammans med deras effektiva tumör infiltration, är en nyckelfaktor för framgångsrik immunterapier. Flera studier har visat att tumören infiltrerar myeloida celler (t.ex. myeloisk-derived suppressor-celler (MDSCs) och tumör-associerad makrofager (TAMs)) undertrycka cytotoxiciteten hos CD8+ T-celler i den tumör närmiljön och den inriktning dessa reglerande myeloida celler kan förbättra immunterapi. Här presenterar vi ett in vitro-test system för att utvärdera immun suppressiv effekterna av monocytic-MDSCs och TAMs på tumör-dödande förmåga CD8+ T celler. I detta syfte vi först odlade naiva mjälten CD8+ T celler med anti-CD3/CD28 aktiverande antikroppar i närvaro eller frånvaro av suppressor celler och samtidig odlade sedan föraktiverade T-cellerna med målet cancerceller i närvaro av en fluorogenic kaspas-3 substrat. Fluorescens från substratet i cancerceller upptäcktes av realtid fluorescensmikroskopi som en indikator på T-cell induceras tumör cell apoptos. I denna analys, kan vi identifiera ökningen av tumör cell apoptos av CD8+ T celler och dess bekämpande av före kultur med TAMs eller MDSCs. Denna funktionella analys är användbar för att undersöka CD8+ T cell undertryckande mekanismer av reglerande myeloida celler och identifierande druggable mål att övervinna det via high throughput screening.

Denna metod bygger på enkel samtidig kultur av målet cancerceller med effektor CD8+ T celler som har funnits före odlade med eller utan suppressor celler i närvaro av anti-CD3/CD28 aktiverande antikroppar. Den upptäcker CD8+ T cell-inducerad cancer cell apoptos över tid efter samtidig kultur, vilket möjliggör utvärdering av effekter av suppressor celler på cytotoxicitet av CD8+ T celler.
Normalt, cancerceller öka grön fluorescens i sina kärnor efter aktivering av en kärn-targeting kaspas biosensor när dessa celler gör kontakt med CD8+ T celler som är föraktiverade av antikroppar i avsaknad av suppressor celler ( Figur 3. Kompletterande Movie 1). Grön fluorescens från kaspas underlaget var detekterbar för minst 15 h efter apoptos inleddes. Några spontana apoptos av effektor CD8+ T celler observerades också över tiden även om dessa celler odlades i isolering (figur 4; Kompletterande filmen 2). Dock atomkärnor storlekar av CD8+ T cellerna är mindre än de av cancerceller och således apoptotiska 'effektor' celler kan uteslutas från apoptotiska 'target' blodkroppar med en storlek begränsning bild analysmetod (figur 2 och figur 4). Men vissa mål cancerceller visar en liten rundad form utan grön fluorescens, påverkar detta inte analysen eftersom dessa celler genomgår Mitos i stället för apoptos (kompletterande Movie 3), och därmed är undantagna från apoptotiska 'mål' blodkroppar av en röd/grön överlappning mask (kompletterande figur 2). Spontan apoptos av målet cancerceller finns ibland även i den enda kulturen (kompletterande Movie 3). Men samtidig kulturen i målet cancer celler med föraktiverade CD8+ T cells ökad tumör cell apoptos över nivåerna av spontana apoptos i monokultur av cancerceller (figur 4). Generellt när du använder en optimala förhållandet mellan mål cancerceller till effektor celler, kan en topp i antalet apoptotiska mål cancerceller observeras (figur 5A). Denna topp är mer distinkta när data uttrycks som den apoptotiska fraktionen av cell målpopulationen (figur 5B). I detta experiment nådde den basala apoptos av målet tumörceller 24 h (med apoptotiska bråkdel = 0,08), men CD8+ T cell-inducerad apoptos nådde en högsta nivå på 17 h (med apoptotiska bråkdel = 0,66).
Vidare fann vi att CD8+ T celler före inkuberas med MAMs eller M-MDSCs kunde göra kontakt med målet cancerceller men denna kontakt tycktes resultera i färre fall av cancer cell apoptos jämfört CD8+ T celler föraktiverade utan suppressor celler (figur 3 och figur 4. ” Kompletterande Movie 4 och kompletterande film 5). Även om CD8+ T celler före inkuberas med myeloida celler ibland inducerad cancer cell apoptos, fanns det också några spridning av mål cancerceller som inte har stimulerats för att genomgå apoptos under tiden den experiment (kompletterande film 6). Konsekvent med dessa fynd, peak fraktionen av apoptotiska cancerceller odlade med CD8+ T celler före inkuberas med myeloida celler (apoptotiska bråkdel = 0,38 på 23 h för MDSC-E och 0,25 på 20 h för MAM-E) var betydligt lägre än för cancerceller odlade med CD8+ T celler som inte fanns före ruvade med suppressor celler (figur 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig1.jpg"> Figur 1: ett system som visar experimentella förfarandet. Naiva mjälten CD8+ T celler odlas med anti-CD3/CD28 aktiverande antikroppar med eller utan metastaser-associerade makrofager (MAMs) eller monocytic-myeloisk-härledda suppressor celler (M-MDSCs). Efter 4 dagar, flytande CD8+ T celler samlas in och samtidig odlade med målet cancerceller i närvaro av fluorogenic kaspas-3 substrat. Apoptotiska cancerceller upptäcks under realtid fluorescensmikroskopi. Bilderna har förvärvats med en levande cell-imaging platform (se Tabell för material). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig2.jpg"> Figur 2: identifiering av apoptotiska målceller skiljer sig från apoptotiska effektor celler. Översta raden: bild förvärv i den röda kanalen möjliggör identifiering av mål cellkärnorna av target detection mask (rosa analys mask). Mellersta raden: bilder som förvärvats i den gröna kanalen indikerar apoptotiska effektor och målet celler. Minneskanalläge begränsade apoptos mask (teal analys mask; större än 80 µm2) tillåter enda apoptotiska effektor celler som ska uteslutas från analysen. Nedersta raden: komposit bilder kopplade röda och gröna kanalerna med fas kontrast bild (vänster) eller röd/grön överlappar mask (höger). Identifiering av samtidig lokaliserade, storlek-begränsad grön fluorescens med röd fluorescens (gula analys mask), tillåter mer korrekt upptäckt av apoptotiska mål atomkärnor (gula pilspets) genom att utesluta aggregat av apoptotiska effektor celler (vit pilspetsar). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig3.jpg"> Figur 3: Samspelet mellan CD8+ T celler och cancerceller. Stillbilder från representativa time-lapse filmer av E0771-LG_NLR målcellerna (T) Co odlade med effektor CD8+ T celler (E) på 4:1 effektor/målgrupper baserat. MDSC-E och MAM-E anger effektor celler före inkuberas med M-MDSCs och MAMs respektive. Sammansatta bilder (inklusive bilder från fas kontrast, röda och gröna kanalerna) visas. Pilspetsar spårar samma celler genom olika områden och tidpunkter. Gula pilspetsar: ett mål som associeras med effektorer och genomgår apoptos, vit pilspetsar: ett mål som associerar med effektorer men inte genomgår apoptos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig4.jpg"> Figur 4: Påvisande av apoptotiska cancerceller. Representativa områden utvinns ur time-lapse filmer vid 18 h efter imaging. Sammansatta bilder (vänster; fas kontrast, röda och gröna kanalerna) och bilder från red kanal utan (i mitten) eller med (höger) röd-gröna överlappning mask (gul) visas. Gula prickar i den högra kolumnen representerar apoptotiska cancerceller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig5.jpg"> Figur 5: CD8+ T cell-inducerad cancer cell apoptos. (A) antalet apoptotiska cancerceller odlade med effektor C8+ T-celler på olika effektor-målet förhållande (E:T). (B) apoptotiska bråkdel av cell målpopulationen. Uppgifterna är medel ± SD. genomsnittlig area under kurvan (AUC) visas också. Oparade t-test med Welchs korrigering användes för att analysera AUC. * P < 0,0001 jämfört med E:T = 0:1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig6.jpg"> Figur 6: Effekter av tumör-infiltrera myeloida celler på cytotoxicitet av CD8+ T celler. (A) antalet apoptotiska cancerceller (mål: T) odlade med C8+ T celler (effektor: E) på 4:1 E:T förhållande. CD8+ T celler odlades redan i frånvaro (svart cirkel) eller förekomst av monocytic-myeloisk-härledda suppressor celler (MDSC-E: blå cirkel) eller metastas-associerade makrofager (MAM-E: röd cirkel). Data är medel ± SD. (B) apoptotiska bråkdel av cell målpopulationen. Uppgifterna är medel ± SD. menar AUC visas också. Oparade t-test med Welchs korrigering användes för att analysera AUC. * P < 0,0001 jämfört T endast, #P < 0,0001 jämfört med E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig6large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande figur 1. Gating strategi att isolera suppressor celler från metastaserad lungcancer. (A) representativa dot tomter att isolera monocytic myeloisk-derived suppressor celler (M-MDSCs) och metastas-associerade makrofager (MAMs). Tröskeln till Ly6C nivå att skilja MAMs (Ly6Clåg) och M-MDSCs (Ly6Chög) är baserat på det av bosatta alveolära makrofager (RMAC). (B) renheten av de sorterade M-MDSCs (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Chög) och MAMs (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Clåg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS1_Rvd.pdf">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande figur 2. Representativa bilder av mitotiska målceller. Stillbilder från representativa time-lapse filmer av mål E0771-LG_NLR cell mono-kultur. Överst: sammansatta bilder inklusive bilder från fas kontrast, röda och gröna kanalerna. Botten: sammansatta bilder (röda och gröna kanalerna) med röd-gröna överlappning mask. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS2_Rvd.pdf">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande figur 3. Effekter av tumör-infiltrera myeloida celler om spridning av CD8+ T celler. (A) representativa histogram som visar utspädning av fluorescerande märkning med CFSE i CD8+ T celler. Naiva mjälten CD8+ T celler var isolerade som beskrivs i protokollet-3 och märkt med 5 µM av CFSE vid 37 ° C i 15 min. Märkt T-cellerna var odlade i närvaro av IL-2 och anti-CD3/CD28 aktivera antikroppar med eller utan myeloida celler som beskrivs i protokoll 4. Efter 4 dagar upptäcktes grön fluorescens i T-celler av flödescytometer. (B) Division index av CD8+ T celler beräknas som tidigare beskrivna17. Data är medel ± SEM. * P < 0,01 jämfört med kontroll, #P < 0,05 jämfört med αCD3/CD28 Ab. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS3_Rvd.pdf">vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande film 1. Film av figurerna 3 och 4. E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS1.mp4">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande film 2. Film av figurerna 3 och 4. Effektor (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS2.mp4">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande film 3. Film av figurerna 3 och 4. Mål (T). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS3.mp4">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande film 4. Film av figurerna 3 och 4. MDSC-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS4.mp4">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande film 5. Film av figurerna 3 och 4. MAM-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS5.mp4">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande film 6. Film av figurerna 3 och 4. MAM-E + T (spridning). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS6.mp4">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Vi beskriver här ett protokoll för att undersöka cytotoxiciteten hos föraktiverade CD8+ T celler mot cancerceller genom att upptäcka apoptotiska cancer celler via realtid mikroskopi. Detta protokoll kan undersöka mekanismerna bakom myeloida cell-inducerad T cell dämpning och utvärdera föreningar som syftar till att påfyllning av T celler via blockad av suppressiv myeloisk immunceller.

Realtid upptäcka i Vitro tumör Cell apoptos induceras av CD8+ T celler att studera suppressiv immunförsvaret av tumör-infiltrera myeloida celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Vårt protokoll bedömer effekterna av myeloisk-härledda suppressor celler och de tumör-associerade makrofager i T-cell-inducerad tumör cell apoptos. Vid sidan av undersökningen av de underliggande mekanismerna för potentiella terapeutiska interventioner. Detta protokoll utvärderar direkt T-cell-inducerad tumör cell apoptos med hög känslighet och möjliggör longitudinella analys och bildframställning av cell-till-cell interaktioner.Effekten av checkpoint hämmare är bäst tittade på av tumör-infiltrera myeloida celler i vissa tumörtyper. Denna teknik kan leda till identifiering av nya terapier för dessa tumörer. Denna metod kunde inte bara främja forskning om cancerimmunologi, utan skulle kunna ge insikt i immunbrist och autoimmuna sjukdomar.För aktivering och expansion av mjälte-isolerade CD8-positiva T-celler, första alikvoten en gånger 10 till den femte CD8-positiva T-celler i 50 mikroliter av E-DMEM i enskilda brunnar av en 96-väl U-bottenplatta. Därefter lägger du till en gång 10 till de femte suppressorcellerna i 50 mikroliter av E-DMEM, eller 50 mikroliter av E-DMEM ensam, i varje brunn av T-celler. Tillsätt sedan 50 mikroliter av nyberedda aktiveringsmedium och 50 mikroliter E-DMEM, med eller utan de testreagenser som är av intresse, till lämpliga brunnar.Och placera plattan i en 37-graders-Celsius och 5% koldioxid inkubator med 95% luftfuktighet i fyra dagar. För att ställa in en föraktiverad CD8-positiv T-cells mål cell samkultur, först lägga till 30 mikroliter av 1-till-100-utspädd tillväxtfaktor-reducerade lösliga källaren membran matris till lämpliga brunnar av en 96-väl platt-botten platta, lämplig för mikroskopi. Skaka plattan för att sprida matrisen jämnt, och placera plattan i cellkulturens inkubator i minst en timme.Medan plattan är jämvikt, förbereda målcellerna. Aspirera mediet, tvätta med PBS och tillsätt en milliliter på 05%Trypsin-EDTA i rumstemperatur i en minut. Tillsätt nio milliliter DMEM kompletteras med fetala nötkreatur serum genom skonsam pipettering, och överföra de dissociated cellerna i rör.Efter centrifugering av cellerna, resuspend pallen i 500 mikroliter av E-DMEM. Filtrera de återanvända cellerna genom en cellsil och räkna de levande cellerna. Justera sedan densiteten till fyra gånger 10 till de fjärde målcellerna per milliliter i färsk E-DMEM på is.Därefter pipettera de föraktiverade CD8-positiva T-cellerna några gånger för att återanvända cellerna till en enda cellupphängning och överföra de flytande T-cellerna till ett 1,5-milliliterrör per villkor. Samla eventuella återstående celler med 200 mikroliter PBS per brunn, överföra tvättar till lämpliga 1,5-milliliter rör, och centrifug. Aspirera mediet och tillsätt en milliliter E-DMEM till varje rör för centrifugeringen.Efter centrifugeringen, resuspend pelletsen i 100 mikroliter av färska E-DMEM per rör. Efter räkning, justera cellerna i varje rör till en densitet på 1,6 gånger 10 till den femte föraktiverade CD8-positiva T-celler per milliliter medium, och placera cellerna på is. När cellerna är klara, aspirera källaren membranmatris från varje brunn av 96-brunnsmikroskopiplattan, och tillsätt 50 mikroliter målceller till enskilda brunnar inom de inre 60 brunnarna av plattan med blandning.Tillsätt 25 mikroliter E-DMEM kompletterat med fyra gånger 10 till de tredje enheterna per milliliter av IL2, och 10-mikromolära fluorogena caspas-3 substrat till lämpliga brunnar. Lägg sedan till 25 mikroliter av föraktiverade CD8-positiva T-celler till lämpliga brunnar. Och slutligen, lägg till E-DMEM till lämpliga brunnar för att göra en total volym på upp till 100 mikroliter.Tillsätt 200 mikroliter PBS eller sterilt vatten i alla de tomma brunnarna. Skaka plattan, och låt plattan ligga på en plan yta i 10 minuter. För att avbilda cellerna, ställ in mikroskopet för att skaffa bilder i faskontrast.Samt fluorescenskanaler som lämpar sig för det kärnkraftsbegränsade fluorescerande proteinet, och de fluorogena aktiverade rörets 3-substratfluoroforer som används i experimentet. Ta sedan bilder av varje experimentell brunn i faskontrast och de två fluorescenskanalerna var en till tre timmar i minst 72 timmar. För att analysera de tagna bilderna, öppna en bild från en kontroll brunn som endast innehåller målceller och medium utan caspase-3 substrat i fluorescenskanalen som används för substratsignal.Observera om en olämplig fluorescenssignal avges av kärnorna. Om substratsignalen är uppenbar inom atomkärnorna, använd spektrala oblandande för att öka andelen substratsignal bort från kärnor signalen, tills substratet signalen försvinner. Därefter visa en kontroll väl som innehåller endast kärnor omärkta effektor celler i medium utan caspase-3 substrat i de två fluorescens kanaler individuellt.Observera om en signal avges av kärnorna. Om ingen signal är uppenbar i de enskilda kanalerna, är ingen spektral unmixing nödvändig. För att lösa de fluorescerande objekten i båda fluorescenskanalerna, använd en subtraktionsmetod för fluorescensbakgrund med relevanta parametrar för provet och lämpliga parametrar för kantdelning.Använd bilder av målcell monokultur för att fastställa parametrar för mål cell kärnfluorescens. Använd bilder av effektorcellmonokultur för att fastställa parametrar för substratinducerad apoptotisk kärnfluorescens. Använd bilder av samkultur för att verifiera eller förfina parametrar för substratinducerad apoptotisk kärnfluorescens i målceller.För att bestämma målkärnornas minsta storlek använder du bilder i kärnors signalkanal från brunnarna som endast innehåller målceller med caspase substrat. För att bestämma medelstorleken på apoptotiska effektorkärnor, använd bilder i substratsignalkanalen från brunnarna som endast innehåller effektorceller med caspase substrat. Om du vill räkna antalet fluorescensmålcellkärnor, ställ in en analysprocedur med hjälp av en lämplig minsta storleksbegränsning.Med hjälp av effektorcell monokultur bilder, ställa in en andra analys förfarande för att räkna antalet apoptotiska kärnor som är större än medelstorleken på apoptotiska effector atomkärnor. Sätt sedan upp en tredje analysprocedur för att räkna antalet apoptotiska målceller genom att räkna antalet kärnor där kärnan signal och storleksbegränsade substrat signal betydligt samlokalisera. Typiskt, cancerceller öka fluorescens signalen i sina kärnor efter aktivering av en nukleär-inriktning hölje biosensor när cellerna får kontakt med CD8-positiva T-celler pre-aktiveras av antikroppar i avsaknad av suppressor celler.Kärnan storlekar av CD8-positiva T-celler är mindre än cancerceller. Apoptotiska effektorceller kan alltså exkluderas från apoptotiska målcellantal genom en storleksbegränsningsbildanalysmetod. Även om vissa mål cancerceller uppvisar en liten rundad form utan substrat fluorescens, detta påverkar inte analysen.Eftersom dessa celler genomgår mitos snarare än apoptos och därmed är undantagna från apoptotiska mål cell räknas av en nukleär substrat signal överlappning mask. Co-kultur av mål cancerceller med pre-aktiverad CD8-positiva T-celler ökar tumörcell apoptos över nivåerna av spontana apoptos i cancer cell monokulturer. Generellt, när du använder ett optimalt förhållande av mål cancerceller till effektorceller, en topp i antalet apoptotiska mål cancerceller kan observeras.Denna topp blir mer distinkt när data uttrycks som den apoptotiska fraktionen av målcellpopulationen. Det viktigaste att komma ihåg när man försöker detta protokoll är att inrätta monokulturer av målceller och monokulturer av effektorceller för användning i utveckla analysen masker. Denna metod kan ge insikt i varaktigheten och frekvensen av T-cell till cancer cell interaktioner, och de villkor som är förknippade med genberoende cytotoxicitet i både mänskliga och musceller.Vi utvecklar för närvarande denna analys till en hög genomströmningsskärm med hjälp av mänskliga celler för att identifiera föreningar som hämmar myeloisk cellmedierad immunsuppression och därmed förbättra kontrollpunktshämmare effekt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Avbildning av bosatta CD8 T-lymfocyter i Human Lung tumör skivor med konfokalmikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Påvisande av mitokondrier membranet Potential att studera CLIC4 Knockdown-inducerad HN4 Cell apoptos In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolering protokoll mus monocyt-derived dendritiska celler och deras efterföljande In Vitro -aktivering med tumör immunkomplex

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Flöde flödescytometrisk påvisa nybildade Stem Cell-liknande bröstcancerceller efter apoptos återföring

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosal inokulering av skivepitelcancer celler i möss för tumör immun profilering och svar bedömning

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro tumör Cell återinsättning för förutsägande utvärdering av chimära Antigen receptorn T Cell antitumöreffekt funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analys för att studera interaktion med tumör-makrofage

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Använda humana inducerade pluripotenta stamceller för generering av tumör antigen-specifika T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av ortotopisk Pankreastumörer och ex vivo karakterisering av tumörinfiltrerande T-cell cytotoxicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Mätning i realtid läkemedelsrespons i organotypiska tumörvävnad skivor

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...