Name: multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells
Uploaded: 2019-01-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells at JoVE.com

Bu iletişim kuralı geliştirilmesi hibe Tayvan Bakanlığı Bilim ve teknoloji (en) NSC103-2320-B-010-002-MY2 ve MOST104-2628-B-010-002-MY4 CL Hsu tarafından desteklenmiştir. CW Wei mükemmel Tez Ödülü, Enstitüsü Mikrobiyoloji ve İmmünoloji, Ulusal Yang Ming Üniversitesi bir alıcı var.

Burada açıklanan fare doku hasat yordam kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Ulusal Yang Ming Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. lenfosit süspansiyon lenfoid organlar üzerinden hazırlanması
<ol><li>CO2 inhalasyon servikal çıkığı tarafından ölüm emin olmak için takip bir şeffaf akrilik odasında gibi onaylı bir yöntem tarafından fare ötenazi. Not: CO2 dakikada bir % 20 deplasman odası ve Hayır 5 psi (inç kare başına...

<ol>
	<li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li><li>Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+metabolic+reprogramming+in+proliferating+cells:+implications+for+T-cell-mediated+immunity.">Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity.</a> Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).</li><li>Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+essential+for+mitochondrial+clearance+in+mature+T+lymphocytes.">Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).</li><li>Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Control+and+Guidance+of+Cellular+Activities+of+T+Cells.">Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells.</a> Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).</li><li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitophagy.">Mechanisms of mitophagy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).</li><li>Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fern&#225;ndez Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+adventures+at+the+organelle+society.">Mitochondrial adventures at the organelle society.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).</li><li>Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+Lysosomes:+Discovering+Bonds.">Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).</li><li>McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+and+PINK1+function+in+a+vesicular+trafficking+pathway+regulating+mitochondrial+quality+control.">Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control.</a> The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).</li><li>Wrighton, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism:+Mitophagy+turns+beige+adipocytes+white.">Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).</li><li>Altshuler-Keylin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+Adipocyte+Maintenance+Is+Regulated+by+Autophagy-Induced+Mitochondrial+Clearance.">Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance.</a> Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).</li><li>Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+lysosome:+a+control+centre+for+cellular+clearance+and+energy+metabolism.">Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).</li><li>Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+roles+of+lysosomal+acid+lipase+in+T+cell+development+and+function.">Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function.</a> The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).</li><li>Wei, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrative+Nucleoside+Transporter+3+Regulates+T+Cell+Homeostasis+by+Coordinating+Lysosomal+Function+with+Nucleoside+Availability.">Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability.</a> Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).</li><li>Baixauli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Respiration+Controls+Lysosomal+Function+during+Inflammatory+T+Cell+Responses.">Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses.</a> Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).</li><li>Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcription+factor+A+induction+by+redox+activation+of+nuclear+respiratory+factor+1.">Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+association+of+the+proapoptotic+protein+Bim+with+Bcl-2-related+proteins+on+mitochondria+in+T+cells.">Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).</li><li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+mechanisms,+pathophysiological+roles,+and+analysis.">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li><li>van der Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+memory+T+cells+have+a+bioenergetic+advantage+that+underlies+their+rapid+recall+ability.">CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).</li><li>Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Lyso+dyes:+A+flow+cytometric+study+of+autophagy.">Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy.</a> Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).</li><li>Allan, A. L., Keeney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+analysis:+technical+and+statistical+considerations+for+application+to+the+clinic.">Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic.</a> Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).</li><li>Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+3+tolerant+CD8+T+cells+degranulate+in+response+to+antigen+but+lack+granzyme+B+to+mediate+cytolysis.">Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis.</a> The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).</li><li>Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+cytotoxicity+but+not+degranulation+distinguishes+effector+and+memory+subsets+of+CD8++T+cells.">Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).</li><li>Van den Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dysfunction+Prevents+Repolarization+of+Inflammatory+Macrophages.">Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages.</a> Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).</li><li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+metabolism.">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li><li>Dugnani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+T+cell+metabolism+in+cancer+immunotherapy.">Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).</li><li>Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+metabolism+in+autoimmune+disease.">T-cell metabolism in autoimmune disease.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 17 (1), 29 (2015).</li></ol>

Bu iletişim kuralı organel özel boyalar ve yüzey marker mitokondri veya organellerin farklı T hücre Nüfus miktarını ölçmek için boyama birleştirir. Bu yöntem elektron mikroskobu ve immunoblot analiz gibi geleneksel yöntemleri için hücre sayısı ve homojenliği gereksinimleri sınırlamayı aşmak için geliştirilmiştir. Nadir hücre popülasyonlarının analiz ve aynı anda birden çok hücre tipleri aynı zamanda incelenmesi özellikle yararlıdır.
İşlem süresi ve kulu...

Harekete geçirmek ve T hücrelerin çoğalması başarılı bağışıklık yanıtı montaj için önemli adımlardır. Son gelişmeler hücresel metabolizma sıkıca geliştirme ve T hücrelerinin işlevleri ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Örneğin, saf T hücreleri büyük ölçüde Oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ikincil lenfoid organlar arasında devridaim sırasında enerji talebi karşılamak için güveniyor. Harekete geçirmek, saf T hücreleri ciddi metabolik, aerobik glikoliz ATP üretimi artırmak için ve hücre farklılaşma ve yayılması sırasında muazzam metabolik talepleri yerine getirmek için indüksiyon dahil olmak üzere yeniden programlama tabi. Metabolik ihtiyaçları ile takip etmek başarısız hücreleri ölmek apoptosis1,2. Metabolik yeniden sırasında programlama mitokondri önemli roller organelleri ATP hücrenin enerji sağlamak için üretim büyük ölçüde sorumlu olduklarını ve metabolik anahtarları sırasında hücresel mitokondri içeriği değişir bu yana oynamak T hücre gelişimi ve harekete geçirmek3. Ancak, gereksiz ya da zarar mitokondri birikimi yağlar, proteinler ve DNA zarar ve sonunda ölüm4 hücre için yol açabilir aşırı ROS üretebilir
Metabolik değişiklikler sonucu aşırı ya da zarar mitokondri autophagy5mitophagy bilinen, özel bir tür tarafından kaldırılır. Mitokondri autophagosomes tarafından sarılmış ve bozulması için organellerin ile erimiş. Bu mitokondri arasındaki iletişimi kapatın ve organellerin büyük ilgi6,7oluşturmuş. Örneğin, oksidatif stres mitokondri organellerin fosfataz ve tensin homolog (PTEN) bozulması için hedeflenen mitokondri kaynaklı veziküller (MDVs) oluşturmak için uyarır-sözde kinaz 1 (PINK1) indüklenen ve parkin (bir E3 Ubikuitin ligaz) bağımlı bir şekilde8. Bu da o mitophagy bej beyaz adipocyte geçiş9,10için gerekli bulundu. Daha da önemlisi, organellerin sadece bir bozulma bölme değildir, ancak aynı zamanda hücresel sinyal bir regülatör. Enzim eksiklikleri nedeniyle aşırı substrat birikimi lizozomal disfonksiyonu lizozomal membran geçirgenliği kesintiye tarafından sonuçlar ve Ca2 + homeostazı11etkiler. T hücre fonksiyonel kusurları lizozomal asit lipaz (LAL)12 veya lizozomal metaboliti ışınlama nakavt fare modeli13 daha fazla T hücre homeostazı korumada organellerin önemini gösterdi. Mitokondri ve organellerin hücresel metabolik regülasyon ayrılmaz parçalarıdır. Bu yüzden, ölçüm-in hücresel mitokondrial içerik T hücre metabolik ve fonksiyonel durumu değerlendirmek için çok önemli bir göstergesi olmuştur.
Hücresel mitokondrial veya lizozomal içeriği ölçmek için yaygın olarak kullanılan deneyleri dahil immunoblot, elektron mikroskobu, immünfloresan (Eğer) boyama ve PCR analizleri mitokondrial DNA kopya sayıları14,15, 16. immunoblot kantitatif protein düzeyleri farklı örnekleri ve elektron veya mikroskobu bu organelleri17morfolojik işaretlerinden görselleştirebilirsiniz arasında mukayese edebilirsiniz iken, bu deneyleri teknik bazı dezavantajları ayı. Örneğin, zaman alıcı yeterli sayıda hücre imge ile yüksek büyütme ve çözünürlük elde etmek için veya bir protein ifade seviyede iş hızı düşük yöntemleri olarak kabul bu deneyleri yapma örnekleri, onlarca arasında karşılaştırmak için bu. Ayrıca, bu deneyleri homojen hücre nüfus, hücre hatları gibi ama değil karışık nüfus oluşan doku örnekleri yalnızca uygulanabilir.
Nadir nüfus için en az hücresi şartı numaraları 10'dan, bu deneyleri uygulamak zordur6 -108 karşılamak imkansız. Son olarak, hücreleri genellikle lysed veya onları daha fazla bilgi almak için diğer yöntemleri ile uyumlu yapma işlemi sırasında sabit. Geleneksel yöntemlere göre floresan tabanlı akış sitometresi nispeten yüksek üretilen iş sahip - analiz ve aynı anda toplanan tüm hücrelerin bir örnek içinde oluşan karma hücre nüfus bilgileri. Buna ek olarak, bir aynı hücre üzerinde 10'dan fazla parametre algılayabilir ve daha fazla deneyleri için istenen fenotipleri dayalı hücreleri sıralamak. Reaktif floresan problar organellerin ve canlı hücrelerde mitokondri etiketlemek için kullanılan ve akış sitometresi18,19tarafından algılanabilir. Bu organel özgü sonda hücre geçirgen vardır ve belirli hücre altı konumları veya organelleri konsantre oldum kurmalarına izin fiziko-kimyasal özelliklere sahip. Elverişli bir konuma sahip, bu probları böylece onların uygulama çok renkli analiz için etkinleştirme çeşitli biçimlerde floresan, uygundur.
Bu iletişim kuralı ayrıntılı olarak anlatılmaktadır nasıl lysosome veya mitokondri özel boyalar için etiket organellerin ile boyama yüzey marker birleştirmek veya hücreleri mitokondri içinde yaşamak. Bu birincil doku ve organlar, kez türdeş olmayan hücre popülasyonlarının oluşan üretilen örnekler için özellikle yararlıdır. Araştırmacılar hücre popülasyonlarının ilgi onların yüzey marker ifade tarafından tanımlayabilir ve özellikle bu hücrelerde organel özel boyalar ile lizozomal veya mitokondrial içeriği ölçmek. Burada, biz büyük dalak T hücre altgrupları lizozomal veya mitokondrial Große değerlendirir akış sitometrik analizin ayrıntılı yordam göstermek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:763px;" width="762">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10 cm Graefe forceps (straight and serrated)</td>
			<td style="width:179px;">Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)</td>
			<td>Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:179px;">TERUMO&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">6 cm Petri dish</td>
			<td style="width:179px;">&#945;-plus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">SPL Lifesciences</td>
			<td style="width:119px;">93070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ammonium chloride (NH4Cl) &#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9434</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD25</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">102007</td>
			<td style="width:167px;">Clone:PC61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD4</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100453</td>
			<td style="width:167px;">Clone:GK1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD44</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">103029</td>
			<td style="width:167px;">Clone:IM7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD62L</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">104407</td>
			<td style="width:167px;">Clone:MEL-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD8</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100713</td>
			<td style="width:167px;">Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse TCR&#946;</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">109233</td>
			<td style="width:167px;">Clone:H57-579</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:179px;">Bio basic</td>
			<td style="width:119px;">6381-92-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352052</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2)</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HB-197&#12288;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:179px;">Hyclone</td>
			<td>ATD161145</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flowjo, LLC</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">LysoTracker Green DND26</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MEM Non-essential amino acids (100X)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MitoTracker Green FM</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M7514</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:179px;">J.T.baker</td>
			<td style="width:119px;">298-14-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25535-16-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">RPMI 1640 medium (powder)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>31800089</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells

T hücreleri farklı metabolik programlarının farklılaşma ve yayılması sırasında fonksiyonel kendi ihtiyaçlarına uygun kullanmaktadır. Mitokondri çok önemli hücresel bileşenleri hücre enerji sağlamak için sorumlu vardır; Ancak, aşırı mitokondri Ayrıca reaktif oksijen türleri (ROS) hücre ölümüne neden olabilir üretmek. Bu nedenle, mitokondri sayısı sürekli hücreleri ihtiyaçlarınıza uygun şekilde ayarlanması gerekir. Bu dinamik yönetmelik kısmen artı/hasarlı organelleri ve oluştururlar kaldırmak organellerin işlevi elde edilir. Bu nedenle, hücresel mitokondrial ve lizozomal içeriği hücre metabolik ayarlama değerlendirmek için anahtar göstergeler vardır. Probları organelleri için gelişmesiyle birlikte, iyi karakterize lysosome veya mitokondri özel boyalar hücresel organellerin ve mitokondri etiketlemek için çeşitli biçimlerde kullanılabilir hale gelmiştir. Çok renkli akış sitometresi profil hücre fenotipleri için ortak bir araç ve diğer deneyleri ile entegre olmak için yeteneği vardır. Burada, bir akış sitometresi organellerin ve mitokondri farklı T hücre Nüfus miktarını ölçmek için boyama yüzey imleçli organel özel boyalar birleştirmek nasıl ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut.

Büyük T hücre alt kümeleri dalak ve timus tanımlaması
Kısaca, tek hücre süspansiyonlar dalak ve timus kırmızı kan hücreleri lysed, 2.4G2 süpernatant ile inkübe, organel özel boya ve ile antikor (Tablo 1) Floresan Birleşik boyama yüzey marker izledi. Timositleri gelişimsel ilerleme antikorlar Co reseptörleri kullanarak tanımlanabilir CD4 ve CD8. En olgun timositleri CD4 veya ...

Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells at JoVE.com

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Bu makalede mitokondri veya canlı hücrelerde organellerin ölçmek için güçlü bir yöntem gösterilmektedir. Primer hücre kullanarak doku örnekleri, hasat gibi karma hücre nüfus bu organelleri miktar lysosome veya mitokondri özel boyalar yüzey işaretleyicileri karşı fluorescently konjuge antikorlar ile kombinasyonu sağlar çok renkli akış sitometresi.

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Bu yöntem, immüno-metabolizma alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı, farklı hücre tiplerinin karmaşık bir karışımı nda, tek tek canlı hücrelerde mitokondri veya lizozomların sayısallaştırılmasına olanak sağlamasıdır. T ve B hücrelerini incelemek için kullanılan bu yöntem, makrofajlar, dendritik hücreler veya doku örneğinden alınan birincil hücreler gibi diğer birçok hücre tipine de uygulanabilir.Prosedür, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Chin-Wen Wei tarafından kanıtlanacak. Sayısallaştırma için organelleri etiketlemek için, ilk olarak, işaretçi başına bir yuvarlak alt faks tüpüne altıncı fare T hücrelerine bir kez on ekleyin. Ve santrifüj ile hücreleri pelet.37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış serumsuz kültür ortamı, organel ekibe özgü prob stok çözeltilerini ortamdaki son çalışma konsantrasyonlarına seyreltmek için kullanılır. Ve tüpler başına 100 mikrolitre probu boyasında hücreleri yeniden askıya alın. Daha sonra, uygun boyama dönemi için bir hücre kültürü kuluçka hücreleri kuluçka, tüp başına buz gibi faks tampon bir mililitre ile kuluçka sonunda reaksiyonu durdurarak.Sonra, başka bir santrifüj ile hücreleri toplamak ve önceden titremiş 24G2 hibridoma supernatant buz üzerinde 100 mikrolitre pelet yeniden askıya. On dakika sonra, tüp başına faks tampon bir mililitre ekleyin. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve ilgi önceden titremiş floresan kontrküllü antikor kokteyl 50 mikrolitre ile hücreleri etiket.Tabloya göre uygun konsantrasyonu ekleyin. Ve faks tamponu 20 dakika boyunca buzda, ışıktan korunuyor. Kuluçka sonunda, tüp başına faks tampon bir mililitre ekleyin.Santrifüj ile hücreleri toplayın. Ve 300 mikrolitre lik faks tamponundaki hücreleri mililitre de propidium iyodür başına bir mikrogramla yeniden askıya alın. Nükleer ve kromozom karşılemi ni ekledikten hemen sonra, akış sitometre analiz bilgisayarını, akış sitometresini, faks edinme yazılımını ve makine platformuna bağlı olarak diğer aksesuar cihazlarını açın.Akış çizgisinin PBS ile dolu olduğundan ve tamponu sabitlemediğinden emin olmak için PBS'yi yaklaşık bir dakika boyunca sistemde çalıştırın. Yeni bir deneme açın ve sitometre parametrelerini üreticinin talimatlarına göre ayarlayın. Hücreleri 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin.Ve girdap önce her örnek elde kümeleri ve doublet oluşumunu önlemek için. Otomatik Telafi ayarını açın ve her floresan parametre için nokta çizimleri oluşturun. Tüm gerilimler ayarlandıktan sonra, tazminatı ayarlayın ve telafiyi numunelere uygulayın.Yan dağılım çizimine karşı ileri bir dağılım oluşturun ve ilgi hücrelerinin çizim içinde görünmesi için gerilimleri optimize edin. İleri dağılım adağı ile ileri dağılım yüksekliği çizimi oluşturun ve tek hücreleri kapama. Yan dağılım alanı arsa karşı bir ileri dağılım alanı oluşturun ve lenfositler kapısı.Propidium iyodür çizimine karşı bir ileri dağılım alanı oluşturun ve canlı hücreleri kapayın. Tüm gerilimler ayarlandıktan sonra, tazminatı ayarlayın ve telafiyi numunelere uygulayın. Daha sonra ilk örnek tüpü yükleyin, uygun hücre yüzeyi işaretçisi çizimlerini oluşturun ve ilgi çeken nüfusun en az 1.000 olayını toplayın.Tüm örnekler çalıştırıldığında, sonraki çözümleme için akış verilerini dışa aktarın. Ve gelecekte benzer deneyler için sitometre ayarlarını ve parametreleri korumak için denemeyi şablon olarak kaydedin. Son site mitokondriyal içerikçift negatif bir T hücrelerinde en düşük, çift negatif evre iki ve üç zirve, ve biraz çift negatif evre dört azalma.Cd4 ve CD8 tek pozitif timositlere göre mitokondri sayısının daha yüksek olduğunu gösteren çift pozitif timositler ile mitokondriyal içeriğinin gelişim sırasında dalgalandığını düşündürmektedir. CD4 ve CD8 tek pozitif timositler, splenik CD4 veya CD8 T hücrelerinden daha yüksek mitokondriyal ortalama floresan yoğunluğu sergilerler ve oksijen açısından zengin kan ortamında dolaşan naif T hücrelerinin timositlerden daha düşük mitokondriyal kütleye sahip olduğunu düşündürmektedir. İlginçtir, mitokondriyal içeriğin bu azalma CD4 T hücre soyundan daha CD8 daha belirgindir, ve T hücre aktivasyonu daha bu organellerin varlığını azaltır.Tüm timosit popülasyonlarında nispeten düşük, ancak saptanabilen, lisozomal içerikler gözlenir ve çift negatif bir timositte daha belirgin dir. Çevrede bellek ve efektör CD8 pozitif T hücrelerinde nispeten yüksek sayıda izozom tespit edilir. Organel spesifik boyalar ve yüzey belirteci ile akış sitometrisi birleştirilmesi karmaşık bir karışım hücrelerin metabolik durumunu karakterize etmek için güçlü bir yoldur.Ek organel spesifik boya endoplazmik retikulum tespit etmek için kullanılabilir, otophagic vakuol, veya ilgi diğer hücre içi bölmesi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Rhesus Makak maymunlarının Hücresel Bağışıklık Tepkisi Multicolor Sitometrisi Analizleri

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Akış Sitometrinin Kullanımı T Hücrelerinde Kromatin Devleti değerlendirmek için

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Akış NK Hücre Fonksiyonları İzleme Testi Sitometri tabanlı

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Proliferasyon ınsan antijeni spesifik CD4+ T hücrelerinin Karboksflorcein Succinimidyl Ester kullanarak ölçülmesini

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...