Name: multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells
Uploaded: 2019-01-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells at JoVE.com

이 프로토콜의 개발은 카스 티 야 수의에 대만 사역의 과학 및 기술 (대부분) NSC103-2320-B-010-002-MY2 및 MOST104-2628-B-010-002-MY4에서 교부 금에 의해 지원 되었다. C.W. 웨이 우수 논문 수상의 연구소의 미생물학 및 면역학, 국립 양 밍 대학의 받는 사람입니다.

여기에 설명 된 마우스 조직 수확 절차 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 국립 양 밍 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 림프 구 림프 기관에서 현 탁 액의 준비
<ol><li>투명 한 아크릴 챔버 죽음을 보장 하기 위해 자 궁 경관 탈 구 뒤에 CO2 흡입 등 승인 된 방법으로 마우스를 안락사. 참고: CO2 챔버, 및 5 psi (평방 인치 당 파운드) 보다 분당 20% 변위에 대 한 ?...

<ol>
	<li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li><li>Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+metabolic+reprogramming+in+proliferating+cells:+implications+for+T-cell-mediated+immunity.">Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity.</a> Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).</li><li>Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+memory+T+cells+have+a+bioenergetic+advantage+that+underlies+their+rapid+recall+ability.">CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).</li><li>Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Lyso+dyes:+A+flow+cytometric+study+of+autophagy.">Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy.</a> Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).</li><li>Allan, A. 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A., Oxenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+cytotoxicity+but+not+degranulation+distinguishes+effector+and+memory+subsets+of+CD8++T+cells.">Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).</li><li>Van den Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dysfunction+Prevents+Repolarization+of+Inflammatory+Macrophages.">Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages.</a> Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).</li><li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+metabolism.">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li><li>Dugnani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+T+cell+metabolism+in+cancer+immunotherapy.">Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).</li><li>Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+metabolism+in+autoimmune+disease.">T-cell metabolism in autoimmune disease.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 17 (1), 29 (2015).</li></ol>

이 프로토콜은 세포 기관이 특정 염료와 표면 마커 얼룩 미토 콘 드리 아 또는 다른 T 세포 인구에서 리소좀의 양을 계량 하. 이 방법은 전통적인 방법, 전자 현미경 등 immunoblot 분석에 대 한 셀 번호와 동질성 요구의 한계를 극복 하기 위해 개발 되었다. 희귀 세포 인구를 분석 하 고 동시에 동시에 여러 셀 형식 검사에 특히 유용 합니다.
절차의 기간 및 외피의 온도이 프로토콜...

활성화 및 T 세포의 확산 장착 성공적인 면역 반응에 중요 한 단계가 있습니다. 최근 진보 세포질 물질 대사는 개발 및 T 세포의 기능와 밀접 하 게 관련 된 것이 좋습니다. 예를 들어, naïve T 세포 산화 인 산화 (OXPHOS) 2 차 림프 기관 가운데 재순환 동안 에너지 수요를 충족 하기에 크게 의존 합니다. 활성화, naïve T 세포 과감 한 대사 프로그래밍, 호 기성 해당 분해 ATP 생산을 증가 하 고 세포 분화 및 증식 하는 동안 엄청난 대사 요구를 충족의 유도 포함 하 여 받 다. 신진 대사 요구를 통해 수행 하지 못하는 세포 apoptosis1,2다. 신진 대사 프로그래밍 하는 동안 미토 콘 드리 아에 중요 한 역할 때문에 그들은 크게는 셀에 대 한 에너지를 공급 하는 ATP의 생산에 대 한 책임 세포 세포 미토 콘 드리 아 콘텐츠 대사 스위치 중 변동 통해 T 세포 개발 및 활성화3. 그러나, 불필요 하거나 손상 된 미토 콘 드리 아의 축적 지질, 단백질 및 DNA를 손상 하 고 결국 죽음4 셀 이어질 수 초과 선생님을 생성할 수 있습니다.
과도 한 또는 손상 된 미토 콘 드리 아 대사 변경에서 발생 하는 특수 한 형태의 autophagy5, mitophagy로 알려진에 의해 제거 됩니다. 미토 콘 드리 아 autophagosomes에 의해 싸여 있으며 다음 성능 저하 lysosomes로 융합. 이 미토 콘 드리 아 간의 통신 닫고 리소좀 큰 관심6,7생성 합니다. 산화 스트레스를 미토 콘 드리 아에서 파생 된 소포 (MDVs) 리소좀 인산 가수분해 효소 및 tensin 체 (PTEN) 저하에 대 한 타겟으로하는 미토 콘 드리 아를 자극 하는 예를 들어-상 상속 키 니 아 제 1 (PINK1) 유도 및 parkin (E3 유비퀴틴 리가) 종속 방식8. 또한 그 mitophagy 베이 지 화이트 체형 전환9,10에 대 한 필수적입니다 발견 했다. 더 중요 한 것은, 리소좀 단지 저하 구획, 아니라 셀룰러 신호의 레 귤 레이 터 하지 않습니다. 효소 부족으로 인해 과도 한 기판 축적 lysosomal 부전 lysosomal 막 침투성을 방해 하 여 발생 하 고 캘리포니아2 + 항상성11에 영향을 줍니다. T 세포 기능 결함 lysosomal 산 성 리 파 제 (LAL)12 또는 lysosomal 대사 산물 운송업 자 녹아웃 마우스 모델13 에 추가 T 세포 항상성 유지에 리소좀의 중요성을 보여주었다. 미토 콘 드리 아와 리소좀 세포 신진 대사 조절의 불리할 수 없는 부분입니다. 따라서, 세포 미토 콘 드 리아 측정 T 세포 대사 및 기능 상태를 평가 하는 중요 한 표시기 되었습니다.
일반적으로 세포 미토 콘 드리 아 또는 lysosomal 내용을 정량화 하는 데 사용 하는 분석 실험 등 immunoblot, 전자 현미경, immunofluorescent (IF) 얼룩, 미토 콘 드리 아 DNA 복사 번호14,15, 의 PCR 분석 16. 이러한 분석 특정 기술적인 단점 부담 immunoblot 양적 다른 샘플 및 전자 현미경 검사 법17이러한 세포 형태학 적 특징을 시각화 수 있는 경우 전체 단백질 레벨을 비교할 수 있습니다, 하는 동안. 예, 그것은 시간이 걸리는 높은 배율과 해상도와 셀 이미지의 충분 한 번호를 취득 하거나 낮은 처리량 방법으로 간주 됩니다 이러한 분석을 만드는 샘플을 수십에서 단백질의 식 수준을 비교 하. 셀 라인, 같은 동종 세포 인구에 하지만 혼합 인구의 구성 된 조직 샘플을 또한,이 분석 실험의 적용할 수만 있습니다.
그것은 또한 드문 인구, 10에서 숫자는 최소 셀의 요구 사항에 이러한 분석을 적용 하기 어려운6 108 만날 수는 없습니다. 마지막으로, 셀 일반적으로 lysed 또는 호환 되지 않는 추가 정보를 추출 하는 다른 방법으로 그들을 만드는 과정 동안 고정. 전통적인 방법에 비해, 형광 기반 cytometry는 상대적으로 높은 처리량-모든 샘플 내의 셀 혼합된 셀 인구 구성의 정보를 분석 하 고 동시에 수집 된 수 있습니다. 또한, 하나의 동일한 셀에 10 개 이상의 매개 변수를 검색할 하 고 추가 분석에 대 한 원하는 고기에 따라 셀을 정렬할 수 있습니다. 반응 형광 프로브 리소좀 및 라이브 세포에서 미토 콘 드리 아를 사용 하 고 교류 cytometry18,19에 의해 검출 될 수 있다. 이러한 세포 기관이 전용 프로브 셀 침투성 고 특정 subcellular 위치 또는 세포에 집중 될 수 있도록 physico-화학 특성. 편리 하 게,이 프로브 따라서 다 색 분석에 대 한 그들의 응용 프로그램을 사용 하면 다양 한 형광 형식에서 사용할 수 있습니다.
표면 마커 라벨 리소좀을 리소좀 또는 미토 콘 드리 아 특정 염료와 염색 법을 결합 하는 방법을 자세하게에서 설명 합니다이 프로토콜 또는 미토 콘 드리 아에서 라이브 셀. 기본 조직 및 장기는 종종 다른 유형의 세포 인구 구성에서 생성 된 샘플에 대 한 특히 유용 합니다. 연구원은 그들의 표면 마커 식으로 관심의 세포 인구를 식별 하 고 이러한 세포에서 세포 기관이 특정 염료를 통해 lysosomal 또는 미토 콘 드리 아 내용을 구체적으로 측정 수 있습니다. 여기, 우리 주요 비장 T 세포 모집단에 lysosomal 또는 미토 콘 드리 아 질량을 계산 하는 흐름 cytometric 분석의 상세한 절차를 보여 줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:763px;" width="762">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10 cm Graefe forceps (straight and serrated)</td>
			<td style="width:179px;">Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)</td>
			<td>Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:179px;">TERUMO&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">6 cm Petri dish</td>
			<td style="width:179px;">&#945;-plus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">SPL Lifesciences</td>
			<td style="width:119px;">93070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ammonium chloride (NH4Cl) &#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9434</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD25</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">102007</td>
			<td style="width:167px;">Clone:PC61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD4</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100453</td>
			<td style="width:167px;">Clone:GK1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD44</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">103029</td>
			<td style="width:167px;">Clone:IM7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD62L</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">104407</td>
			<td style="width:167px;">Clone:MEL-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD8</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100713</td>
			<td style="width:167px;">Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse TCR&#946;</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">109233</td>
			<td style="width:167px;">Clone:H57-579</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:179px;">Bio basic</td>
			<td style="width:119px;">6381-92-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352052</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2)</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HB-197&#12288;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:179px;">Hyclone</td>
			<td>ATD161145</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flowjo, LLC</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">LysoTracker Green DND26</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MEM Non-essential amino acids (100X)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MitoTracker Green FM</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M7514</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:179px;">J.T.baker</td>
			<td style="width:119px;">298-14-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25535-16-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">RPMI 1640 medium (powder)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>31800089</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells

T 세포 감 별 법 그리고 확산 하는 동안 그들의 기능 요구에 맞게 다른 신진 대사 프로그램을 활용 합니다. 미토 콘 드리 아에는 중요 한 세포 구성 요소 셀 에너지; 공급에 대 한 책임 그러나, 초과 미토 콘 드리 아에는 또한 반응성 산소 종 (선생님) 세포 죽음을 일으킬 수 있는 생산. 따라서, 미토 콘 드리 아의 수 지속적으로 세포의 요구에 맞게 조정 해야 합니다. 이 동적 규칙 일부 흑자/손상 된 세포와 고분자를 제거 하는 리소좀의 기능을 통해 이루어집니다. 따라서, 세포 미토 콘 드리 아와 lysosomal 내용이 세포의 신진 대사 조정 평가 하는 주요 지표 이다입니다. 세포에 대 한 프로브 개발, 잘 특징이 리소좀 또는 미토 콘 드리 아-특정 염료는 세포 리소좀 및 미토 콘 드리 아를 다양 한 형태로 제공 되었다. 다 색 cytometry 프로필 셀 고기를 일반적인 도구 이며 다른 분석 실험와 통합 될 수 있다. 여기, 우리와 결합 하 여 세포 기관이 특정 염료 표면 마커 얼룩에 교류 cytometer 리소좀과 다른 T 세포 인구에 있는 미토 콘 드리 아의 양을 측정 하는 방법의 상세한 프로토콜을 제시.

비장 및 흉 선 주요 T 세포 부분 집합의 식별
간단히, 비장, thymus에서 단일 셀 정지 적혈구의 lysed, 2.4G2 상쾌한와 인 큐베이 팅, 세포 기관이 특정 염료 및 표면 마커 형광 활용 된 항 체 (표 1)와 얼룩. Thymocytes의 개발 진행 공동 수용 체에 항 체를 사용 하 여 기술 될 수 있다 CD4, CD8. 가장 미 숙 thymocytes CD4 ...

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Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

이 문서에서는 미토 콘 드리 아 또는 살아있는 세포에서는 리소좀을 계량 하는 강력한 방법을 보여 줍니다. 표면 표식에 놓여있는지 활용 된 항 체와 리소좀 또는 미토 콘 드리 아 특정 염료의 조합 사용 하 여 조직 샘플에서 수확 하는 1 차 셀 같은 혼합된 세포 인구에 이러한 세포의 부 량 수 다 색 cytometry입니다.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

이 방법은 면역 물질 대사 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 다른 세포 유형의 복잡한 혼합물에서 개별 살아있는 세포에서 미토콘드리아 또는 리소좀의 정량화를 허용한다는 것입니다. T 및 B 세포를 연구하기 위한 이 방법은 또한 대식세포, 수지상 세포, 또는 조직 견본에서 수확된 어떤 1 차적인 세포와 같은 많은 그밖 세포 모형에 적용될 수 있습니다.절차는 내 실험실에서 대학원생 인 친 웬 웨이에 의해 입증될 것입니다. 양자화를 위해 세포기관에 라벨을 붙이려면 먼저 마커당 1라운드 하단 팩스 튜브에 여섯 번째 마우스 T 셀에 1회 10번 을 추가합니다. 그리고 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.세포특정 프로브 스톡 솔루션을 중간크기의 최종 작업 농도로 희석하기 위해 37°C까지 미리 따뜻해져 있다. 그리고 튜브 당 프로브 염료의 100 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 다음으로, 적절한 염색 기간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 배양하고, 튜브 당 얼음 냉간 팩스 버퍼1밀리리터로 인큐베이션의 끝에서 반응을 중지한다.이어서, 또 다른 원심분리로 세포를 수집하고 얼음위에 미리 정된 24G2 hybridoma 상수제의 100마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 10분 후 튜브당 팩스 버퍼 1밀리리터를 추가합니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 사전 조정된 형광의 50 마이크로리터로 세포를 라벨로 지정하여 관심 있는 항체 칵테일을 접수합니다.테이블에 따라 적절한 농도를 추가합니다. 그리고 빛으로부터 보호 얼음에 20 분 동안 버퍼링합니다. 인큐베이션이 끝나면 튜브당 팩스 버퍼 1밀리리터를 추가합니다.원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. 그리고 프로피듐 요오드의 밀리리터 당 하나의 마이크로그램으로 보충 팩스 버퍼의 300 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단. 핵 및 염색체 카운터스테인을 추가한 직후 기계 플랫폼에 따라 유동 세포계 분석 컴퓨터, 흐름 사이토미터, 팩스 획득 소프트웨어 및 기타 액세서리 장치를 켭니다.유동선이 PBS 및 시어테 버퍼로 채워지도록 시스템을 통해 PBS를 약 1분 동안 실행합니다. 새로운 실험을 열고 제조업체의 지침에 따라 사이토미터 매개 변수를 설정합니다. 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포를 필터링합니다.그리고 덩어리와 이중 형성을 피하기 위해 각 샘플의 취득 전에 소용돌이. 자동 보정 설정을 열고 각 형광 매개변수에 대한 점 플롯을 만듭니다. 모든 전압이 설정된 후 보정을 조정하고 보정을 샘플에 적용합니다.측면 분산 플롯과 전방 분산을 만들고 전압을 최적화하여 관심 있는 셀이 플롯 내에 표시되도록 합니다. 앞으로 분산된 높이 플롯과 방향 분산을 만들고 단일 셀을 게이트합니다. 측면 분산 영역 플롯과 림프구의 게이트에 대한 전방 분산 영역을 만듭니다.프로피듐 요오드 플롯대 전방 분산 영역을 만들고 라이브 셀을 게이트합니다. 모든 전압이 설정된 후 보정을 조정하고 보정을 샘플에 적용합니다. 그런 다음 첫 번째 샘플 튜브를 로드하고, 적절한 세포 표면 마커 플롯을 만들고, 관심 있는 집단의 적어도 1, 000 이벤트를 수집한다.모든 샘플을 실행한 경우 후속 분석을 위해 흐름 데이터를 내보냅니다. 그리고 미래에 유사한 실험에 대한 사이토미터 설정 및 매개 변수를 보존하기 위해 실험을 템플릿으로 저장합니다. 최종 부위 미토콘드리아 함량은 이중 음수 1T 세포에서 가장 낮으며, 이중 음수 단계 2및 3에서 피크를 기록하며, 이중 음수 단계 4에서 약간 감소합니다.CD4 및 CD8 단일 양성 티모세포보다 더 많은 수의 미토콘드리아를 보여주는 이중 양성 티모사이클로 개발 중에 미토콘드리아 함량이 변동한다는 것을 시사합니다. CD4 및 CD8 단일 양성 티모세포는 비장 CD4 또는 CD8 T 세포보다 더 높은 미토콘드리아 평균 형광 강도를 나타내며, 산소가 풍부한 혈액 환경에서 재순환하는 순진한 T 세포가 티모세포보다 훨씬 낮은 미토콘드리아 질량을 가지고 있음을 시사한다. 흥미롭게도, 미토콘드리아 내용의 이러한 감소는 CD4 T 세포 계보보다 CD8에서 더 두드러지며, T 세포 활성화는 이들 세포세포의 존재를 더욱 감소시다.비교적 낮지만 검출 가능한 리소소말 함량은 모든 티모사이클 집단에서 관찰되며, 이중 음수 1개의 티모사이클에서 더 두드러진 존재가 있습니다. 주변에서, 상대적으로 많은 수의 리소좀이 메모리 및 이펙터 CD8 양성 T 세포에서 검출된다. 유기체 특이적 염료와 표면 마커를 유동 세포측정과 결합하는 것은 복잡한 혼합물에서 세포의 대사 상태를 특성화하는 강력한 방법입니다.추가 소세포 특이적 염료는 내피성 망상, 자가형성 바쿠올 또는 기타 세포내 구획을 검출하는 데 사용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

연구

면역학 및 감염병학

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

유동 세포 계측법의 사용은 T 세포의 염색질의 상태를 평가하기 위해

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

인간의 자궁 경부 감마 델타 T 세포의 분리 및 유세포 분석

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

카르복시플루아세인 수치니미딜 에스테르를 이용한 증식 인간 항원 특이적 CD4+ T 세포의 정량화

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...