Name: multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells
Uploaded: 2019-01-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells at JoVE.com

Unterstützt wurde die Entwicklung dieses Protokolls durch Zuschüsse aus Taiwan-Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST) NSC103-2320-B-010-002-MY2 und MOST104-2628-B-010-002-MY4, C.L. Hsu. C.w. Wei ist ein Empfänger der ausgezeichnete Dissertation Award des Institut für Mikrobiologie und Immunologie, National Yang-Ming University.

Das hier beschriebene Maus Gewebe Ernte Verfahren wurde von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der National Yang-Ming University genehmigt.
1. Vorbereitung der Lymphozyten Aussetzung aus lymphatischen Organen
<ol><li>Einschläfern der Maus von einer anerkannten Methode wie CO2 Inhalation in einer transparenten Acryl Kammer gefolgt von zervikale Dislokation Tod sicherzustellen. Hinweis: Halten Sie die Durchflussmenge des CO2 für eine Versc...

<ol>
	<li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li><li>Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+metabolic+reprogramming+in+proliferating+cells:+implications+for+T-cell-mediated+immunity.">Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity.</a> Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).</li><li>Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. 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Dieses Protokoll verbindet Organell-spezifische Farbstoffe und Oberfläche Marker Färbung um die Menge der Mitochondrien oder Lysosomen in verschiedenen T-Zell-Populationen zu quantifizieren. Diese Methode wurde entwickelt, um die Beschränkung der Zelle Nummer und Homogenität zum traditionellen Methoden, z. B. Elektronenmikroskopie und Immunoblot Analyse zu überwinden. Es ist besonders nützlich in seltenen Zellpopulationen zu analysieren und gleichzeitig mehrere Zelltypen gleichzeitig untersuchen.
<p class="jove...

Die Aktivierung und Proliferation von T-Zellen sind wichtige Schritte für erfolgreiches Immunantworten Montage. Die jüngsten Fortschritte legen nahe, dass der Zellstoffwechsel eng verknüpft mit der Entwicklung und Funktionen des T-Zellen ist. Beispielsweise greifen naive T-Zellen weitgehend auf Oxidative Phosphorylierung (OXPHOS), während die Rückführung unter sekundären lymphatischen Organe den Energiebedarf zu decken. Nach der Aktivierung unterziehen naive T-Zellen, drastische metabolische Neuprogrammierung, einschließlich die Induktion der aeroben Glykolyse, ATP-Produktion zu erhöhen und die enormen metabolische Anforderungen während der Zelldifferenzierung und Verbreitung zu erfüllen. Die Zellen, die nicht durch die metabolischen Bedürfnisse Folgen sterben durch Apoptose1,2. Während die metabolische Neuprogrammierung Mitochondrien eine wichtige Rolle da sie weitgehend verantwortlich für die Produktion von ATP zur Energieversorgung für die Zelle Organellen, und der zellulären Mitochondrien Inhalt während metabolische Schalter schwankt in der gesamten T Zelle Entwicklung und Aktivierung3. Allerdings kann die Ansammlung von überflüssigen oder beschädigte Mitochondrien überschüssige ROS führen, die Lipiden, Proteinen und DNA-Schäden, und kann schließlich zu Tod4 Zelle führen
Stoffwechselveränderungen infolge übermäßigen oder beschädigten Mitochondrien werden durch eine spezielle Form der Autophagie5, bekannt als Mitophagy entfernt. Mitochondrien sind durch Autophagosom gewickelt und dann mit Lysosomen zum Abbau verschmolzen. Diese schließen Kommunikation zwischen Mitochondrien und Lysosomen haben großes Interesse6,7erzeugt. Zum Beispiel oxidativer Stress stimuliert Mitochondrien Mitochondrien stammenden Vesikeln (MDVs) zu bilden, die auf Lysosomen zum Abbau in einer Phosphatase und tensin Homolog (PTEN) ausgerichtet sind-induzierte vermeintliche Kinase 1 (PINK1) und Parkin (eine E3-Ubiquitin-Ligase) abhängig von Art und Weise8. Ferner wurde festgestellt, dass diese Mitophagy für wichtig Beige-weiß Adipocyte Übergang9,10. Lysosomen sind noch wichtiger ist, nicht nur ein Abbau-Fach, sondern auch ein Regulator der zellulären Signalisierung. Übermäßige Substrat Akkumulation durch Enzymmangel führt zu lysosomalen Dysfunktion durch Unterbrechung lysosomale Membranpermeabilität und Ca2 + Homöostase11betrifft. Die T-Zell-Funktionsstörungen lysosomale saure Lipase (LAL)12 oder lysosomalen Metabolit Transporter Knockout Maus Modell13 ergab ferner die Bedeutung der Lysosomen in T-Zell-Homöostase. Mitochondrien und Lysosomen sind untrennbare Bestandteile des zellulären Stoffwechselregulation. Daher wurde die Messung des zellulären Mitochondrien ein entscheidender Indikator, der T-Zell-metabolische und funktionellen Status zu bewerten.
Assays, die häufig verwendet, um die zellulären Mitochondrien oder lysosomalen Inhalt zu quantifizieren sind Immunoblot, Elektronenmikroskopie, immunofluorescent (IF) Färbung und PCR-Analyse der mitochondrialen DNA Kopie Zahlen14,15, 16. während Immunoblot quantitativ vergleichen kann Proteingehalte in verschiedenen Proben und Elektron oder Mikroskopie morphologischen Kennzeichen dieser Organellen17visualisieren kann, tragen diese Tests bestimmte technische Nachteile. Zum Beispiel ist es zeitaufwendig, ausreichende Anzahl von Zelle Bilder mit hoher Vergrößerung und Auflösung zu erwerben oder um den Ausdruck eines Proteins über Dutzende von Proben, machen diese Tests als niedriger Durchsatz Methoden vergleichen. Darüber hinaus können diese Tests nur angewendet werden, nicht homogene Zellpopulation, wie Zell-Linien, aber Gewebeproben, die aus gemischten Populationen bestehen.
Es ist auch schwierig, diese Assays für seltene Populationen gelten für die Anforderung des minimalen Zelle von 10 Zahlen6 bis 108 ist unmöglich zu erfüllen. Zu guter Letzt sind Zellen in der Regel lysiert oder festen während des Prozesses, so dass sie nicht kompatibel mit anderen Methoden, um weitere Informationen zu extrahieren. Im Vergleich mit den traditionellen Methoden, fluoreszierend-basierte Durchflusszytometrie hat einen relativ hohen Durchsatz - Informationen aller Zellen innerhalb einer Stichprobe bestehend aus gemischten Zellpopulationen analysiert und gleichzeitig gesammelt werden kann. Darüber hinaus kann eine mehr als 10 Parameter auf dieselbe Zelle erkennen und sortieren die Zellen basierend auf gewünschte Phänotypen für weitere Tests. Reaktive fluoreszierende Sonden wurden verwendet, um Lysosomen und Mitochondrien in lebenden Zellen zu kennzeichnen und durch Flow Cytometry18,19detektiert werden. Diese Organellen-spezifischen Sonden sind Zelle durchlässig und physikalisch-chemischen Eigenschaften, die ihnen ermöglichen, in bestimmten subzellulären Orten oder Organellen konzentriert werden. Praktischerweise sind diese Sonden in verschiedenen fluoreszierenden Formaten, so dass ihre Anwendung für die mehrfarbigen Analyse.
Dieses Protokoll beschreibt im Detail, Surface Marker Färbung mit Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe zu Label Lysosomen zu kombinieren oder Mitochondrien in lebende Zellen. Dies ist besonders nützlich für Proben aus primären Gewebe und Organe, die oft heterogenen Zellpopulationen bestehen generiert. Forscher identifizieren Zell-Populationen von Interesse durch ihre Oberfläche Marker Ausdruck und speziell den lysosomalen oder mitochondriale Inhalt durch Organell-spezifische Farbstoffe in diesen Zellen zu messen. Hier zeigen wir die Einzelheiten des Verfahrens der durchflusszytometrischen Analyse, die die lysosomale oder mitochondriale Masse in den großen Milz T-Zell-Subpopulationen auswertet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:763px;" width="762">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10 cm Graefe forceps (straight and serrated)</td>
			<td style="width:179px;">Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)</td>
			<td>Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:179px;">TERUMO&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">6 cm Petri dish</td>
			<td style="width:179px;">&#945;-plus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">SPL Lifesciences</td>
			<td style="width:119px;">93070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ammonium chloride (NH4Cl) &#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9434</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD25</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">102007</td>
			<td style="width:167px;">Clone:PC61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD4</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100453</td>
			<td style="width:167px;">Clone:GK1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD44</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">103029</td>
			<td style="width:167px;">Clone:IM7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD62L</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">104407</td>
			<td style="width:167px;">Clone:MEL-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD8</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100713</td>
			<td style="width:167px;">Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse TCR&#946;</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">109233</td>
			<td style="width:167px;">Clone:H57-579</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:179px;">Bio basic</td>
			<td style="width:119px;">6381-92-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352052</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2)</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HB-197&#12288;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:179px;">Hyclone</td>
			<td>ATD161145</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flowjo, LLC</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">LysoTracker Green DND26</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MEM Non-essential amino acids (100X)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MitoTracker Green FM</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M7514</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:179px;">J.T.baker</td>
			<td style="width:119px;">298-14-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25535-16-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">RPMI 1640 medium (powder)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>31800089</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells

T-Zellen nutzen verschiedene metabolische Programme mit ihren funktionalen Bedürfnissen während der Differenzierung und Proliferation. Mitochondrien sind wichtige zelluläre Komponenten verantwortlich für die Energieversorgung der Zelle; überschüssige Mitochondrien produzieren jedoch auch reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die Zelle Tod verursachen könnte. Daher muss die Anzahl der Mitochondrien ständig angepasst werden die Bedürfnisse der Zellen. Diese dynamischen Regelung erreichen teilweise durch die Funktion der Lysosomen, die Überschuß/beschädigtes Organellen und Makromoleküle zu entfernen. Zellulären Mitochondrien und lysosomale Inhalte sind daher wichtige Indikatoren zur Bewertung der metabolische Anpassung der Zellen. Mit der Entwicklung von Sonden für Organellen sind gut charakterisierten Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe in verschiedenen Formaten zu zellulären Lysosomen und Mitochondrien label geworden. Multicolor Durchflusszytometrie wird sehr häufig verwendet, Profil Zelle Phänotypen und hat die Fähigkeit, mit anderen Tests integriert werden. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll wie Organell-spezifische Farbstoffe mit Oberflächenmarker Färbung um den Lysosomen und Mitochondrien in verschiedenen T-Zell-Populationen auf einem Durchflusszytometer messen zu kombinieren.

Identifikation der großen T Zelle Teilmengen in Milz und thymus
Kurz gesagt, wurden einzelne Zellsuspensionen von Milz und Thymus der Erythrozyten lysiert, mit 2.4G2 überstand inkubiert, gefolgt von Organell-spezifische Farbe und Oberfläche Marker Färbung mit Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern (Tabelle 1). Die Entwicklung Fortschreiten der Thymozyten kann mithilfe von Antikörpern gegen d...

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Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Dieser Artikel beschreibt eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung von Mitochondrien oder Lysosomen in lebenden Zellen. Die Kombination aus Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe mit Gewebekulturen konjugierten Antikörpern gegen Oberflächenmarker ermöglicht die Quantifizierung dieser Organellen in gemischten Zell-Populationen, wie primäre Zellen mithilfe von Gewebeproben, geerntet Multicolor Durchflusszytometrie.

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Diese Methode kann uns helfen, wichtige Fragen im Immunstoffwechselbereich zu beantworten. Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie die Quantifizierung von Mitochondrien oder Lysosomen in einzelnen lebenden Zellen in einer komplexen Mischung verschiedener Zelltypen ermöglicht. Diese Methode zur Untersuchung von T- und B-Zellen kann auch auf viele andere Zelltypen wie Makrophagen, dendritische Zellen oder Primärzellen angewendet werden, die aus einer Gewebeprobe entnommen werden.Das Verfahren wird von Chin-Wen Wei, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Um die Organellen für die Quantifizierung zu beschriften, fügen Sie zunächst ein mal zehn zu den sechsten Maus-T-Zellen zu einem runden unteren Faxrohr pro Marker hinzu. Und pellet die Zellen durch Zentrifugation.vorgewärmt auf 37 Grad Celsius serumfreies Kulturmedium, um die organelle spezifischen Sondenstocklösungen auf endige Arbeitskonzentrationen im Medium zu verdünnen. Und die Zellen in 100 Mikroliter Sondenfarbstoff pro Röhre wieder aufhängen. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator für die entsprechende Färbezeit und stoppen die Reaktion am Ende der Inkubation mit einem Milliliter eiskalten Faxpuffer pro Tube.Dann sammeln Sie die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation und setzen Sie die Pellets in 100 Mikroliterdes des vortitrierten 24G2-Hybridom-Überstands auf Eis wieder auf. Fügen Sie nach zehn Minuten einen Milliliter Faxpuffer pro Tube hinzu. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und beschriften Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern der vortitrierten fluoreszenzkonjugierten Antikörpercocktail von Interesse.Fügen Sie die entsprechende Konzentration entsprechend der Tabelle hinzu. Und Faxpuffer für 20 Minuten auf Eis, vor Licht geschützt. Fügen Sie am Ende der Inkubation einen Milliliter Faxpuffer pro Tube hinzu.Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Und setzen Sie die Zellen in 300 Mikroliter Faxpuffer mit einem Mikrogramm pro Milliliter Propidiumjodid ergänzt. Schalten Sie unmittelbar nach dem Hinzufügen des Kern- und Chromosomen-Gegenflecks den Durchfluss-Zytometer-Analysecomputer, das Durchflusszytometer, die Faxerfassungssoftware und alle anderen Zubehörgeräte je nach Maschinenplattform ein.Führen Sie PBS für etwa eine Minute durch das System, um sicherzustellen, dass die Durchflussleitung mit PBS und Sheathe-Puffer gefüllt ist. Öffnen Sie ein neues Experiment und legen Sie die Zytometerparameter gemäß den Anweisungen des Herstellers fest. Filtern Sie die Zellen mit einem 70-Mikrometer-Zellsieb.Und Wirbel vor dem Erwerb jeder Probe, um Klumpen und DoppelteBildung zu vermeiden. Öffnen Sie die Einstellung Auto Kompensation, und erstellen Sie Punktdiagramme für jeden fluoreszierenden Parameter. Nachdem alle Spannungen eingestellt sind, stellen Sie die Kompensation ein und wenden Sie die Kompensation auf die Proben an.Erstellen Sie ein Vorwärtsstreuungsdiagramm im Vergleich zur Seite und optimieren Sie die Spannungen, damit die Voninteresseenzellen innerhalb des Diagramms angezeigt werden. Erstellen Sie eine Vorwärtsstreuung im Vergleich zu vorwärts Scatter-Höhe Plot und Gate die einzelnen Zellen. Erstellen Sie einen vorwärts streuenden Bereich im Vergleich zum Seitenstreuungsflächendiagramm und beorden die Lymphozyten.Erstellen Sie einen Vorwärtsstreubereich im Vergleich zu Propidiumjodid-Plot und Gate der lebenden Zellen. Nachdem alle Spannungen eingestellt sind, stellen Sie die Kompensation ein und wenden Sie die Kompensation auf die Proben an. Laden Sie dann das erste Probenröhrchen, erstellen Sie die entsprechenden Zelloberflächenmarkierungsdiagramme, und sammeln Sie mindestens 1 000 Ereignisse der Voninteressespopulation.Wenn alle Stichproben ausgeführt wurden, exportieren Sie die Flussdaten für die nachfolgende Analyse. Und speichern Sie das Experiment als Vorlage, um die Zytometereinstellungen und Parameter für ähnliche Experimente in der Zukunft beizubehalten. Der endgültige mitochondriale Inhalt der Letzten Seite ist der niedrigste in doppelt negativen T-Zellen, spitzen in der doppelten negativen Stufe zwei und drei und leicht abgehend in der doppelten negativen Stufe vier.Mit doppelt positiven Thymosyten, die eine höhere Anzahl von Mitochondrien als CD4 und CD8 einzelne positive Thymozyten zeigen, was darauf hindeutet, dass der mitochondriale Inhalt während der Entwicklung schwankt. CD4- und CD8-Einzel-positive Thymozyten weisen eine höhere mitochondriale mittlere Fluoreszenzintensität auf als Milz-CD4- oder CD8-T-Zellen, was darauf hindeutet, dass naive T-Zellen, die in der sauerstoffreichen Blutumgebung zirkulieren, eine noch niedrigere mitochondriale Masse haben als Thymozyten. Interessanterweise ist diese Reduktion des mitochondrialen Inhalts in der CD8 stärker ausgeprägt als die CD4 T Zelllinie, und die T-Zellaktivierung verringert das Vorhandensein dieser Organellen weiter.Relativ niedriger, aber nachweisbarer, lysosomaler Gehalt wird in allen Thymosytenpopulationen beobachtet, mit einer stärkeren Präsenz in doppelt negativen Thymosezyten. In der Peripherie wird eine relativ hohe Anzahl von Lysosomen in Speicher- und Effektor-CD8-positiven T-Zellen nachgewiesen. Die Kombination von organelle spezifischen Farbstoffen und Oberflächenmarkern mit Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Möglichkeit, den metabolischen Zustand von Zellen in einer komplexen Mischung zu charakterisieren.Zusätzliche organelle spezifische Farbstoff kann verwendet werden, um endoplasmatische Retikulum zu erkennen, autophagic Vakuole, oder andere intrazelluläre Kompartiment von Interesse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor Durchflusszytometrie Analysen der zellulären Immunantwort in Rhesusaffen

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Die Verwendung von Durchflusszytometrie, um den Zustand von Chromatin in T-Zellen bewerten

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantifizierung von proliferierenden humanen Antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidylester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolierung von Maus-Kidney-Resident-CD8+ T-Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...