Name: multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells
Uploaded: 2019-01-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells at JoVE.com

وأيد وضع هذا البروتوكول المنح التي تقدمها "تايوان وزارة العلوم" والتكنولوجيا (معظم) NSC103-2320-B-010-002-MY2 و MOST104-2628-B-010-002-MY4 إلى هسو البنود. وي C.W. مستلم "ممتازة أطروحة جائزة من معهد لعلم الأحياء الدقيقة" وعلم المناعة، جامعة يانغ مينغ الوطنية.

ماوس الأنسجة الحصاد الإجراء الموضح هنا قد أقرها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة يانغ مينغ الوطنية.
1-إعداد تعليق اللمفاويات من الأجهزة اللمفاوية
<ol><li>Euthanize الماوس بطريقة معتمدة مثل استنشاق أول أكسيد الكربون2 في دائرة اكريليك شفافة تليها الت?...

<ol>
	<li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li><li>Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+metabolic+reprogramming+in+proliferating+cells:+implications+for+T-cell-mediated+immunity.">Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity.</a> Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).</li><li>Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+essential+for+mitochondrial+clearance+in+mature+T+lymphocytes.">Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).</li><li>Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Control+and+Guidance+of+Cellular+Activities+of+T+Cells.">Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells.</a> Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).</li><li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitophagy.">Mechanisms of mitophagy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).</li><li>Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fern&#225;ndez Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+adventures+at+the+organelle+society.">Mitochondrial adventures at the organelle society.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).</li><li>Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+Lysosomes:+Discovering+Bonds.">Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).</li><li>McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+and+PINK1+function+in+a+vesicular+trafficking+pathway+regulating+mitochondrial+quality+control.">Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control.</a> The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).</li><li>Wrighton, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism:+Mitophagy+turns+beige+adipocytes+white.">Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).</li><li>Altshuler-Keylin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+Adipocyte+Maintenance+Is+Regulated+by+Autophagy-Induced+Mitochondrial+Clearance.">Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance.</a> Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).</li><li>Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+lysosome:+a+control+centre+for+cellular+clearance+and+energy+metabolism.">Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).</li><li>Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+roles+of+lysosomal+acid+lipase+in+T+cell+development+and+function.">Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function.</a> The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).</li><li>Wei, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrative+Nucleoside+Transporter+3+Regulates+T+Cell+Homeostasis+by+Coordinating+Lysosomal+Function+with+Nucleoside+Availability.">Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability.</a> Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).</li><li>Baixauli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Respiration+Controls+Lysosomal+Function+during+Inflammatory+T+Cell+Responses.">Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses.</a> Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).</li><li>Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcription+factor+A+induction+by+redox+activation+of+nuclear+respiratory+factor+1.">Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+association+of+the+proapoptotic+protein+Bim+with+Bcl-2-related+proteins+on+mitochondria+in+T+cells.">Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).</li><li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+mechanisms,+pathophysiological+roles,+and+analysis.">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li><li>van der Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+memory+T+cells+have+a+bioenergetic+advantage+that+underlies+their+rapid+recall+ability.">CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).</li><li>Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Lyso+dyes:+A+flow+cytometric+study+of+autophagy.">Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy.</a> Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).</li><li>Allan, A. L., Keeney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+analysis:+technical+and+statistical+considerations+for+application+to+the+clinic.">Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic.</a> Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).</li><li>Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+3+tolerant+CD8+T+cells+degranulate+in+response+to+antigen+but+lack+granzyme+B+to+mediate+cytolysis.">Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis.</a> The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).</li><li>Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+cytotoxicity+but+not+degranulation+distinguishes+effector+and+memory+subsets+of+CD8++T+cells.">Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).</li><li>Van den Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dysfunction+Prevents+Repolarization+of+Inflammatory+Macrophages.">Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages.</a> Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).</li><li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+metabolism.">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li><li>Dugnani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+T+cell+metabolism+in+cancer+immunotherapy.">Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).</li><li>Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+metabolism+in+autoimmune+disease.">T-cell metabolism in autoimmune disease.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 17 (1), 29 (2015).</li></ol>

يجمع هذا البروتوكول الأصباغ عضية على حدة وعلامة السطحية تلطيخ لتحديد مقدار الميتوكوندريا أو ليسوسوميس في السكان مختلفة تي الخلية. تم تطوير هذا الأسلوب للتغلب على الحد متطلبات الخلية عدد والتجانس للأساليب التقليدية، مثل الميكروسكوب الإلكتروني وتحليل إيمونوبلوت. أنها مفيدة بشكل خاص في ت?...

التنشيط وتكاثر الخلايا T خطوات حاسمة لتركيب الاستجابات المناعية ناجحة. التقدم الذي أحرز مؤخرا تشير إلى أن الأيض الخلوية يرتبط محكم مع كل من التنمية ووظائف خلايا تي. على سبيل المثال، خلايا السذاجة تي تعتمد إلى حد كبير على الفسفرة (أوكسفوس) لتلبية الطلب على الطاقة خلال تداولها فيما بين الأجهزة اللمفاوية الثانوية. عند التنشيط، الخضوع السذاجة تي خلايا جذرية الأيضية إعادة البرمجة، بما في ذلك تنظيم دورات تعريفية لتحلل الهوائية لزيادة إنتاج ATP والوفاء بمطالب الأيضية هائلة خلال تمايز الخلايا وانتشارها. الخلايا التي لا تتبع من خلال احتياجات الأيضية يموت قبل المبرمج1،2. أثناء إعادة برمجة التمثيل الغذائي، الميتوكوندريا دوراً هاما نظراً لأنهم العضيات مسؤولة إلى حد كبير عن إنتاج ATP إمداد الطاقة للخلية، ومحتوى الميتوكوندريا الخلوية يتقلب أثناء تبديل التمثيل الغذائي في جميع أنحاء تي خلية التنمية والتنشيط3. ومع ذلك، يمكن أن تنتج تراكم الميتوكوندريا زائدة عن الحاجة أو التالفة روس الزائدة التي تضر الدهون والبروتينات والحمض النووي، ويمكن أن تؤدي في نهاية المطاف إلى الخلية الموت4
تتم إزالة الميتوكوندريا المفرطة أو التالفة الناتجة عن التغيرات الاستقلابية بشكل متخصصة من أوتوفاجي5، المعروفة باسم ميتوفاجي. الميتوكوندريا هي ملفوفة أوتوفاجوسوميس وتنصهر ثم مع lysosomes للتدهور. إغلاق هذه الاتصالات بين الميتوكوندريا و lysosomes أثارت اهتمام كبير6،7. على سبيل المثال، يحفز الأكسدة الميتوكوندريا شكل حويصلات المستمدة من الميتوكوندريا (مدفس) التي تستهدف lysosomes للتدهور في homolog الفوسفاتيز وتنزين (فتن)-التي يسببها كيناز المفترضة 1 (PINK1) وباركين (E3 ubiquitin ليجاسى) تعتمد طريقة8. ووجد أيضا أن ميتوفاجي أمر ضروري للانتقال adipocyte بيج إلى الأبيض9،10. الأهم من ذلك، ليسوسوميس ليست مجرد حجرة تدهور، ولكن أيضا منظم للإشارات الخلوية. تراكم الركازة المفرطة الناجمة عن نقص إنزيم ينتج خلل الليزوزومية بتعطيل نفاذية غشاء الليزوزومية ويؤثر على Ca2 + التوازن11. خلية T العيوب الفنية في lipase حمض الليزوزومية (ال)12 أو المستقلب الليزوزومية الناقل خروج المغلوب الماوس نموذج13 كما أظهرت أهمية lysosomes في الحفاظ على التوازن خلية تي. الميتوكوندريا و lysosomes جزء لا يتجزأ من تنظيم الأيض الخلوية. ولذلك كان قياس محتوى المتقدرية الخلوية هي مؤشر حاسم لتقييم وضع الخلية تي الأيضية والوظيفية.
وتشمل فحوصات استخداماً لقياس محتويات المتقدرية أو الليزوزومية الخلوية immunoblot والمجهر الإلكتروني وتلطيخ (إذا كان) إيمونوفلوريسسينت وتحليل PCR mitochondrial DNA نسخ الأرقام14،15، 16. بينما يمكن مقارنة immunoblot كمياً مستويات البروتين عبر عينات مختلفة والالكترون، أو إذا كان الفحص المجهري يمكن أن تصور المورفولوجية السمات المميزة لهذه العضيات17، هذه فحوصات تحمل بعض العيوب التقنية. على سبيل المثال، أنها تستغرق وقتاً طويلاً للحصول على عدد كاف من الصور خلية مع تضخم عالية والقرار أو لمقارنة مستويات البروتين التعبير عبر العشرات من عينات، مما يجعل هذه الاختبارات تعتبر أساليب إنتاجية منخفضة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه الاختبارات فقط للسكان خلية متجانسة، مثل خطوط الخلية، ولكن ليس لعينات الأنسجة التي تتكون من السكان مختلطة.
من الصعب أيضا أن تطبيق هذه الاختبارات على السكان النادرة، التي أرقام شرط الحد الأدنى من خلية من 106 إلى 108 من المستحيل أن تجتمع. وأخيراً، عادة تفكيك الخلايا أو ثابتة أثناء العملية، وجعلها متوافقة مع أساليب أخرى لاستخراج مزيد من المعلومات. مقارنة بالطرق التقليدية، قد فلوري-على أساس التدفق الخلوي إنتاجية عالية نسبيا-يمكن تحليل المعلومات من كافة الخلايا داخل عينة مؤلفة من الخلايا المختلطة السكان والتي جمعت في وقت واحد. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء الكشف عن أكثر من 10 معلمات في نفس الخلية وفرز الخلايا استناداً إلى تعمل المطلوب لفحوصات إضافية. وقد استخدمت لتسمية lysosomes والميتوكوندريا في الخلايا الحية المسابير الفلورسنت رد الفعل ويمكن الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي18،19. هذه المجسات الخاصة عضية الخلية نفاذية والخصائص الفيزيائية-الكيميائية التي تسمح لهم بأن تتركز في أماكن محددة سوبسيلولار أو العضيات. مريح، تتوفر هذه التحقيقات في مختلف صيغ الفلورسنت، مما يمكن تطبيقها لتحليل متعدد الألوان.
هذا البروتوكول ويصف بالتفصيل كيفية الجمع بين سطح علامة التلوين بالأصباغ يحلول أو الميتوكوندريا محددة لتسمية lysosomes أو يعيش الميتوكوندريا في الخلايا. وهذا مفيد بشكل خاص لعينات المتولدة من الابتدائي الأنسجة والأعضاء، التي تتكون غالباً من سكان الخلية غير متجانسة. يمكن تحديد السكان خلية من اهتمام بتعبيرها ماركر السطحية الباحثين وعلى وجه التحديد قياس محتويات الليزوزومية أو الميتوكوندريا عن طريق الأصباغ عضية على حدة في هذه الخلايا. هنا، علينا أن نظهر الإجراءات المفصلة لتحليل تدفق سيتوميتريك أن يقيم كتلة الليزوزومية أو الميتوكوندريا في الجمهرات الفرعية الرئيسية الخلية تي الطحال.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:763px;" width="762">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10 cm Graefe forceps (straight and serrated)</td>
			<td style="width:179px;">Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)</td>
			<td>Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:179px;">TERUMO&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">6 cm Petri dish</td>
			<td style="width:179px;">&#945;-plus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">SPL Lifesciences</td>
			<td style="width:119px;">93070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ammonium chloride (NH4Cl) &#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9434</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD25</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">102007</td>
			<td style="width:167px;">Clone:PC61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD4</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100453</td>
			<td style="width:167px;">Clone:GK1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD44</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">103029</td>
			<td style="width:167px;">Clone:IM7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD62L</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">104407</td>
			<td style="width:167px;">Clone:MEL-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD8</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100713</td>
			<td style="width:167px;">Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse TCR&#946;</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">109233</td>
			<td style="width:167px;">Clone:H57-579</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:179px;">Bio basic</td>
			<td style="width:119px;">6381-92-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352052</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2)</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HB-197&#12288;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:179px;">Hyclone</td>
			<td>ATD161145</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flowjo, LLC</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">LysoTracker Green DND26</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MEM Non-essential amino acids (100X)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MitoTracker Green FM</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M7514</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:179px;">J.T.baker</td>
			<td style="width:119px;">298-14-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25535-16-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">RPMI 1640 medium (powder)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>31800089</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells

خلايا T الاستفادة من البرامج الأيضية المختلفة لتتناسب مع احتياجاتها الوظيفية خلال التمايز وانتشارها. الميتوكوندريا عناصر حاسمة الخلوية المسؤولة عن إمداد الطاقة الخلية؛ ومع ذلك، تنتج الميتوكوندريا الزائدة أيضا أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) التي يمكن أن تتسبب في موت الخلايا. ولذلك، يجب تعديل عدد الميتوكوندريا باستمرار لتناسب احتياجات الخلايا. ويتحقق هذا التنظيم الحيوي في الجزء من خلال وظيفة lysosomes إزالة الفائض/تلف العضيات والجزيئات. ومن ثم، محتويات mitochondrial وتعويض الخلوية مؤشرات أساسية لتقييم التكيف الأيضي للخلايا. مع تطور التحقيقات العضيات، يحلول تتسم جيدا أو الأصباغ الميتوكوندريا على حدة قد أصبحت متاحة في أشكال مختلفة لتسمية lysosomes الخلوية والميتوكوندريا. قياس التدفق متعدد الألوان هي أداة مشتركة لتعمل الخلية الشخصية، ولديها القدرة على أن تكون متكاملة مع فحوصات أخرى. نقدم هنا، على بروتوكول مفصلة لكيفية الجمع بين الأصباغ عضية على حدة مع السطح علامات تلطيخ لقياس مقدار lysosomes والميتوكوندريا في السكان مختلفة تي خلية على سيتوميتير تدفق.

تحديد مجموعات فرعية رئيسية تي الخلية في الطحال والغدة الصعترية
وباختصار، تعليق خلية مفردة من الطحال والغدة الصعترية تم تفكيك خلايا الدم الحمراء، المحتضنة مع المادة طافية 2.4G2، متبوعاً بصبغة محددة عضية وعلامة السطحية تلطيخ مع ال...

Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells at JoVE.com

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

توضح هذه المقالة طريقة قوية تحديد حجم الميتوكوندريا أو ليسوسوميس في الخلايا الحية. مزيج الأصباغ يحلول أو الميتوكوندريا محددة مع الأجسام المضادة مترافق فلوريسسينتلي ضد علامات السطح يسمح التحديد الكمي لهذه العضيات في الخلايا المختلطة السكان، مثل الخلايا الابتدائية تحصد من عينات الأنسجة، باستخدام قياس التدفق متعدد الألوان.

التدفق متعدد الألوان المستندة إلى الخلوي الكمي الميتوكوندريا وليسوسوميس في خلايا تي

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأيض المناعي. وميزة هذه التقنية هي أنها تسمح بالتكون الكمي للميتوكوندريا أو الليسوسومات في الخلايا الحية الفردية ، في خليط معقد من أنواع الخلايا المختلفة. يمكن أيضاً تطبيق هذه الطريقة لدراسة الخلايا T و B على العديد من أنواع الخلايا الأخرى مثل الضامة أو الخلايا التكجرية أو أي خلايا أساسية يتم حصادها من عينة الأنسجة.سيتم إثبات هذا الإجراء من قبل شين وين وي، وهو طالب دراسات عليا من مختبري. لتسمية العضيات لتحديد كمي، أولا، إضافة واحد × عشرة إلى الخلايا T الماوس السادس إلى واحد جولة أسفل أنبوب الفاكس لكل علامة. وبليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي.تدفئة ما قبل إلى 37 درجة مئوية مصل خالية من ثقافة المتوسطة لتمييع حلول الأسهم مسبار محدد إلى تركيزات العمل النهائية في المتوسط. وإعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولترات من صبغة التحقيق لكل أنبوب. المقبل، احتضان الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية لفترة تلطيخ المناسبة، ووقف رد فعل في نهاية الحضانة مع ملليلتر واحد من الجليد الباردة فاكس عازلة لكل أنبوب.ثم، وجمع الخلايا مع طرد مركز آخر وإعادة تعليق الكريات في 100 ميكرولترات من ما قبل titrated 24G2 الهجين سوبرنات على الجليد. بعد عشر دقائق، أضف ملليلتر واحد من مخزن الفاكس المؤقت لكل أنبوب. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتسمية الخلايا مع 50 ميكرولترات من الفلوروسين مترافق قبل titrated كوكتيل من الفائدة.إضافة التركيز المناسب وفقا للجدول. و فاكس عازل لمدة 20 دقيقة على الجليد، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، إضافة ملليلتر واحد من عازلة الفاكس لكل أنبوب.جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. وإعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من عازلة الفاكس تستكمل مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من يوديد بروبديسيوم. مباشرة بعد إضافة الصبغي النووي ومضادة الصبغي، بدوره على جهاز الكمبيوتر تحليل مقياس التدفق، تدفق cytometer، الفاكس اقتناء البرمجيات، وأية أجهزة ملحق أخرى اعتمادا على منصة الجهاز.تشغيل برنامج تلفزيوني من خلال النظام لمدة دقيقة واحدة تقريبا لضمان أن يتم تعبئة خط التدفق مع برنامج تلفزيوني وتجدد العازلة. افتح تجربة جديدة واضبط معلمات مقياس المقاييس وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. تصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70.ودوامة قبل الحصول على كل عينة لتجنب كتل وتشكيل مزدوج. افتح إعداد التعويض التلقائي، ثم قم بإنشاء مخططات نقطة لكل معلمة فلورية. بعد كل من الفولتية قد تم تعيين، وضبط التعويض وتطبيق التعويض على العينات.إنشاء مبعثر إلى الأمام مقابل الجانب مؤامرة مبعثر وتحسين الفولتية بحيث تظهر خلايا الفائدة داخل المؤامرة. إنشاء مبعثر للأمام مقابل رسم ارتفاع مبعثر إلى الأمام وبوابة الخلايا المفردة. إنشاء منطقة مبعثر إلى الأمام مقابل مخطط منطقة التشتت الجانبي وبوابة الخلايا الليمفاوية.إنشاء منطقة مبعثر إلى الأمام مقابل مؤامرة يوديد بروبديدوم وبوابة الخلايا الحية. بعد كل من الفولتية قد تم تعيين، وضبط التعويض وتطبيق التعويض على العينات. ثم قم بتحميل أنبوب العينة الأول، وقم بإنشاء مخططات علامة سطح الخلية المناسبة، وجمع ما لا يقل عن 1000 حدث من السكان موضع الاهتمام.عند تشغيل كافة العينات، تصدير بيانات التدفق للتحليل اللاحق. وحفظ التجربة كقالب للحفاظ على إعدادات مقياس المعطيات والمعلمات لتجارب مماثلة في المستقبل. محتويات الموقع النهائي الميتوكوندريا هي أدنى في الخلايا T واحد سلبية مزدوجة، ذروة في المرحلة السلبية المزدوجة اثنين وثلاثة، وانخفاض طفيف في المرحلة السلبية المزدوجة الرابعة.مع ضعف إيجابية ثيموسيتيات تظهر أعدادا أعلى من الميتوكوندريا من CD4 و CD8 thymocytes إيجابية واحدة, مما يشير إلى أن محتويات الميتوكوندريا تتقلب أثناء التنمية. CD4 وD8 thymocytes إيجابية واحدة المعرض أعلى كثافة متوسط الميتوكوندريا الفلورانس من الخلايا CD4 أو CD8 T Splenic، مما يشير إلى أن الخلايا التائية الساذجة التي تعيد تدويرها في بيئة الدم الغنية بالأكسجين لديها كتلة الميتوكوندريا أقل من الخلايا الدرقية. ومن المثير للاهتمام، وهذا التخفيض من محتويات الميتوكوندريا هو أكثر بروزا في CD8 من سلالة الخلايا T CD4، وتنشيط الخلية T يقلل من وجود هذه العضيات.ويلاحظ انخفاض نسبيا، ولكن يمكن الكشف عنها، محتويات الليسوسومية في جميع السكان thymocyte، مع وجود أكثر بروزا في سلبية مزدوجة thymocytes واحد. في المحيط، يتم الكشف عن عدد كبير نسبيا من lysosomes في الذاكرة والمفعم CD8 الخلايا T إيجابية. الجمع بين الأصباغ العضوية محددة وعلامة سطح مع تدفق cytometry هو وسيلة قوية لتوصيف الحالة الأيضية للخلايا في خليط معقد.ويمكن استخدام صبغة خاصة إضافية من العضية للكشف عن التشنج endoplasmic، وvacuole الأوتوفجية، أو غيرها من المقصورة داخل الخلايا من الفائدة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

تحليلات متعددة الألوان من التدفق الخلوي الاستجابة المناعية الخلوية في المكاك وهو قرد اسيوي

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

استخدام التدفق الخلوي لتقييم حالة لونين في خلايا T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

الفحص التدفق الخلوي استنادا لمراقبة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

تقييم الشبكية دبقية أكلة وظيفة<em&gt; في فيفو</em&gt; باستخدام الفحص القائمة على الخلوي التدفق

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

العزلة وتدفق Cytometric تحليل الإنسان باطن عنق الرحم غاما دلتا الخلايا التائية

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

تحليل القائم على الخلوي سيتوتوكسيسيتي تدفق لتقييم نشاط الخلايا البشرية ناغورني-كاراباخ

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

القياس الكمي لتكاثر CD4 - T الخاصة بمستضد الإنسانباستخدام Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

عزل الماوس الكلى المقيم CD8+ الخلايا T لتحليل تدفق cytometry

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...