Name: real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells
Uploaded: 2019-01-29T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Bu eser hibe Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK) ve MRC (Bay N022556 1 / / (JWP, TK), UK) tarafından desteklenmiştir. NOC ve DDS Ulusal fenotipik eleme merkezi Phenomics bulma girişimi ve kanser araştırma İngiltere'de (NOC) destek kabul

<ol>
	<li>Barry, M., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocytes:+all+roads+lead+to+death.">Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death.</a> Nature Reviews in Immunology. 2, 401-409 (2002).</li><li>Durgeau, A., Virk, Y., Corgnac, S., Mami-Chouaib, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+targeting+CD8+T-cell+immunity+for+more+effective+cancer+immunotherapy.+Frontiers+in+Immunology.">Recent advances in targeting CD8 T-cell immunity for more effective cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology.</a> 9. , 14 (2018).</li><li>Tanaka, A., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+in+cancer+immunotherapy.">Regulatory T cells in cancer immunotherapy.</a> Cell Research. 27, 109-118 (2017).</li><li>Fleming, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+myeloid-derived+suppressor+cells+to+bypass+tumor-induced+immunosuppression.">Targeting myeloid-derived suppressor cells to bypass tumor-induced immunosuppression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 398 (2018).</li><li>Cassetta, L., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+targeting:+opening+new+possibilities+for+cancer+immunotherapy.">Macrophage targeting: opening new possibilities for cancer immunotherapy.</a> Immunology. 155, 285-293 (2018).</li><li>Chahroudi, A., Silvestri, G., Feinberg, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+fluorogenic+caspase+substrates.">Measuring T cell-mediated cytotoxicity using fluorogenic caspase substrates.</a> Methods. 31, 120-126 (2003).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Azimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+functional+assay+of+regulatory+T+Cells.">Identification, isolation, and functional assay of regulatory T Cells.</a> Immunological Investigation. 45, 584-602 (2016).</li><li>Bruger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+the+immunosuppressive+activity+of+MDSC:+assays,+problems+and+potential+solutions.">How to measure the immunosuppressive activity of MDSC: assays, problems and potential solutions.</a> Cancer Immunology Immunotherapy. , (2018).</li><li>Qian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+macrophage+population+mediates+metastatic+breast+cancer+cell+extravasation,+establishment+and+growth.">A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth.</a> PLoS One. 4, e6562 (2009).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+differentiate+to+immune+suppressive+precursors+of+metastasis-associated+macrophages+in+mouse+models+of+metastatic+breast+cancer.">Monocytes differentiate to immune suppressive precursors of metastasis-associated macrophages in mouse models of metastatic breast cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 2004 (2018).</li><li>Bronte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+myeloid-derived+suppressor+cell+nomenclature+and+characterization+standards.">Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards.</a> Nature Communications. 7, 12150 (2016).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2-induced+chemokine+cascade+promotes+breast+cancer+metastasis+by+enhancing+retention+of+metastasis-associated+macrophages.">CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages.</a> Journal of Experimental Medicine. 212, 1043-1059 (2015).</li><li>Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+from+subcutaneously+grown+E0771+medullary+breast+adenocarcinoma.">Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma.</a> AnticancerResearch. 25, 3905-3915 (2005).</li><li>Choppa, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+the+detection+of+Mycoplasma+fermentans,+M.+hominisandM.+penetransin+cell+cultures+and+blood+samples+of+patients+with+chronic+fatigue+syndrome.">Multiplex PCR for the detection of Mycoplasma fermentans, M. hominisandM. penetransin cell cultures and blood samples of patients with chronic fatigue syndrome.</a> Molecular and Cellular Probes. 12, 301-308 (1998).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current protocols in immunology. , (2001).</li><li>Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+colorimetric+cell+proliferation+assays+in+immune+cells.">A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells.</a> Cytotechnology. 68, 1489-1498 (2016).</li><li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived-suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system.">Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 9, 162-174 (2009).</li><li>Cassetta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+and+human+tumor-associated+macrophages.">Isolation of mouse and human tumor-associated macrophages.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 899. 899, 211-229 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu yöntem iki ayrı ortak kültür merdivenlerinde dayanmaktadır:+ T potansiyel bastırıcı hücrelerle hücreleri CD8 ortak kültür ve 'ön şartına' CD8 ortak kültür+ T hücreleri hedef tümör hücreleri (Şekil 1). İlk ortak kültür adım CD8 için oldukça benzer+ T hücre proliferasyon deneyleri bastırıcı hücreleri CD8 üzerindeki etkisini belirlemek için yaygın olarak kullanılan+ T hücre işlevi. Ancak, T hücre çoğalması her zaman onların sitotoksisite ile ilişkili değil. Örneğin, M-MDSCs veya analar bu ortak kültür bulduk CD8 azaltılmış yayılması yerine artış+ T hücrelerin CD3/CD28 varlığında antikor (ek şekil 3), aktive bunlar önceden CD8 şartına ise+ T hücreleri gösterdi azaltılmış sitotoksisite karşı hedef kanser hücrelerinin (resim 4 resim 5, Şekil 6). Bu sonuçlar fonksiyonel etkinlik, hedef kanser hücre apoptosis, bu CD8 tarafından sunulan kanıtladığı değerlendirilmesi önemini vurgulamak+ T hücre sitotoksisite tahlil.
Bu tahlil, biz o CD8 belirledik+ T hücreleri maksimum apoptosis E0771-LG fare meme tümör hücrelerinin (Şekil 5) teşvik için yaklaşık 15 h ortak kültür gerektirir. Bu gecikme efektör hücreler hedefleri ve eşlik eden bağışıklık synapse oluşumu gibi apoptotik sinyaller caspase-3 (takıma giren film 1 aktivasyonu tarafından ölçülen hedefleri de ikna etmek için gereken süre ile ilk temas arasında gecikme nedeniyle olabilir ). Biz aynı zamanda tespit apoptotik tümör hücrelerinin sayısı 24 h, T hücreleri tarafından hedefleri ortadan kaldırılması ve/veya ölü hücrelerden floresan sinyal kaybı nedeni olabilir sonra bir plato ulaşmıştır. Bir uygun zaman noktası tayini farklı koşullar arasında uygun karşılaştırmalar için önemli olduğundan en yüksek apoptosis zaman tanımlamak için bu yeteneği bu testin bir büyük avantaj sağlıyor. Örneğin, sitotoksisite+ T kontrol CD8 arasındaki farkı bizim durumumuzda hücreleri ve MDSC/MAM-eğitimli CD8+ T hücreleri, 15-18 h 72 h (Şekil 5) göre daha büyük ve böylece bir son nokta deney 72 h kuluçka dönemi'ni kullanarak yanıltıcı sonuçlar.
Bu yöntem ayrıca CD8 sınırlı sitotoksisite altta yatan mekanizma içine ilgili daha ayrıntılı bilgi sağlayan gerçek zamanlı efektör hedef hücre etkileşimin görselleştirme sağlar+ T hücreleri önceden bastırıcı hücreleri ile inkübe. Örneğin, biz bu gözlenen CD8+ T hücre M-MDSCs veya analar ile önceden inkübe karşılaştı ve hedef tümör hücreleri ile etkileşim ama her zaman apoptosis (Tamamlayıcı film 4, takıma giren film 5, takıma giren film 6) teşvik değil. Her ne kadar biz bu olay ölçmek değil, mümkün ve ölçmek ve karşılaştığında ve korelasyon apoptosis indüksiyon ile etkileşim zamanında oranı karşılaştırmak ilginç olurdu. Bu yöntem az sayıda hücreleri (örneğin, 1 x 103 hedef) ve 4 x 103 şey başına efektör hücrelerin gerektirir başka bir büyük avantaj sağlıyor. Aslında, bu iletişim kuralı daha fazla 384-şey plaka biçimini istenirse küçültülmüş. Bu nedenle, bu tahlil vitro test değerli hücreleri kullanarak türetilmiş içinde vivo veya ex vivo örnekleri gibi burada hücre sayıları sınırlı yüksek aktarım tarama ve deneyleri için uygun olmasıdır.
Öte yandan, bir sınırlama geçerli testin ölü efektör hücrelerde bazı koşullar önemli sayıda varlığıdır. Apoptozis hedef kanser hücrelerinin efektör CD8 bundan ayırt etme doğruluğu artırmak için+ T hücreleri, hedef hücreleri etiketlenir çekirdekleri ve (yani efektör hücreleri hariç) boyutu kısıtlamasını bu veri analizi için uygulanan bir çekirdek tahlil (Şekil 2). Ancak, bazı durumlarda nerede sonuçları yıkmak sigara apoptotik hedef kanser hücreleri, bindirme toplamları (yeşil) apoptotik CD8+ T hücreleri vardır. Bu sınırlama tarafından yeterli sayıda efektör hücrelerin hazır olduğunu varsayarsak hedef tümör hücreleri ile birlikte kültür efektör hücreler öncesinde bir ölü hücre kaldırma sütun kullanımı hafifletilmiş. Daha karmaşık mikroskobu sistemleriyle de efektör CD8 etiketleme tarafından yanlış olumlu sinyal azaltmak mümkün olabilir+ T hücreleri hedef hücre çekirdeği ve fluorogenic caspase-3 maddeyi ayrı bir fluorophore ile.
Şimdiye kadar bu iletişim kuralını CD8 antijen spesifik olmayan aktivasyonu araştırmak için kullanılan+ T hücreleri. Her ne kadar MDSCs ve tümör microenvironment TAMs T hücre fonksiyonları antijen spesifik olmayan mekanizmalar yoluyla bastırmak, periferik lenfoid dokulara MDSCs T hücre antijen belirli şekilde18yanıt-e doğru bastırmak. + T hücreleri OT-1 den böyle hücre tiplerinin bağışıklık baskılayıcı işlevleri CD8 kullanarak bir tüp bebek yayılması tahlil araştırmak için transgenik fareler yaygın olarak kullanılan. Bu tahlil (ovalbumin (OVA) belirli T hücre reseptör ifade) OT-1 T hücreleri ile bastırıcı MDSCs OVA peptidler, huzurunda ilk kültür bizim sitotoksisite tahlil için geçerli olduğu ortak kültürlü (i.e., harekete geçirmek-in T hücreleri varlığı ya da yokluğu bastırıcılarının). Hedef kanser hücrelerinin antijen spesifik kanser hücresi öldürmek OT-1 T hücreleri tarafından teşvik edebilirsiniz OVA ifade etmek için işlemek için uygulanabilirdir. Bu nedenle, tahlil Ayrıca antijen spesifik T Hücre aktivasyonu MAM/MDSC-aracılı bastırılması incelenmesi sağlayacaktır. İnsan hücreleri, insan CD3 ve CD28 karşı harekete geçirmek antikor ticari mevcuttur ve insan TAMs klinik örneklerinden izole etmek için bir protokol kurulan19oldu araştırmak için tahlil uygulamak mümkündür.
Toplu olarak, bu tahlil oldukça çok yönlü ve sitotoksisite diğer bağışıklık hücre tiplerinin incelemek için kullanılabilir. Şu anda, bizim labs, antijen-bağımlı hücre sitotoksisite çeşitli koşullar altında incelemek için genişletilmekte ve aynı zamanda yüksek üretilen iş için geliştirilen eleme.

Bu bilinen bu CD8+ T hücreleri ne zaman onlar onların tam sitotoksisite sarfetmek tümör hücreleri ortadan kaldırabilirsiniz. T hücre reseptör (TCR), CD8 aktivasyonu sonra+ T hücreleri çoğalırlar ve sitotoksik efektör hücrelere ayırt etmek. Genişletilmiş ve aktif CD8+ T hücre sitotoksik tanecikler, perforin ve granzymes, hedef hücrelere aktarılır ve caspase-3 apoptosis1aracılı gibi çeşitli litik yollar başlatmak da dahil olmak üzere salgılar. CD8+ T hücreleri da teşvik tümör hücre apoptosis reseptörleri tümör nekrozis faktör-α (TNF-α), için gibi hedef hücrenin üzerinde reseptörleri aktive ederek ligand (FasL) veya apoptosis indükleyici ligand (iz) TNF ile ilgili ilk apoptosis sinyal. Ayrıca, aktif CD8+ T hücreleri salgılar interferon-γ (IFN-γ) tümör hücre çoğalması bastırmak ve tümör hücreleri CD8 için duyarlılığını artırmak+ T hücreleri ile up-regülasyon FasL reseptör1. Potansiyel CD8 için verilen+ T tümör öldürme yeteneği, onların sitotoksisite (örneğin, denetim noktası inhibitörleri, kanser aşısı ve T hücreleri ifade chimeric antijen reseptör (araba) evlat edinen transferi) artırmak için çeşitli stratejiler kurulan ve kanser2belirli türleri üzerinde gösterilen önemli terapötik etkileri. Ancak, kanıt biriken tümör infiltre bağışıklık hücreleri düzenleyici T hücreleri gibi miyeloid kaynaklı bastırıcı (MDSCs) hücreleri ve makrofajlar (TAMs) tümör ilişkili CD8 bastırmak öneriyor+ T hücre fonksiyonları ve etkinliğini sınırlamak in immunotherapies3,4,5. Böyle immunotherapies geliştirmek için nasıl bağışıklık baskılayıcı hücreleri sınırı CD8 anlaşılması önemlidir+ T hücre sitotoksisite. CD8 tanımlaması+ T hücre bastırma mekanizmaları yanı sıra, üstesinden gelmek için druggable hedefleri geliştirme ve tüp bebek deneyleri kullanımını gerektirir.
CD8 ölçme altın standart yöntem+ T hücre sitotoksisite olduğunu krom yayın tahlil hangi hedef radyoaktif sonda (51Cr), sürümünden bu hücreleri CD8 tarafından lysed+ T hücreleri, kararlı6' dır. Ancak, bu tahlil nispeten düşük duyarlılık, yüksek arka plan, erken apoptotik olaylar, tehlikeli atık sorunları ve otomatik sıvı işleme ve desteklemek için algılama ile sınırlı uyumluluk algılamak için yetersizlik de dahil olmak üzere çeşitli sakıncaları vardır daha yüksek üretilen iş uygulamaları. Başka bir ortak akış sitometrik analizleri apoptosis hedef tümör hücrelerinin V7bağlama annexin tarafından tespit yöntemidir. Bu tahlil propidium iyodür (PI) veya 7-aminoactinomycin D (7-AAD) ve ek olarak7 hedef hücrelerde apoptosis CD107a veya CD69 ifade tarafından belirtilen efektör Hücre aktivasyonu kullanarak hedef hücre ölümü gibi diğer parametreleri algılamak mümkündür . Ancak, bu tahlil bastırıcı hücreleri krom yayın tahlil için karşılaştırıldığında çok sayıda gerektirir. Ayrıca dekolmanı ve yükünün yapisan hedef hücre gerektirir ve bu sonuçları önyargı. Nitekim, krom yayın tahlil veya akış sitometrik tahlil genellikle T hücre fonksiyonları üzerinde baskılayıcı hücre etkileri araştırmak için kullanılmaz. Bunun yerine, T-hücre çoğalması T hücreleri önceden yüklenmiş seyreltme floresan boya (örneğin, CFSE), tarafından belirtilen ölçü sık CD8 inhibisyonu değerlendirmek için kullanılır+ T hücre işlevi bastırıcı hücreleri tarafından. Algılama kültürlü T hücrelerinden IFN γ üretimin T hücre harekete geçirmek8,9bastırıcı hücreleri etkilerini değerlendirmek için başka bir standart yöntemdir. Ancak, bu deneyleri sonuçları mutlaka CD8 yeteneği öldürme hedef hücre aralarındaki ilişkileri belirlemektir değil+ T hücreleri.
Burada CD8 sitotoksisite bastırıcı hücreleri, özellikle metastatik tümörler, makrofajlar etkilerini değerlendirmek için alternatif bir işlevsel tahlil mevcut+ T hücreleri. Bu yöntem CD8 sitotoksisite belirler+ T hücreleri ile ya da ezelî anti-CD3/CD28 aktive antikorlar, huzurunda bastırıcı hücreler tümör hücre apoptosis, tespit ederek önceden kültürlü, floresan bir fluorogenic caspase-3 belirttiği substrat6'yı kullanan hızlandırılmış mikroskobu (Şekil 1) otomatik. Bu iletişim kuralı diğer yöntemlerine göre birçok avantajı vardır; Bu az sayıda hücre gerektirir, yapisan tümör hücre ölümü tespiti ile yüksek hassasiyet sağlar, gerçek zamanlı efektör hedef etkileşim olabilir görüntü ve yüksek işlem hacmi tarama için mükellef.
Bu protokol için metastaz ilişkili makrofajlar (analar) ve onların yaratıcı Monositik-farelerde metastatik tümörler izole MDSCs (M-MDSCs) bastırıcı hücreler kullanılır. Metastatik meme kanseri fare modellerinde makrofajlar farklı nüfusu ile karakterize F4/80yüksekLy6G-CD11byüksekLy6Cdüşük metastatik tümörler içeren akciğer biriken. Bu makrofaj nüfusun seyrek olarak normal akciğer bulmuş ve böylece metastaz ilişkili makrofajlar (analar)10aramış. Bu fare modellerinde, başka myeloid hücre tanımlanan nüfus, F4/80yüksekLy6G-CD11byüksekLy6Cyüksek, ayrıca biriken ağırlıklı olarak artış nerede verir analar11' e metastatik akciğer. Onların özelliklerine göre M-MDSCs12CD11byüksekLy6Cyüksek MAM progenitör hücre temsil edebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Freiner Bio-One</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Plystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (Flat bottom)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>165305</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>MCA497A647</td>
			<td>Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100730</td>
			<td>Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102111</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td>Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128026</td>
			<td>Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (100&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352360</td>
			<td>To smash the spleen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (40&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352340</td>
			<td>To filter the lung digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td>Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex Ready-to-Use</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1596-01</td>
			<td>Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4476</td>
			<td>Lenti viral particules encoding mKate2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Detector (fluorescence microscope)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM 2018A</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-927</td>
			<td>Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucView488</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10403</td>
			<td>Fluoregenic caspase-3 substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin Streptomycin for primary culture of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>212-12</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;: Nikon 10X objective (resolution 1.22 &#181;m) 
			&#160;: Green channel excitation: 440 - 480 nm 
			&#160;: Green channel emission: 504 - 544 nm 
			&#160;: Red channel excitation: 565-605 nm 
			&#160;: Red channel emission: 625 - 705 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells

CD8 tümör-öldürme yeteneğini kullanılmasının muhtemelen+ T hücre tümörleri, onların verimli tümör infiltrasyonu ile birlikte başarılı immunotherapies temel unsur olduğunu. Çeşitli çalışmalarda tümör infiltre myeloid hücrelerin (örneğin, elde edilen miyeloid bastırıcı hücreleri (MDSCs) ve tümör ilişkili makrofajlar (TAMs)) CD8 sitotoksisite bastırmak belirttiler+ T hücreleri tümör microenvironment ve bu hedefleme Bu düzenleyici myeloid hücrelerin immunotherapies artırabilirsiniz. Burada, bir tüp bebek tahlil sistem bağışıklık baskılayıcı etkileri Monositik MDSCs ve TAMs CD8 tümör-öldürme yeteneğini değerlendirmek için mevcut+ T hücreleri. Bu amaçla, ilk saf kültürlü dalak CD8+ T hücreleri ile anti-CD3/CD28 aktive antikorlar bastırıcı hücreleri içinde ve hedef kanser hücrelerinin bir fluorogenic huzurunda pre-harekete geçirmek T hücrelerle birlikte kültürlü caspase-3 alt katman. Floresans kanser hücrelerinin içinde belgili tanımlık substrate üzerinden gerçek zamanlı floresans mikroskobu tarafından indüklenen T hücreli tümör hücre apoptosis bir göstergesi olarak algılandı. Bu tahlil başarıyla tümör hücre apoptosis CD8 tarafından artış algılayabilir+ T hücreleri ve onun bastırma TAMs veya MDSCs öncesi kültür tarafından. Bu işlev tahlil CD8 soruşturma için yararlıdır+ T hücre bastırma mekanizmaları düzenleyici myeloid hücrelerin ve yüksek işlem hacmi tarama yolu ile üstesinden gelmek için tanımlayıcı druggable hedefler.

Bu yöntem hedef kanser hücrelerinin efektör CD8 ile+ T basit ortak kültür temel ile ya da ezelî anti-CD3/CD28 aktive antikorların varlığında bastırıcı hücreleri önceden kültürlü hücreleri. CD8 algıladığı+ T hücre kaynaklı kanser hücre apoptosis ortak kültür takip, böylece bastırıcı hücreleri CD8 sitotoksisite üzerine etkileri değerlendirilmesi etkinleştirme zamanla+ T hücreleri.
Genellikle, kendi çekirdek içinde yeşil floresans kanser hücrelerini artırmak bir nükleer hedefleme caspase biyoalgılayıcı aktivasyonu bu hücreleri CD8 ile temas ne zaman+ T bu hücreleri antikorları bastırıcı hücre (yokluğunda tarafından önceden etkinleştirilmiştir Şekil 3; Takıma giren film 1). Apoptozis başlatıldı sonra yeşil floresan caspase substrat üzerinden en az 15 h için algılanabilir. Bazı spontan apoptosis+ T, efektör CD8 hücreleri-da gözlenen zaman içinde bile bu hücreler yalıtım (Şekil 4; kültürlü Takıma giren film 2). Ancak, çekirdek boyutları CD8+ T bu kanser hücrelerinin daha küçük hücrelerdir ve böylece apoptotik 'effektör' hücre 'hedef' hücre sayar apoptotik bir boyutu sınırlama görüntü analiz yöntemi tarafından (Şekil 2 ve Şekil 4) dışlanabilir. Bazı hedef kanser hücrelerinin yeşil floresans bulunmayan küçük bir yuvarlak şekli göstermesine rağmen bu hücreler mitoz apoptosis (Tamamlayıcı film 3) yerine geçiyor ve böylece apoptotik 'hedef' hariç tutulur gibi bu analiz etkilemez hücre bir kırmızı/yeşil örtüşme maskesi (ek Şekil 2) sayar. Hedef kanser hücrelerinin spontan apoptosis zaman zaman bile tek kültür (Tamamlayıcı film 3) bulunur. Ancak, hedef kanser ortak kültürü ile pre-harekete geçirmek CD8 hücreleri+ T hücreleri artan tümör hücre apoptosis Monokültür (Şekil 4) kanser hücrelerinin içinde spontan apoptosis seviyelerinin üzerinde. Genel olarak, hedef kanser hücrelerinin en uygun bir oran efektör hücrelere kullanırken, apoptotik hedef kanser hücrelerinin sayısında bir tepe (Şekil 5A) görülebilir. Verileri hedef hücre nüfus (5B rakam) apoptotik kesir olarak ifade edilir zaman daha farklı bir tepedir. Bu deneyde hedef tümör hücrelerinin bazal apoptosis 24 h doruğa (apoptotik kesir ile 0,08 =), CD8 ama+ T hücre kaynaklı apoptosis 17 h maksimum seviyeye ulaştı (0.66 apoptotik kesir ile =).
Daha fazla bulduk CD8+ T hücreleri analar veya M-MDSCs ile önceden inkübe yapabilirdiniz iletişim hedef kanseri hücreleri ama bu kişinin kanser hücre apoptosis CD8 için karşılaştırıldığında, daha az örnekleri neden gibiydi+ T hücreleri pre-harekete geçirmek olmadan bastırıcı hücreleri (Şekil 3 ve Şekil 4; Takıma giren film 4 ve takıma giren film 5). Her ne kadar CD8+ T hücreleri ile myeloid hücrelerin bazen önceden inkübe indüklenen kanser hücre apoptosis, ayrıca bazı saat süresince apoptosis geçmesi üzerinde teşvik değil hedef kanser hücrelerinin çoğalması yapıldı. deney (Tamamlayıcı film 6). Bu bulgular ile tutarlı, apoptotik kanser hücrelerinin tepe kısmını kültürlü CD8 ile+ T hücreleri önceden myeloid hücrelerin ile inkübe (apoptotik kesir MAM-E MDSC-E ve 0,25 20 h 0,38 23 h =) önemli ölçüde kanser hücrelerinin daha düşük olduğunu kültürlü CD8 ile+ T hücreleri bastırıcı hücreleri (Şekil 6) ile önceden inkübe edildi değil.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig1.jpg"> Şekil 1: deneysel işlemin gösterilen bir düzeni. Saf dalak CD8+ T hücreleri kültürlü anti-CD3/CD28 aktive antikorlar ile ya da ezelî metastaz ilişkili makrofajlar (analar) ile veya Monositik miyeloid-kaynaklı bastırıcı hücreleri (M-MDSCs). CD8 yüzen 4 gün sonra+ T hücreleri toplanan ve hedef kanser hücrelerinin fluorogenic caspase-3 substrat huzurunda ile birlikte kültürlü. Apoptotik kanser hücrelerinin gerçek zamanlı floresans mikroskobu altında tespit edilir. Gösterilen görüntüleri canlı bir hücrenin görüntüleme platformu kullanarak elde ( Tablo malzemeleriçin başvurmak). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig2.jpg"> Şekil 2: apoptotik hedef hücreleri apoptotik efektör hücreleri farklı tanımlaması. Üst satır: resim alma kırmızı kanal hedef algılama maskesi (pembe analiz maske) tarafından hedef hücre çekirdeği tanımlamasını sağlar. Orta sıra: yeşil kanalda alınan görüntüleri apoptotik efektör ve hedef hücreleri gösterir. BoyShiley kısıtlı apoptosis maskesi (deniz mavisi analiz maske; 80 µm2den büyük) tek apoptotik analizinden dışlanacak efektör hücreleri sağlar. Alt satırı: kompozit görüntü birleştirilmiş kırmızı ve yeşil kanal faz kontrast resim (sol) veya kırmızı/yeşil ile üst üste maskesi (sağda). Kırmızı floresans (sarı analiz maskesi) ile birlikte lokalize, boyutu sınırlı yeşil floresans tanımlaması apoptotik efektör hücresi (beyaz hariç tutarak hedef çekirdeklerin (sarı ok ucu) apoptotik daha doğru algılanmasını sağlar ok başları). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig3.jpg"> Şekil 3: Etkileşim arasında CD8+ T hücreleri ve kanser hücreleri. Hücrelerinin efektör CD8 ile birlikte kültürlü hedef E0771-LG_NLR (T) temsilcisi hızlandırılmış film fotoğraf+ T hücreleri (E) 4:1 efektör/hedef oranında. MDSC-E ve MAM-E efektör hücreleri M-MDSCs ve analar ile sırasıyla önceden inkübe gösterir. Bileşik görüntüler (faz kontrast, kırmızı ve yeşil kanallarını görüntüler de dahil olmak üzere) gösterilir. Ok uçları farklı alan ve zaman puan ile aynı hücreleri takip ediyor. Sarı ok uçları: effectors ile ilişkilendirir ve apoptosis, beyaz ok uçları geçer bir hedef: associates ile effectors ancak apoptosis geçmesi değil bir hedef. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig4.jpg"> Şekil 4: algılama apoptotik kanser hücrelerinin. 18 h hızlandırılmış film görüntüleme sonra çıkarılan temsilcisi alanları. Bileşik görüntüler (sol; faz kontrast, kırmızı ve yeşil kanalları) ve imge--dan kırmızı kanal (orta) veya (sağ) kırmızı/yeşil çakışma maskesi (sarı) gösterilir. Sağ sütunda sarı nokta apoptotik kanser hücreleri temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig5.jpg"> Şekil 5: CD8+ T hücre kaynaklı kanser hücre apoptosis. (A)sayısı apoptotik kanser hücrelerinin efektör ile C8 kültürlü+ T hücreleri hedef oranı (E:T) farklı efektör adlı. hedef hücre nüfusun (B) apoptotik kısmı. Veri vardır anlamına gelir ± SD ortalama alanı (AUC) eğri altındaki da görüntülenir. Unpaired t-test Welch düzeltme AUC analiz etmek için kullanıldı. * P < E:T için karşılaştırıldığında 0,0001 = 0:1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig6.jpg"> Şekil 6: Etkileri myeloid hücrelerin tümör infiltre sitotoksisite CD8+ T hücreleri. Apoptotik kanser hücre sayısı(a)(hedef: T) ile C8 kültürlü+ T hücreleri (Efektör: E) 4:1 E:T oranı. CD8+ T hücreleri önceden kültürlü yokluğu (siyah daire) veya Monositik miyeloid-kaynaklı bastırıcı hücrelerin varlığı (MDSC-E: mavi daire) ya da metastaz ilişkili makrofajlar (MAM-E: kırmızı daire). Veri anlamına gelir çoğu hedef hücre nüfusun ± SD (B) apoptotik kısmı. Veri vardır anlamına gelir ± SD AUC demek de gösterilir. Unpaired t-test Welch düzeltme AUC analiz etmek için kullanıldı. * P < 0,0001 karşılaştırıldığında T için yalnızca, #P < E + T. için karşılaştırıldığında 0,0001 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ek resim 1. Metastatik akciğer hücrelerden bastırıcı yalıtmak için strateji geçişi. (A)temsilcisi nokta çizer Monositik miyeloid kaynaklı bastırıcı hücreleri (M-MDSCs) ve metastaz ilişkili makrofajlar (analar) izole etmek. Analar (Ly6Cdüşük) ve M-MDSCs (Ly6Cyüksek) ayırt etmek için Ly6C düzeyi eşik buna ikamet alveoler makrofajlar (RMAC) dayanıyor. Sıralanmış M-MDSCs (B) saflık (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6Cyüksek) ve analar (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6Cdüşük). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS1_Rvd.pdf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek Şekil 2. Mitotik hedef hücre temsilcisi görüntüler. Hedef E0771 LG_NLR hücre mono-kültür temsilcisi hızlandırılmış film fotoğraf. Top: bileşik görüntüler faz kontrast, kırmızı ve yeşil kanallarını görüntüler de dahil olmak üzere. Alt: bileşik görüntüler (kırmızı ve yeşil kanal) kırmızı/yeşil örtüşme maskesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS2_Rvd.pdf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek şekil 3. CD8 yayılması üzerine myeloid hücrelerin tümör infiltre etkileri+ T hücrelerinin. (A)temsilcisi histogramlar CD8 CFSE ile floresan etiketleme, seyreltme gösterilen+ T hücreleri. Saf dalak CD8+ T hücreleri Protokolü-3'te açıklandığı gibi izole ve CFSE 5 mikron 15dk için 37 ° C'de etiketlenir. Etiketli T hücreleri IL-2 huzurunda kültürlü ve Show anti-CD3/CD28 Protokolü 4'te açıklandığı gibi antikorlar ile ya da ezelî myeloid hücrelerin aktive edildi. 4 gün sonra T hücrelerinde yeşil floresans akış sitometresi tarafından algılandı. (B) bölümü Dizin CD8+ T hücre yukarıda açıklanan17olarak hesaplanır. Veri anlamına gelir ± SEM vardır * P < 0,01 karşılaştırıldığında denetlemek için #P < αCD3/CD28 için AB ile karşılaştırıldığında 0,05 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS3_Rvd.pdf">bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Takıma giren film 1. Şekil 3 ve 4 film; E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS1.mp4">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Takıma giren film 2. Şekil 3 ve 4 film; Efektör (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS2.mp4">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Takıma giren film 3. Şekil 3 ve 4 film; Hedef (T). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS3.mp4">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Takıma giren film 4. Şekil 3 ve 4 film; MDSC-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS4.mp4">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Takıma giren film 5. Şekil 3 ve 4 film; MAM-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS5.mp4">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Takıma giren film 6. Şekil 3 ve 4 film; MAM-E + T (yayılması). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS6.mp4">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Biz burada pre-harekete geçirmek CD8 sitotoksisite araştırmak için bir protokol tarif+ T hücreleri kanser hücrelerine karşı apoptotik kanser hücreleri aracılığıyla gerçek zamanlı mikroskobu tespit ederek. Bu protokol mekanizmaları myeloid hücre kaynaklı T hücre bastırma arkasında araştırmak ve T hücreleri ile abluka bağışıklık baskılayıcı myeloid hücre yenileyici amaçlı bileşikler değerlendirmek.

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Protokolümüz miyeloid kaynaklı baskılayıcı hücrelerin ve T hücrekaynaklı tümör hücreli apoptozdaki tümörilişkili makrofajların etkilerini değerlendirmez. Potansiyel terapötik müdahalelerin altında yatan mekanizmaların araştırılmasının yanı sıra. Bu protokol t-hücre kaynaklı tümör hücreli apoptozu yüksek duyarlılıkla doğrudan değerlendirir ve hücreden hücreye etkileşimlerin uzunlamasına analizini ve görüntülenmesini sağlar.Kontrol noktası inhibitörü etkinliği en iyi bazı tümör tiplerinde tümör-infiltrasyon miyeloid hücreler tarafından bakılır. Bu teknik bu tümörler için yeni tedavilerin belirlenmesine yol açabilir. Bu yöntem sadece kanser immünoloji araştırma ilerlemek olamazdı, ama potansiyel olarak da immün yetmezlik ve otoimmün hastalıklar içine fikir sağlayabilir.Dalak izole CD8-pozitif T-hücrelerinin aktivasyonu ve genişlemesi için, ilk olarak 10 kez beşinci CD8-pozitif T-hücrelerine 50 mikrolitre E-DMEM'de 96-iyi u-alt plakanın tek tek kuyularına yerleştirin. Daha sonra, 50 mikrolitre E-DMEM'deki beşinci baskılayıcı hücrelere 10 kez veya tek başına 50 mikrolitre E-DMEM'i T-hücrelerinin her kuyusuna ekleyin. Daha sonra 50 mikrolitre taze hazırlanmış aktivasyon ortamı ve 50 mikrolitre E-DMEM, test reaktifleri ile veya faizsiz, uygun kuyulara ekleyin.Ve plakayı 4 gün boyunca %95 nem oranıyla 37 derecelik ve %5 karbondioksit kuvöze yerleştirin. Önceden aktive edilmiş CD8-pozitif T-hücre hedef hücre ortak kültürünü kurmak için, ilk olarak mikroskopi için uygun 96 kuyulu düz alt plakanın uygun kuyularına 1 ila 100 seyreltilmiş büyüme faktörü azaltılmış çözünür baza membran matrisinin 30 mikrolitresini ekleyin. Matrisi eşit olarak yaymak için plakayı sallayın ve plakayı en az bir saat hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.Plaka dengelenirken, hedef hücreleri hazırlayın. Orta aspire, PBS ile yıkayın ve bir dakika oda sıcaklığında% 05 Tripsin-EDTA bir mililitre ekleyin. Hafif pipetleme ile fetal sığır serumu ile desteklenen dokuz mililitre DMEM ekleyin ve ayrık hücreleri tüplere aktarın.Hücreleri santrifüj ettikten sonra 500 mikrolitre E-DMEM'deki paleti yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan hücreleri bir hücre süzgecinden geçirin ve canlı hücreleri sayın. Daha sonra yoğunluğu dört kez 10'a, buz üzerindeki taze E-DMEM'de mililitre başına dördüncü hedef hücrelere ayarlayın.Daha sonra, pipet önceden aktive CD8-pozitif T-hücreleri birkaç kez tek bir hücre süspansiyon içine hücreleri yeniden askıya almak ve durum başına bir 1.5 mililitrelik tüp içine yüzen T hücreleri aktarın. Kuyu başına 200 mikrolitre PBS ile kalan hücreleri toplamak, uygun 1.5 mililitre tüpler içine yıkıntı lar aktarın ve santrifüj. Orta aspire ve santrifüj için her tüp e-DMEM bir mililitre ekleyin.Santrifüjden sonra, tüp başına 100 mikrolitre taze E-DMEM peletleri yeniden askıya alın. Saydıktan sonra, her tüpteki hücreleri mililitre başına beşinci önceden aktive edilmiş CD8-pozitif T-hücrelerine 1,6 kat 10'luk bir yoğunluğa ayarlayın ve hücreleri buza yerleştirin. Hücreler hazır olduğunda, 96-iyi mikroskopplaka her kuyudan bodrum membran matris aspire ve karıştırma ile plaka iç 60 kuyu içinde bireysel kuyulara hedef hücrelerin in 50 mikrolitre ekleyin.Il2 mililitre başına üçüncü ünitelere dört kez 10 ile takviye e-DMEM 25 mikrolitre ekleyin ve uygun kuyulara 10 mikromolar florojenik kaspaz-3 substrat ekleyin. Daha sonra uygun kuyulara önceden aktive edilmiş CD8 pozitif T-hücrelerinin 25 mikrolitreekleyin. Ve son olarak, 100 mikrolitreye kadar toplam hacim yapmak için uygun kuyulara E-DMEM ekleyin.Tüm boş kuyulara 200 mikrolitre PBS veya steril su ekleyin. Plakayı sallayın ve plakayı düz bir yüzeyde 10 dakika bekletin. Hücreleri görüntülemek için, faz kontrastında görüntü elde etmek için mikroskobu ayarlayın.Nükleer sınırlı floresan proteiniçin uygun floresan kanallarının yanı sıra deneyde kullanılan florojenik aktive kaspaz-3 substrat floroporesi de vardır. Daha sonra faz kontrastı ve iki floresan kanalı en az 72 saat boyunca her bir ila üç saat boyunca her deneysel kuyunun görüntülerini yakalayın. Yakalanan görüntüleri analiz etmek için, substrat sinyali için kullanılan floresan kanalında caspase-3 substratı olmayan sadece hedef hücreleri ve orta içeren bir kontrol kuyunundan bir görüntü açın.Çekirdekler tarafından uygunsuz bir floresan sinyalinin yayılıp yayılmadığını gözlemleyin. Eğer substrat sinyali çekirdekler içinde görünürse, substrat sinyali kaybolana kadar çekirdek sinyalinden çıkarılan substrat sinyalinin yüzdesini artırmak için spektral unmixing kullanın. Daha sonra, iki floresan kanalında tek tek kaspaz-3 substratı olmayan orta ortamda yalnızca çekirdekleri etiketlenmemiş efektör hücreleri içeren bir kontrol kuyusu görüntüleyin.Bir sinyalin çekirdekler tarafından yayılıp yayılmadığını gözlemleyin. Tek tek kanallarda sinyal yoksa, spektral karıştırma gerekmez. Floresan nesneleri her iki floresan kanaldaki çözmek için, numune için ilgili parametreleri ve kenar bölme için uygun parametreleri içeren bir floresan arka plan çıkarma yöntemi kullanın.Hedef hücre nükleer floresan için parametreleroluşturmak için hedef hücre monokültür görüntüleri kullanın. Substrat kaynaklı apoptotik nükleer floresan için parametreler oluşturmak için efektör hücre monokültür görüntülerini kullanın. Hedef hücrelerde substrat kaynaklı apoptotik nükleer floresan parametreleri doğrulamak veya iyileştirmek için eş kültür görüntülerini kullanın.Hedef çekirdeklerin minimum boyutunu belirlemek için, sadece caspase substratı olan hedef hücreleri içeren kuyulardan gelen çekirdek sinyal kanalındaki görüntüleri kullanın. Apoptotik efektör çekirdeklerin ortalama boyutunu belirlemek için, sadece caspase substratlı efektör hücreleri içeren kuyulardan substrat sinyal kanalındaki görüntüleri kullanın. Floresan hedef hücre çekirdeklerinin sayısını saymak için, uygun bir minimum boyut kısıtlaması kullanarak bir analiz prosedürü ayarlayın.Efektör hücre monokültür görüntüleri kullanarak, apoptotik efektör çekirdeklerinin ortalama boyutundan daha büyük olan apoptotik çekirdeklerin sayısını saymak için ikinci bir analiz prosedürü ayarlayın. Daha sonra, çekirdek sinyalinin ve boyut kısıtlamalı substrat sinyalinin önemli ölçüde birlikte lokalize olduğu çekirdek sayısını sayarak apoptotik hedef hücrelerin sayısını saymak için üçüncü bir analiz prosedürü ayarlayın. Tipik olarak, kanser hücreleri nükleer hedefli bir kaspaz biyosensor aktivasyonu sonrasında kendi çekirdeklerinde floresan sinyali artırmak hücreler bastırıcı hücrelerin yokluğunda antikorlar tarafından önceden aktive CD8-pozitif T-hücreleri ile temas yapmak.CD8-pozitif T-hücrelerinin çekirdek boyutları kanser hücrelerininkinden daha küçüktür. Böylece, apoptotik efektör hücreleri bir boyut kısıtlaması görüntü analizi yöntemi ile apoptotik hedef hücre sayımları hariç tutulabilir. Bazı hedef kanser hücreleri substrat floresan olmadan küçük bir yuvarlak şekil sergilemesine rağmen, bu analizi etkilemez.Bu hücreler apoptoz yerine mitoz geçirilir ve böylece bir nükleer substrat sinyal örtüşme maskesi ile apoptotik hedef hücre sayımları hariç tutulur. Önceden aktive CD8-pozitif T-hücreleri ile hedef kanser hücrelerinin ortak kültür kanser hücresi monokültürlerinde spontan apoptoz düzeylerinin üzerinde tümör hücreli apoptosis artırır. Genellikle, etki civarı hücrelerine hedef kanser hücrelerinin optimal bir oranı kullanırken, apoptotik hedef kanser hücrelerinin sayısında bir tepe görülebilir.Veriler hedef hücre popülasyonunun apoptotik fraksiyonu olarak ifade edildiğinde bu tepe daha belirgin hale gelir. Bu protokolü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, analiz maskelerinin geliştirilmesinde kullanılmak üzere hedef hücrelerin ve efektör hücrelerin monokültürlerinin tek kültürlerini kurmaktır. Bu yöntem, t-hücresinin kanser hücresi etkileşimlerine olan süresi ve sıklığı ve hem insan hem de fare hücrelerinde gen bağımlı sitotoksisite ile ilişkili koşullar hakkında bilgi sağlayabilir.Şu anda miyeloid hücre aracılı immünsupresyon inhibe ve böylece kontrol noktası inhibitörü etkinliğini artırmak bileşikleri tanımlamak için insan hücreleri kullanarak yüksek verimli bir ekran içine bu testi geliştiriyoruz.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Mitokondri zar potansiyeli CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre Apoptosis Vitro çalışma tespiti

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Apoptozis ters sonra yeni kurulan meme kanser kök hücre benzeri hücre akış sitometrik algılama

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Skuamöz Hücre Karsinomu Hücre Tümörü bağışıklık profil oluşturma için fareler ve tedaviye yanıt değerlendirme intramucosal aşı

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Organotipik Tümör Doku Dilimlerinde Gerçek Zamanlı İlaç Yanıtının Ölçülmesi

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...