Name: multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells
Uploaded: 2019-01-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells at JoVE.com

Utviklingen av denne protokollen ble støttet av tilskudd fra Taiwan departementet for vitenskap og teknologi (de fleste) NSC103-2320-B-010-002-MY2 og MOST104-2628-B-010-002-MY4 til CL Hsu. CW Wei er en utmerket oppgaven Award i Institutt for mikrobiologi og immunologi, National Yang-Ming University.

Musen vev harvest fremgangsmåten som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av National Yang-Ming University.
1. forberedelse av lymfocytt suspensjon fra lymfoide organer
<ol><li>Euthanize musen med en godkjent metode som CO2 innånding i en gjennomsiktig akryl kammer etterfulgt av cervical forvridning å sikre død. Merk: Holde inntakets CO2 for en 20% per minutt forskyvning av kammeret, og ikke høyere enn 5 psi (pund...

<ol>
	<li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li><li>Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+metabolic+reprogramming+in+proliferating+cells:+implications+for+T-cell-mediated+immunity.">Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity.</a> Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).</li><li>Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+essential+for+mitochondrial+clearance+in+mature+T+lymphocytes.">Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).</li><li>Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Control+and+Guidance+of+Cellular+Activities+of+T+Cells.">Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells.</a> Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).</li><li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitophagy.">Mechanisms of mitophagy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).</li><li>Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fern&#225;ndez Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+adventures+at+the+organelle+society.">Mitochondrial adventures at the organelle society.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).</li><li>Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+Lysosomes:+Discovering+Bonds.">Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).</li><li>McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+and+PINK1+function+in+a+vesicular+trafficking+pathway+regulating+mitochondrial+quality+control.">Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control.</a> The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).</li><li>Wrighton, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism:+Mitophagy+turns+beige+adipocytes+white.">Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).</li><li>Altshuler-Keylin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+Adipocyte+Maintenance+Is+Regulated+by+Autophagy-Induced+Mitochondrial+Clearance.">Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance.</a> Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).</li><li>Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+lysosome:+a+control+centre+for+cellular+clearance+and+energy+metabolism.">Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).</li><li>Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+roles+of+lysosomal+acid+lipase+in+T+cell+development+and+function.">Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function.</a> The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).</li><li>Wei, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrative+Nucleoside+Transporter+3+Regulates+T+Cell+Homeostasis+by+Coordinating+Lysosomal+Function+with+Nucleoside+Availability.">Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability.</a> Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).</li><li>Baixauli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Respiration+Controls+Lysosomal+Function+during+Inflammatory+T+Cell+Responses.">Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses.</a> Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).</li><li>Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcription+factor+A+induction+by+redox+activation+of+nuclear+respiratory+factor+1.">Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+association+of+the+proapoptotic+protein+Bim+with+Bcl-2-related+proteins+on+mitochondria+in+T+cells.">Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).</li><li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+mechanisms,+pathophysiological+roles,+and+analysis.">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li><li>van der Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+memory+T+cells+have+a+bioenergetic+advantage+that+underlies+their+rapid+recall+ability.">CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).</li><li>Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Lyso+dyes:+A+flow+cytometric+study+of+autophagy.">Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy.</a> Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).</li><li>Allan, A. L., Keeney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+analysis:+technical+and+statistical+considerations+for+application+to+the+clinic.">Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic.</a> Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).</li><li>Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+3+tolerant+CD8+T+cells+degranulate+in+response+to+antigen+but+lack+granzyme+B+to+mediate+cytolysis.">Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis.</a> The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).</li><li>Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+cytotoxicity+but+not+degranulation+distinguishes+effector+and+memory+subsets+of+CD8++T+cells.">Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).</li><li>Van den Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dysfunction+Prevents+Repolarization+of+Inflammatory+Macrophages.">Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages.</a> Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).</li><li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+metabolism.">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li><li>Dugnani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+T+cell+metabolism+in+cancer+immunotherapy.">Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).</li><li>Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+metabolism+in+autoimmune+disease.">T-cell metabolism in autoimmune disease.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 17 (1), 29 (2015).</li></ol>

Denne protokollen kombinerer organelle-spesifikke fargestoffer og overflate markør flekker for å kvantifisere mitokondrier eller lysosomer i ulike T celle populasjoner. Denne metoden ble utviklet for å overvinne begrensning av celle nummer og homogenitet krav til tradisjonelle metoder, for eksempel elektronmikroskop og immunoblot analyse. Det er spesielt nyttig i analysere sjeldne celle populasjoner og samtidig undersøker flere celletyper samtidig.
Hele prosedyren og temperaturen i inkubas...

Aktivisering og spredning av T-celler er avgjørende skritt for montering vellykket immunreaksjoner. Nylige fremskritt foreslår at cellenes stoffskifte er tett forbundet med både utvikling og funksjoner av T-celler. For eksempel stole naiv T celler hovedsak på oxidative fosforylering (OXPHOS) for å møte etterspørselen etter energi under resirkulering blant andre lymfoide organer. Ved aktivering gjennomgå naiv T celler drastisk metabolske reprogramming, inkludert induksjon av aerobic Glykolysen å øke ATP produksjonen og for å oppfylle de enorme metabolske kravene under celledifferensiering og spredning. Celler som ikke følger gjennom metabolske behov dø av apoptose1,2. Under den metabolske reprogramming, spille mitokondrier viktige roller siden de er organelles ansvarlig for produksjon av ATP å levere energi for cellen, og mobilnettet mitokondrier innholdet varierer i metabolske brytere hele T celle utvikling og aktivisering3. Men kan opphopning av overflødig eller skadet mitokondrier produsere overflødig ROS som skader lipider, proteiner og DNA, og kan føre til celle død4
Overdreven eller skadet mitokondrier skyldes metabolske forandringer er fjernet av en spesialisert form av autophagy5, kjent som mitophagy. Mitokondrier er pakket av autophagosomes og deretter smeltet sammen med lysosomer til fornedrelse. Dette lukker kommunikasjon mellom mitokondrier og lysosomer har generert stor interesse6,7. For eksempel oksidativt stress stimulerer mitokondrier å danne mitokondrier-avledet blemmer (MDVs) som er rettet mot lysosomer for degradering av en fosfatase og tensin homolog (PTEN)-indusert antatte kinase 1 (PINK1) og parkin (en E3 ubiquitin ligase) avhengige måte8. Det ble også funnet at mitophagy er avgjørende for beige-til-hvite adipocyte overgang9,10. Enda viktigere, er lysosomer ikke bare en degradering kupé, men også en regulator mobilnettet signalnettverk. Overdreven substrat akkumulering på grunn av enzymet mangler resulterer i lysosomale dysfunksjon ved å forstyrre lysosomale membran permeabilitet og påvirker Ca2 + homeostase11. T celle funksjonelle mangler i lysosomale syre lipase (LAL)12 eller lysosomale metabolitten transporter knockout mus modell13 viste videre betydningen av lysosomer opprettholde T celle homeostase. Både mitokondrier og lysosomer er uatskillelige deler av mobilnettet metabolske regulering. Derfor er måling av mobilnettet mitokondrie innhold en viktig indikator å evaluere T celle metabolske og funksjonell status.
Analyser brukte å kvantifisere mobilnettet mitokondrie eller lysosomale innholdet inkluderer immunoblot, elektronmikroskop, immunofluorescent (hvis) flekker og PCR analyse av Mitokondrielt DNA kopi tall14,15, 16. mens immunoblot kan kvantitativt sammenligne protein nivå over forskjellige prøver og elektron eller hvis mikroskopi kan visualisere morfologiske kjennetegnene av disse organeller17, disse analyser bærer visse tekniske ulemper. For eksempel er det tidkrevende å skaffe tilstrekkelig antall celle bilder med høy forstørrelse og oppløsning eller sammenligne uttrykk nivåene av et protein på tvers av dusinvis av prøver, gjør disse analyser anses å være lav overføringshastighet metoder. Videre kan disse analyser brukes homogen celle befolkningen, som linjer, men ikke vevsprøver som består av blandet populasjoner.
Det er også vanskelig å bruke disse analyser på sjeldne befolkninger, som kravet til minimal celle tall fra 106 til 108 er umulig å oppfylle. Endelig er cellene vanligvis lysed eller fast under prosessen, slik at de er ikke kompatibel med andre metoder for å trekke ut ytterligere informasjon. Sammenlignet med tradisjonelle metoder, lysstoffrør-baserte flowcytometri har en relativt høy gjennomstrømning - informasjonen på alle cellene i et utvalg består av blandet celle populasjoner kan analyseres og samlet samtidig. I tillegg kan oppdage mer enn 10 parameterne i samme celle og sortere cellene basert på ønsket fenotyper for videre analyser. Reaktiv fluorescerende sonder har blitt brukt til å merke lysosomer og mitokondrier i levende celler og kan oppdages av flyt cytometri18,19. Disse organelle-spesifikke sonder har celle permeabel og fysikalsk-kjemiske egenskaper som tillater dem å være konsentrert i bestemte subcellular steder eller organeller. Beleilig, disse sonder er tilgjengelig i ulike fluorescerende formater, dermed aktivere programmet for multicolor analyse.
Denne protokollen beskriver i detalj hvordan kombinere overflaten markør flekker med lysosome - eller mitokondrier-spesifikk fargestoffer til etiketten lysosomer eller mitokondrier i live celler. Dette er spesielt nyttig for prøver fra primære vev og organer, som ofte består av ulike celle populasjoner. Forskere kan identifisere celle populasjoner av interesse av deres overflate markør uttrykk og spesielt måle lysosomale eller mitokondrie innholdet gjennom organelle-spesifikke fargestoffer i disse cellene. Her viser vi detaljerte fremgangsmåten flyt cytometric analyse som evalueres lysosomale eller mitokondrie massen i store splenic T celle subpopulasjoner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:763px;" width="762">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10 cm Graefe forceps (straight and serrated)</td>
			<td style="width:179px;">Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)</td>
			<td>Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:179px;">TERUMO&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">6 cm Petri dish</td>
			<td style="width:179px;">&#945;-plus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">SPL Lifesciences</td>
			<td style="width:119px;">93070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ammonium chloride (NH4Cl) &#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9434</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD25</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">102007</td>
			<td style="width:167px;">Clone:PC61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD4</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100453</td>
			<td style="width:167px;">Clone:GK1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD44</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">103029</td>
			<td style="width:167px;">Clone:IM7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD62L</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">104407</td>
			<td style="width:167px;">Clone:MEL-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD8</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100713</td>
			<td style="width:167px;">Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse TCR&#946;</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">109233</td>
			<td style="width:167px;">Clone:H57-579</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:179px;">Bio basic</td>
			<td style="width:119px;">6381-92-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352052</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2)</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HB-197&#12288;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:179px;">Hyclone</td>
			<td>ATD161145</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flowjo, LLC</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">LysoTracker Green DND26</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MEM Non-essential amino acids (100X)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MitoTracker Green FM</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M7514</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:179px;">J.T.baker</td>
			<td style="width:119px;">298-14-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25535-16-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">RPMI 1640 medium (powder)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>31800089</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells

T celler benytte ulike metabolske programmer å matche sine funksjonelle behov under differensiering og spredning. Mitokondrier er avgjørende cellulære komponenter ansvarlig for å forsyne celle energi; imidlertid produserer overflødig mitokondrier også reaktive oksygen arter (ROS) som kan føre til celledød. Antall mitokondrier må derfor stadig justeres for å passe behovene til cellene. Denne dynamiske forskriften oppnås delvis gjennom funksjonen lysosomer som fjerne overskudd/skadet organeller og makromolekyler. Derfor er mobilnettet mitokondrie og lysosomale innholdet nøkkelindikatorer evaluere metabolske justering av celler. Med utviklingen av sonder for organeller blir godt karakterisert lysosome eller mitokondrier-spesifikke fargestoffer tilgjengelig i ulike formater å merke mobilnettet lysosomer og mitokondrier. Flerfarget flowcytometri er et felles verktøy til profil celle fenotyper, og har muligheten til å bli integrert med andre analyser. Her presenterer vi detaljerte protokollen hvordan kombinere organelle-spesifikke fargestoffer med overflate markører flekker for å måle hvor mye lysosomer og mitokondrier i ulike T celle populasjoner på en flyt cytometer.

Identifikasjon av store T-celle delsett i milten og thymus
I korte trekk var enkeltcelle suspensjoner fra milten og thymus lysed av røde blodlegemer, inkubert med 2.4G2 nedbryting, etterfulgt av organelle-spesifikke fargestoff og overflate markør farging med fluorescens-konjugerte antistoffer (tabell 1). Utviklingsmessige progresjon av thymocytes kan beskrives ved hjelp av antistoffer mot co r...

Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells at JoVE.com

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Denne artikkelen beskriver en kraftig metode for å kvantifisere mitokondrier eller lysosomer i levende celler. Kombinasjonen av lysosome - eller mitokondrier-spesifikk fargestoffer med fluorescently konjugert antistoffer mot overflate markører lar kvantifisering av disse organeller mikset-celle bestander, som primær celler høstet fra vevsprøver, ved hjelp av flerfarget flowcytometri.

Flerfarget flyt cytometri-baserte kvantifisering av mitokondrier og lysosomer i T-celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Denne metoden kan hjelpe oss med å svare på viktige spørsmål i immunmetabolismefeltet. Fordelen med denne teknikken er at den tillater kvantifisering av mitokondrier eller lysosomer i individuelle levende celler, i en kompleks blanding av forskjellige celletyper. Denne metoden for å studere T- og B-celler kan også brukes på mange andre celletyper som makrofager, dendrittiske celler eller noen primære celler høstet fra en vevsprøve.Prosedyren vil bli demonstrert av Chin-Wen Wei, en utdannet student fra laboratoriet mitt. For å merke organeller for kvantifisering, først legge til en ganger ti til den sjette musen T-celler til en rund bunn faksrør per markør. Og pellet cellene ved sentrifugering.forhåndsvarmet til 37 grader Celsius serumfri kultur medium for å fortynne organelle spesifikke sonde lager løsninger til endelige arbeidskonsentrasjoner i mediet. Og re-suspendere cellene i 100 mikroliter sonde fargestoff per rør. Deretter inkuberer cellene i en cellekulturinkubator for riktig fargingsperiode, og stopper reaksjonen på slutten av inkubasjonen med en milliliter iskald faksbuffer per rør.Deretter samler cellene med en annen sentrifugering og re-suspendere pellets i 100 mikroliter av pre-titrert 24G2 hybridoma supernatant på is. Etter ti minutter legger du til én milliliter faksbuffer per rør. Samle cellene ved sentrifugering og merk cellene med 50 mikroliter av den forhåndstiterte fluorescenskonjugert antistoffcocktail av interesse.Tilsett riktig konsentrasjon i henhold til tabellen. Og faksbuffer i 20 minutter på is, beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen legger du til én milliliter faksbuffer per rør.Samle cellene ved sentrifugering. Og re-suspendere cellene i 300 mikroliter av faksbuffer supplert med ett mikrogram per milliliter propidiumjodid. Umiddelbart etter å ha lagt til kjernefysisk og kromosom motvirke, slå på strømmen cytometer analyse datamaskin, flyt cytometer, faks oppkjøp programvare, og andre tilbehør enheter avhengig av maskinen plattformen.Kjør PBS gjennom systemet i omtrent ett minutt for å sikre at strømningslinjen er fylt med PBS og sheathe buffer. Åpne et nytt eksperiment og angi cytometerparametrene i henhold til produsentens instruksjoner. Filtrer cellene gjennom en 70 mikrometercellesil.Og vortex før oppkjøpet av hver prøve for å unngå klumper og dobbeltformasjon. Åpne innstillingen For automatisk kompensasjon, og opprett punktplott for hver fluorescerende parameter. Etter at alle spenningene er innstilt, justerer du kompensasjonen og bruker kompensasjonen på prøvene.Opprett en fremover scatter versus side scatter plot og optimalisere spenningene slik at cellene av interesse vises i plottet. Lag en fremover scatter versus fremover scatter høyde plott og gate enkeltcellene. Lag et fremoverspøtområde versus sidespøtområdeplott og gate lymfocytter.Lag et spredt område fremover versus propidiumjodidplott og gate de levende cellene. Etter at alle spenningene er innstilt, justerer du kompensasjonen og bruker kompensasjonen på prøvene. Last deretter det første prøverøret, lag de riktige celleoverflatemarkørplottene, og samle minst 1000 hendelser av befolkningen av interesse.Når alle prøvene er kjørt, eksporterer du flytdataene for senere analyse. Og lagre eksperimentet som en mal for å bevare cytometerinnstillingene og parametrene for lignende eksperimenter i fremtiden. Endelig sted mitokondrieinnhold er det laveste i dobbelt negativt en T-celler, topp på dobbel negativ stadium to og tre, og litt nedgang i dobbelt negativ stadium fire.Med doble positive thymocytes som viser høyere antall mitokondrier enn CD4 og CD8 enkeltpositive tyrocytter, noe som tyder på at mitokondrieinnholdet svinger under utviklingen. CD4 og CD8 enkeltpositive tyrocytter viser en høyere mitokondrie gjennomsnittlig fluorescensintensitet enn milt CD4- eller CD8 T-celler, noe som tyder på at naive T-celler som resirkulerer i det oksygenrike blodmiljøet har en enda lavere mitokondriemasse enn tymocytter. Interessant, denne reduksjonen av mitokondrieinnhold er mer fremtredende i CD8 enn CD4 T celle avstamning, og T celle aktivering reduserer ytterligere tilstedeværelsen av disse organeller.Relativt lavt, men påviselig, lysosomalt innhold observeres i alle thymocyte populasjoner, med en mer fremtredende tilstedeværelse i doble negative thymocytes. I periferien oppdages et relativt høyt antall lysosomer i minne og effekteller CD8 positive T-celler. Kombinere organelle spesifikke fargestoffer og overflatemarkør med strømningscytometri er en kraftig måte å karakterisere metabolsk status for celler i en kompleks blanding.Ekstra organellespesifikt fargestoff kan brukes til å oppdage endoplasmatisk reticulum, autophagic vacuole eller andre intracellulære rom av interesse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Endring av primære humane T celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Bruk av flowcytometrisystemer å vurdere tilstanden til Chromatin i T-celler

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flowcytometri basert analyse for overvåking av NK cellefunksjoner

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdere Netthinne microglial fagocyttfunksjon<em&gt; I Vivo</em&gt; Ved hjelp av en flowcytometrisystemer basert analyse

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolasjon og Flowcytometriske analyse av endocervikale Gamma Delta T-celler

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

En flyt cytometri-baserte cytotoksisitet analysen for vurdering av menneskelig NK celle aktivitet

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Kvantifisering av voksende Human antigen-spesifikke CD4+ T celler bruke Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolering av mus nyre-resident CD8+ T celler for Flow Cytometry Analyse

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...