Name: multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells
Uploaded: 2019-01-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells at JoVE.com

De ontwikkeling van dit protocol werd gesteund door subsidies van de Taiwan ministerie van wetenschap en technologie (MOST) NSC103-2320-B-010-002-MY2 en MOST104-2628-B-010-002-MY4 voor C.L. Hsu. C.W. Wei is een ontvanger van uitstekende Thesis Award Instituut van microbiologie en immunologie, National Yang-Ming University.

De muis weefsel oogst beschreven procedure hier is goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de nationale universiteit van de Yang-Ming.
1. voorbereiding van de lymfocyt schorsing van lymfoïde organen
<ol><li>De muis door een erkende methode zoals CO2 inademing in een transparant acryl kamer gevolgd door cervicale dislocatie om dood euthanaseren. Opmerking: Houd het debiet van CO2 voor een verplaatsing van de 20% per minuut van de...

<ol>
	<li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li><li>Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+metabolic+reprogramming+in+proliferating+cells:+implications+for+T-cell-mediated+immunity.">Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity.</a> Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).</li><li>Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+essential+for+mitochondrial+clearance+in+mature+T+lymphocytes.">Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).</li><li>Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Control+and+Guidance+of+Cellular+Activities+of+T+Cells.">Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells.</a> Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).</li><li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitophagy.">Mechanisms of mitophagy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).</li><li>Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fern&#225;ndez Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+adventures+at+the+organelle+society.">Mitochondrial adventures at the organelle society.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).</li><li>Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+Lysosomes:+Discovering+Bonds.">Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).</li><li>McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+and+PINK1+function+in+a+vesicular+trafficking+pathway+regulating+mitochondrial+quality+control.">Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control.</a> The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).</li><li>Wrighton, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism:+Mitophagy+turns+beige+adipocytes+white.">Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).</li><li>Altshuler-Keylin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+Adipocyte+Maintenance+Is+Regulated+by+Autophagy-Induced+Mitochondrial+Clearance.">Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance.</a> Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).</li><li>Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+lysosome:+a+control+centre+for+cellular+clearance+and+energy+metabolism.">Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).</li><li>Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+roles+of+lysosomal+acid+lipase+in+T+cell+development+and+function.">Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function.</a> The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).</li><li>Wei, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrative+Nucleoside+Transporter+3+Regulates+T+Cell+Homeostasis+by+Coordinating+Lysosomal+Function+with+Nucleoside+Availability.">Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability.</a> Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).</li><li>Baixauli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Respiration+Controls+Lysosomal+Function+during+Inflammatory+T+Cell+Responses.">Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses.</a> Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).</li><li>Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcription+factor+A+induction+by+redox+activation+of+nuclear+respiratory+factor+1.">Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+association+of+the+proapoptotic+protein+Bim+with+Bcl-2-related+proteins+on+mitochondria+in+T+cells.">Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).</li><li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+mechanisms,+pathophysiological+roles,+and+analysis.">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li><li>van der Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+memory+T+cells+have+a+bioenergetic+advantage+that+underlies+their+rapid+recall+ability.">CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).</li><li>Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Lyso+dyes:+A+flow+cytometric+study+of+autophagy.">Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy.</a> Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).</li><li>Allan, A. L., Keeney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+analysis:+technical+and+statistical+considerations+for+application+to+the+clinic.">Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic.</a> Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).</li><li>Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+3+tolerant+CD8+T+cells+degranulate+in+response+to+antigen+but+lack+granzyme+B+to+mediate+cytolysis.">Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis.</a> The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).</li><li>Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+cytotoxicity+but+not+degranulation+distinguishes+effector+and+memory+subsets+of+CD8++T+cells.">Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).</li><li>Van den Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dysfunction+Prevents+Repolarization+of+Inflammatory+Macrophages.">Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages.</a> Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).</li><li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+metabolism.">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li><li>Dugnani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+T+cell+metabolism+in+cancer+immunotherapy.">Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).</li><li>Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+metabolism+in+autoimmune+disease.">T-cell metabolism in autoimmune disease.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 17 (1), 29 (2015).</li></ol>

Dit protocol combineert organel-specifieke kleurstoffen en oppervlakte marker vlekken om te kwantificeren van het bedrag van de mitochondriën of lysosomen in andere T-cel populaties. Deze methode is ontwikkeld om te overwinnen de beperking van cel nummer en homogeniteit eisen voor traditionele methoden, zoals elektronenmicroscopie en immunoblot analyse. Het is vooral nuttig in zeldzame cel populaties te analyseren en gelijktijdig behandeling van meerdere celtypen tegelijk.
De duur van de proc...

De activering en de proliferatie van T cellen zijn kritische stappen voor de montage van de succesvolle immuunrespons. Recente vooruitgang suggereren dat het cellulaire metabolisme strak gekoppeld aan zowel de ontwikkeling en de functies van T-cellen is. Bijvoorbeeld, vertrouwen naïef T cellen grotendeels op oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) om te voldoen aan de vraag naar energie tijdens de recirculatie onder secundaire lymfoïde organen. Na activatie ondergaan naïef T cellen drastische metabole herprogrammering, met inbegrip van de inductie van aërobe glycolyse ATP productie te verhogen en om te voldoen aan de enorme metabole eisen tijdens celdifferentiatie en proliferatie. De cellen die niet te volgen via de metabolische behoeften sterven door apoptosis1,2. Tijdens de metabole herprogrammering, spelen mitochondria een belangrijke rol omdat zij de organellen grotendeels verantwoordelijk voor de productie van ATP om energie voor de cel, en de inhoud van de cellulaire mitochondriën tijdens metabole schakelaars schommelt in de gehele T cel ontwikkeling en activering3. Echter, de accumulatie van overtollige of beschadigde mitochondriën overtollige ROS die schade van DNA, lipiden en proteïnen, en kan uiteindelijk leiden tot de dood4 cel kan produceren
De mitochondriën van het overmatig of beschadigd ten gevolge van metabolische omzetting worden verwijderd door een gespecialiseerde vorm van autophagy5, bekend als mitophagy. Mitochondriën zijn verpakt door autophagosomes en vervolgens gesmolten met lysosomen voor afbraak. Dit sluit communicatie tussen mitochondriën en lysosomen hebben gegenereerd grote belangstelling6,7. Bijvoorbeeld, oxidatieve stress stimuleert mitochondriën om te vormen van de mitochondriën-derived vesicles (MDVs) die op lysosomen voor afbraak in een fosfatase en Tenzin homolog (PTEN gericht zijn)-geïnduceerde putatief kinase 1 (PINK1) en parkin (een E3 ubiquitin ligase) afhankelijke wijze8. Ook bleek dat mitophagy is essentieel voor beige-naar-wit adipocyte overgang9,10. Nog belangrijker, zijn lysosomen niet alleen een aantasting van het compartiment, maar ook een regulator van cellulaire signalering. Buitensporige substraat accumulatie te wijten aan de tekortkomingen van het enzym leidt tot een lysosomale dysfunctie door het verstoren van de lysosomale membraan permeabiliteit en Ca2 + homeostase11beïnvloedt. De T cel functionele defecten in lysosomale zure lipase (LAL)12 of lysosomale metaboliet vervoerder knockout muis model13 bleek verder het belang van lysosomen in het handhaven van de T cel homeostase. Mitochondriën zowel lysosomen zijn onlosmakelijk met elkaar verbonden delen van cellulaire metabole verordening. Daarom is de meting van het cellulaire mitochondriale een cruciale indicator om te evalueren van de T cel metabole en functionele status geweest.
Gebruikte te kwantificeren van cellulaire mitochondriale of lysosomale inhoud testen omvatten immunoblot, elektronenmicroscopie immunefluorescentie (IF) kleuring en PCR analyse van mitochondriaal DNA kopie nummers14,15, 16. terwijl immunoblot kwantitatief eiwitniveaus over verschillende monsters en elektron of vergelijken kan als microscopie morfologische kenmerken van deze organellen17kunt visualiseren, deze gehaltebepalingen dragen bepaalde technische nadelen. Bijvoorbeeld, is het tijdrovend te verwerven van voldoende aantal cel beelden met hoge vergroting en resolutie of wilt vergelijken in de niveaus van de expressie van een proteïne over tientallen monsters, maken deze gehaltebepalingen beschouwd als lage doorvoersnelheid methoden. Deze testen kunnen bovendien alleen worden toegepast, tot homogene celpopulatie, zoals cellijnen, maar niet tot weefselsteekproeven dat bestaat uit een gemengde bevolking.
Het is ook moeilijk toe te passen deze gehaltebepalingen op zeldzame populaties, waarvoor de eis voor minimale cel nummers van 106 tot 108 onmogelijk is om te voldoen aan. Ten slotte, cellen zijn meestal lysed of vaste tijdens het proces, waardoor ze onverenigbaar zijn met andere methoden verder om informatie te extraheren. Vergeleken met de traditionele methoden, TL gebaseerde stroom cytometry heeft een relatief hoge doorvoersnelheid - de informatie van alle cellen binnen een steekproef samengesteld van gemengde cel bevolking kan worden geanalyseerd en gelijktijdig verzameld. Daarnaast kan detecteren meer dan 10 parameters op dezelfde cel en sorteren van de cellen op basis van gewenste fenotypen voor verdere testen. Reactieve fluorescerende sondes zijn gebruikt om het label lysosomen- en mitochondriën in levende cellen en kunnen worden gedetecteerd door stroom cytometry18,19. Deze organel-specifieke sondes zijn cel doorlaatbare en fysisch-chemische eigenschappen die de mogelijkheid moet worden geconcentreerd in de specifieke subcellular locaties of organellen. Deze sondes zijn gunstig, beschikbaar in verschillende TL formaten, zodat hun toepassing voor multicolor analyse.
Dit protocol beschrijft in detail hoe combineren oppervlakte marker kleuring met lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstoffen aan label lysosomen of mitochondriën in levende cellen. Dit is vooral handig voor monsters die zijn gegenereerd op basis van primaire weefsels en organen, die vaak bestaan uit heterogene cel populaties. Onderzoekers kunnen identificeren cel populaties van belang door hun oppervlakte marker-expressie en specifiek meten de lysosomale of mitochondrial inhoud via organel-specifieke kleurstoffen in deze cellen. Hier tonen we de gedetailleerde procedure voor flow cytometrische analyse die wordt geëvalueerd als de lysosomale of mitochondrial massa in de grote milt T cel subpopulaties.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:763px;" width="762">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10 cm Graefe forceps (straight and serrated)</td>
			<td style="width:179px;">Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)</td>
			<td>Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:179px;">TERUMO&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">6 cm Petri dish</td>
			<td style="width:179px;">&#945;-plus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">SPL Lifesciences</td>
			<td style="width:119px;">93070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ammonium chloride (NH4Cl) &#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9434</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD25</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">102007</td>
			<td style="width:167px;">Clone:PC61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD4</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100453</td>
			<td style="width:167px;">Clone:GK1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD44</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">103029</td>
			<td style="width:167px;">Clone:IM7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD62L</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">104407</td>
			<td style="width:167px;">Clone:MEL-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD8</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100713</td>
			<td style="width:167px;">Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse TCR&#946;</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">109233</td>
			<td style="width:167px;">Clone:H57-579</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:179px;">Bio basic</td>
			<td style="width:119px;">6381-92-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352052</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2)</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HB-197&#12288;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:179px;">Hyclone</td>
			<td>ATD161145</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flowjo, LLC</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">LysoTracker Green DND26</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MEM Non-essential amino acids (100X)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MitoTracker Green FM</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M7514</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:179px;">J.T.baker</td>
			<td style="width:119px;">298-14-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25535-16-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">RPMI 1640 medium (powder)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>31800089</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells

T-cellen maken gebruik van verschillende metabole programma's op maat van hun functionele behoeften tijdens de differentiatie en proliferatie. Mitochondriën zijn cruciale cellulaire componenten verantwoordelijk voor het verstrekken van de energie van de cel; overtollige mitochondriën produceren echter ook reactieve zuurstof soorten (ROS), die leiden celdood tot kan. Het aantal mitochondriën moet daarom voortdurend worden aangepast aan de noden van de cellen. Deze dynamische verordening wordt ten dele bereikt door de functie van lysosomen dat overschot/beschadigde organellen en macromoleculen verwijderen. Vandaar, cellulaire mitochondriale en lysosomale inhoud zijn belangrijke indicatoren voor de evaluatie van de metabole aanpassing van cellen. Met de ontwikkeling van sondes voor organellen, zijn goed gekarakteriseerd lysosoom of mitochondriën-specifieke kleurstoffen beschikbaar gekomen in verschillende formaten om te etiketteren cellulaire lysosomen- en mitochondriën. Multicolor stroom cytometry is een gemeenschappelijk instrument om profiel cel fenotypen, en heeft de mogelijkheid om te worden geïntegreerd met andere testen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol over het organel-specifieke kleurstoffen combineren met oppervlakte markeringen voor het meten van de hoeveelheid lysosomen- en mitochondriën in andere T-cel populaties op een stroom cytometer kleuring.

Identificatie van belangrijke T cel subsets in de milt en de thymus
Kortom, waren eencellige schorsingen van de milt en de thymus lysed van rode bloedcellen, geïncubeerd met 2.4G2 supernatant, gevolgd door organel-specifieke kleurstof en oppervlakte marker kleuring met fluorescentie-geconjugeerde antilichamen (tabel 1). De ontwikkelingstoxiciteit progressie van thymocytes kan worden beschreven ...

Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells at JoVE.com

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Dit artikel illustreert een krachtige methode om te kwantificeren mitochondriën of lysosomen in levende cellen. De combinatie van lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstoffen met fluorescently geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakte markeringen zorgt ervoor dat de kwantificering van deze organellen in gemengde cel populaties, zoals primaire cellen geoogst van weefselmonsters, met behulp van Multicolor stroom cytometry.

Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen op het gebied van immunometabolisme te beantwoorden. Het voordeel van deze techniek is dat het de kwantificering van mitochondriën of lysosomen in individuele levende cellen mogelijk maakt, in een complex mengsel van verschillende celtypen. Deze methode voor het bestuderen van T- en B-cellen kan ook worden toegepast op vele andere celtypen, zoals macrofagen, dendritische cellen of primaire cellen die uit een weefselmonster zijn geoogst.De procedure zal worden aangetoond door Chin-Wen Wei, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Om de organellen te labelen voor kwantificering, voeg eerst één keer tien aan de zesde muis T-cellen toe aan één ronde faxbuis onder de bodem per marker. En pellet de cellen door centrifugatie.voorverwarmd tot 37 graden Celsius serumvrij kweekmedium om de organellespecifieke sondevoorraadoplossingen te verdunnen voor de uiteindelijke werkconcentraties in het medium. En schort de cellen opnieuw op in 100 microliter sondekleurstof per buis. Vervolgens, incubeer de cellen in een cel cultuur incubator voor de juiste kleuring periode, het stoppen van de reactie aan het einde van de incubatie met een milliliter van ijskoude fax buffer per buis.Verzamel vervolgens de cellen met een andere centrifugatie en schort de pellets opnieuw op in 100 microliters van het vooraf getitreerde 24G2 hybridoma supernatant op ijs. Voeg na tien minuten één milliliter faxbuffer per buis toe. Verzamel de cellen door centrifugatie en label de cellen met 50 microliters van de pre-titrated fluorescentie geconjugeerde antilichaam cocktail van belang.Voeg de juiste concentratie toe volgens de tabel. En faxbuffer gedurende 20 minuten op ijs, beschermd tegen licht. Voeg aan het einde van de incubatie één milliliter faxbuffer per buis toe.Verzamel de cellen door centrifugatie. En schort de cellen opnieuw op in 300 microliter faxbuffer aangevuld met een microgram per milliliter propidiumjodide. Onmiddellijk na het toevoegen van de nucleaire en chromosoom contrastain, zet de stroom cytometer analyse computer, flow cytometer, fax acquisitie software, en andere accessoire-apparaten, afhankelijk van het machineplatform.Voer PBS ongeveer een minuut door het systeem om ervoor te zorgen dat de stroomlijn is gevuld met PBS en de buffer. Open een nieuw experiment en stel de cytometerparameters in volgens de instructies van de fabrikant. Filter de cellen door een celzeef van 70 micrometer.En vortex voorafgaand aan de verwerving van elk monster om klonten en doublet formatie te voorkomen. Open de instelling Automatische compensatie en maak puntplots voor elke fluorescerende parameter. Nadat alle spanningen zijn ingesteld, past u de compensatie aan en past u de compensatie toe op de monsters.Maak een voorwaartse spreiding versus zijverstrooiingsplot en optimaliseer de spanningen zodat de cellen van belang binnen de plot verschijnen. Maak een voorwaartse spreiding versus voorwaartse spreidingshoogte plot en poort de enkele cellen. Maak een voorwaartse spreiding gebied versus kant verstrooiing gebied plot en poort de lymfocyten.Maak een voorwaartse spreidingsgebied versus propidium jodide plot en poort de levende cellen. Nadat alle spanningen zijn ingesteld, past u de compensatie aan en past u de compensatie toe op de monsters. Laad vervolgens de eerste monsterbuis, maak de juiste celoppervlakmarkeringspercelen en verzamel ten minste 1.000 gebeurtenissen van de populatie van belang.Wanneer alle monsters zijn uitgevoerd, exporteert u de stroomgegevens voor verdere analyse. En sla het experiment op als een sjabloon om de cytometer-instellingen en parameters voor vergelijkbare experimenten in de toekomst te behouden. De uiteindelijke inhoud van de locatie mitochondriale zijn de laagste in dubbele negatieve T-cellen, piek in dubbele negatieve fase twee en drie, en een lichte afname in dubbele negatieve fase vier.Met dubbele positieve thymocyten die hogere aantallen mitochondriën aantonen dan CD4 en CD8 enkele positieve thymocyten, wat suggereert dat de mitochondriale inhoud fluctueert tijdens de ontwikkeling. CD4 en CD8 enkele positieve thymocyten vertonen een hogere mitochondriale gemiddelde fluorescentie intensiteit dan miltachtige CD4 of CD8 T cellen, wat suggereert dat naïeve T-cellen die recirculeren in de zuurstofrijke bloedomgeving hebben een nog lagere mitochondriale massa dan thymocyten. Interessant is dat deze vermindering van mitochondriale inhoud is meer prominent in de CD8 dan de CD4 T cellijn, en de T-cel activering verder vermindert de aanwezigheid van deze organellen.Relatief laag, maar detecteerbaar, lysosomale inhoud worden waargenomen in alle thymocytenpopulaties, met een meer prominente aanwezigheid in dubbele negatieve thymocyten. In de periferie wordt een relatief hoog aantal lysosomen gedetecteerd in het geheugen en effector CD8-positieve T-cellen. Het combineren van organelle specifieke kleurstoffen en oppervlakte marker met flow cytometrie is een krachtige manier om de metabolische status van cellen in een complex mengsel te karakteriseren.Aanvullende organelle specifieke kleurstof kan worden gebruikt om endoplasmische reticulum, autophagische vacuole, of andere intracellulaire compartiment van belang te detecteren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses van de cellulaire immuunreactie in resusmakaken

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Het gebruik van flowcytometrie om de staat van chromatine in T-cellen Assess

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flowcytometrie-gebaseerde test voor het toezicht op NK celfuncties

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Human Endocervicale Gamma Delta T-cellen

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Kwantificering van prolifererende humane antigeen-specifieke CD4+ T-cellen met behulp van Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolatie van Mouse Kidney-Resident CD8+ T cellen voor Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...