Name: establishment of viral infection and analysis of host-virus interaction in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-03-14T13:30:00
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我们要感谢 ips 中的整个泛实验室。Cas。我们感谢王兰峰博士 (中国科学院 ips) 的实验协助和戈纳洛·科多娃·斯泰格博士 (斯普林格自然)、杰西卡·瓦尔加斯博士 (ips, 巴黎) 和朱生博士 (ips, 巴黎) 的评论。这项工作得到了中国科学院战略优先研究方案对 l. p (xda13010500) 和 h. t (xdb29030300)、中国国家自然科学基金至 l. p (338887 和 31870887) 和 j. y (31870887) 的资助。l. p 是中科院青年创新促进会会员 (2012083)。

注: 在开始实验之前, 所使用的细胞系和苍蝇库存不得受到其他病原体的污染, 特别是对于 dcv、fhv、果蝇 x 病毒 (dxv) 和禽流感病毒 (anv) 等病毒。理想情况下, rna 测序或更简单的基于 pcr 的识别用于检测污染 10,45。如果发生污染, 细胞系和苍蝇库存不应再使用, 直到它们完全净化46。
1. 病毒和飞行准备
<ol><li>病...

在这篇文章中, 我们提出了一个详细的程序, 如何建立一个病毒感染系统的成人果蝇使用纳米注射。这些协议包括准备适当的飞线和病毒储备、感染技术、评估感染指标和测量抗病毒反应。虽然 dcv 被用作病毒病原体的例子, 但数十种不同的病毒已成功地应用于食人鱼系统的研究。此外, 通过对苍蝇进行大规模筛查, 还发现了数百种监管因素, 无论是病毒还是宿主。因此, 这种方法适应性强, 不?...

新出现的病毒感染, 特别是基孔肯雅病毒 1、登革热病毒、黄热病病毒2和寨卡病毒3等弓形虫病毒, 通过引起大流行病, 对公众健康构成巨大威胁4. 因此, 更好地了解病毒与宿主的相互作用对于流行病控制和人类病毒性疾病的治疗变得越来越重要。为此, 必须建立更适当和更有效的模型, 以调查病毒感染的机制。
果蝇,果蝇 (d. 黑色素母细胞), 为研究病毒宿主相互作用5,6提供了一个强大的系统, 并已被证明是研究人类病毒性疾病的最有效的模型之一7,8,9. 高度保守的抗病毒信号通路和无与伦比的遗传工具使苍蝇成为一个很好的模型, 能够产生对人类抗病毒研究具有真正影响的显著结果。此外, 苍蝇在实验室维护起来容易, 价格低廉, 在感染期间, 很方便地大规模筛选新的调节因子6,10和宿主。
最近, 在嗜酸性粒细胞中, 研究了四种主要的高度保守的抗病毒途径 (例如 rna 干扰 (rnai) 通路11、JAK-STAT 通路12、nf-b 通路和自体吞噬通路13)年6。rnai 途径是一种广泛的抗病毒机制, 可以抑制大多数类型的病毒感染6,14。由双宁-2 (dcr-2)或 Argonaute 2 (ago2 ) 等基因突变破坏这一途径可导致病毒滴度和宿主死亡率增加 15, 16,17.jak-stat 途径与控制来自双星科和黄曲霉家族的病毒感染昆虫有关,例如, 16岁苍蝇中的果蝇 c 病毒 (dcv) 和西尼罗河病毒 (wnv)并且登革热病毒在蚊子18,19。五音龙(同源于人类的 nf-b 途径) 和免疫缺陷 (imd) 途径 (类似于人类 nf-b 和 tnf 途径) 都参与了病毒入侵20,21, 22. 自食其力是另一种在病毒感染的调节中被保护的机制, 在德罗菲拉23,24中有很好的特点。因此, 可以很容易地识别这些途径的新调控因素, 并在这些抗病毒信号转接和其他生物途径 (如代谢、衰老、神经反应等) 之间进行解剖系统。
虽然果蝇中最成熟的病毒感染模型是由 rna 病毒诱导的, 但无脊椎动物的虹彩病毒 6i (iv-6) 和 kallithea 病毒的感染表明了研究苍蝇中 dna 病毒的潜力25 26岁此外, 该病毒也可以修改, 以允许感染嗜德维塔, 如流感病毒9。这极大地扩大了食人鱼筛选平台的应用。在这个过程中, 我们使用 dcv 作为一个例子来描述如何在嗜德维拉开发病毒感染系统。dcv 是一种正感单链 rna 病毒, 约9300核苷酸, 编码 9蛋白 27。dcv 作为d. 黑色素瘤的一种天然病原体, 被认为是研究宿主在宿主-病毒相互作用和共同进化过程中生理、行为和基础免疫反应的合适病毒28。此外, 它在野生苍蝇感染后的快速死亡率使 dcv 有助于筛选宿主29中的耐药或易感基因。
然而, 在研究嗜德维拉病毒感染时, 有几个方面值得关注。例如, 共生细菌wolbachia有能力抑制不同谱的 rna 病毒在德洛菲拉和蚊子30,31,32。最近的证据表明,沃尔巴奇亚通过宿主33中甲基转移酶 mt2 表达的提高阻断了 sindbis 病毒 (sinv) 感染的一种可能机制.此外, 昆虫的遗传背景对病毒感染也至关重要。例如,松柏基因中的自然多态性决定了五合34、35 对 dcv感染的易感性, 而ubc-e2h和cg892的位点分别参与了板球麻痹病毒 (crpv) 和羊群屋病毒 (fhv) 感染 36.
建立苍蝇中病毒宿主相互作用的特殊方法, 必须根据研究目的进行选择, 例如对果蝇细胞系 37、38、口服中的宿主细胞成分进行高通量筛选感染研究肠道特异性抗病毒反应22,39,40, 针刺41,42或纳米注射通过上皮屏障, 以刺激全身免疫反应。纳米注射能精确控制病毒剂量, 诱导受控抗病毒反应和生理病变43, 从而保证高实验重现性44。在这项研究中, 我们描述了一种纳米注射方法来研究果蝇中的病毒-宿主相互作用, 强调了苍蝇的背景效应的重要性。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22um filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 Replacement tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI 7500 qPCR system</td>
			<td>ABI</td>
			<td>7500</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MIR-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centriguge</td>
			<td>Eppendof</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centriguge</td>
			<td>Eppendof</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>151858</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95284-100ML</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Percival</td>
			<td>I-41NL</td>
			<td>Rearing Drosophila</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flat bottom 96-well-plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer (RNA extraction)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer (liquid sample RNA extraction)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10296028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td>Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive Film</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4360954</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plate</td>
			<td>ABI</td>
			<td>A32811</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9895</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>statistical software</td>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>TransScript</td>
			<td>AT301</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>VORTEX 3</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of viral infection and analysis of host-virus interaction in drosophila melanogaster

病毒传播是传染病的主要原因。因此, 了解病毒与宿主之间的相互作用对于扩大我们预防和治疗病毒感染的知识非常重要。果蝇被证明是最有效和最有生产力的模型生物之一, 以筛选抗病毒因子和调查病毒-宿主相互作用, 由于强大的遗传工具和高度保守的先天免疫信号通路。这里描述的程序演示了一种纳米注射方法, 以建立病毒感染, 并诱导在成年苍蝇的系统抗病毒反应。这种方法对病毒注射剂量的精确控制可实现较高的实验重现性。本研究描述的方案包括苍蝇和病毒的制备、注射方法、存活率分析、病毒负荷测量和抗病毒途径评估。本文提到了苍蝇背景对病毒感染的影响。这种感染方法易于执行, 可定量重复;它可用于筛查与病毒宿主相互作用有关的宿主病毒因子, 并对先天免疫信号与其他生物途径在病毒感染反应中的串扰进行解剖。

本节的结果是在 d. 黑色素瘤dcv 感染后获得的。图 1显示了嗜德维拉病毒感染的流程图。苍蝇被注射胸腔内, 然后采集样本测量病毒 tcid 50 和基因组 rna 水平 (图 1).病毒感染可诱导细胞裂解, 感染后3天观察到 cpe (图 2a)。cpe 检测仪测量的病毒负载与 qpcr 测量的病毒负载一致 (图 2b)。如图 3所示,沃尔巴奇亚抑制...

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Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

该方案介绍了如何建立病毒感染在果蝇体内使用纳米注射方法和基本技术, 以分析病毒宿主相互作用。

果蝇病毒感染的建立及宿主病毒相互作用分析

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

此方法可以帮助回答病毒宿主交互领域中有关如何有效建立嗜血杆菌黑色素病毒感染的关键问题。这种纳米注射方法允许精确控制病毒的感染剂量，并可以很容易地应用于与其他微生物病原体的感染。首先，每毫升生长1倍至第七个可行的S2星细胞，作为10厘米细胞培养皿中的松散、半粘附单层，10毫升完整的施耐德的果蝇培养皿，在25摄氏度下增加二氧化碳，一小时。在孵育过程中，将刚解冻的果蝇C病毒或DCV重新暂停至0.01的多种感染，在一毫升完整的培养基中，并添加病毒溶液到细胞培养皿。然后将板返回25摄氏度的孵化器，为期三至五天。当细胞形态看起来模糊且培养基中充满了指示细胞碎片的黑色颗粒时，病毒即可采集。在将整个细胞培养物转移到15毫升管中，在零下80摄氏度下对宿主细胞进行解合之前，通过移液将上一提液混合几次。为了产生病毒的工作浓度，在25摄氏度的水浴中解冻细胞悬浮液，在通过离心对细胞碎片进行造粒之前不断摇晃。然后将上流水液转移到一个新的无菌15毫升管中，用于涡流和每管高达200微升的病毒溶液。为了确定平均病毒组织培养感染剂量，首先将10倍至5个S2星细胞在100微升中成8孔，每列12排96孔板。然后将板返回 25 摄氏度的培养箱。从零下80摄氏度的储存中随机选择五管病毒。当细胞沉降时，用450微升无菌完整介质填充10个无菌1.5毫升微离心管，并将50微升病毒储存添加到含有450微升无菌完整介质的1.5毫升管中，每步稀释悬浮液10倍至第12井。在孵育结束时，在每根病毒管中，在每根培养的井中加入50微升，并将50微升无病毒的培养介质加入每列一井，作为负控制井。然后将板放在25摄氏度的培养箱中三天，并在光明场显微镜下以每天20倍的放大率评估每个病毒存量的细胞病变效应。将细胞看起来模糊的井和介质中充满片段的井分类为正井和细胞形态正常为负井的井。在育种之前，将每毫升四环素的400微升50微克与4克新鲜标准玉米粉飞食彻底混合，将食物在4摄氏度过夜，蒸发乙醇。第二天早上，将食物加热至室温，将食物放入20只雌性及10只新圈养的雄性成年苍蝇放入繁殖小瓶中，在25摄氏度和60%的湿度下，在正常的光/暗循环下进行3至4天的繁殖孵化。当有足够的卵子被下蛋后，在二氧化碳的轻流下收集新被封闭的成年苍蝇，再繁殖两次，就像刚刚证明的一样。经过三代四环素处理后，在二氧化碳的光流下收集五只苍蝇，用250微升的双蒸馏水和几根0.5毫米无菌陶瓷珠使苍蝇均匀。一分钟后，在样品中加入250微升2X缓冲器 A进行涡旋，然后将样品冻结在零下80摄氏度。接下来，在25摄氏度的水浴中快速解冻零下80摄氏度储存的样品，随后在70摄氏度的水浴中孵育30分钟，然后提取基因组DNA，然后根据标准协议通过聚合酶链反应放大DNA。确认每只苍蝇中缺少沃尔巴契亚16小RNA和wsp，根据标准协议，通过凝胶电泳均质。然后，在标准玉米粉飞食上饲养无沃尔巴契亚苍蝇库存，如所证明的。对于病毒感染，首先使用立体显微镜和薄钳将玻璃毛细针的尖端断裂到适当的直径进行纳米注射。要组装喷油器，请将天花板 O 形环和白色栅格放在喷油器的金属柱塞上，大酒窝朝外。使用装有 30 量针的注射器将玻璃针装满矿物油，然后将针头穿过衣领。将较大的 O 环放在从针头钝端约一毫米的衣领底座周围，然后将针头安装到喷油器的柱塞上。将针头固定到柱塞上，然后按下空按钮，将微注射器的柱塞伸出来，直到听到声音信号。现在按填充以缩回柱塞五毫米，将针头浸入 100 个斑块形成单元病毒悬浮液中。轻轻摇动一瓶或至少三瓶20沃尔巴奇亚无狼性雄性果蝇到注射盘上。雄性苍蝇在交配时优先，生殖可能会影响雌性。然后，在中索普勒拉和翼胸之间稍微浅的彩色区域注射每只苍蝇的50.6纳米色溶液，并测量细胞病变效应测定和从地面苍蝇定量RT PCR的DV负载，正如刚刚证明的。注射后，小心地将苍蝇转移到新鲜的小瓶中，将小瓶放在水平位置，以防止苍蝇在麻醉中恢复时粘附在介质上。注射是耗时的，但DCV复制是非常快速的，所以是非常重要的写下确切的时间在管上，一旦所有的苍蝇从每个小瓶已经注射。病毒感染可诱发细胞解解，在感染后三天观察到细胞病变效应。沃尔巴契亚 16s rRNA 和 wsp 底土器可用于检测沃尔巴奇亚和果蝇的存在，如证明。无沃尔巴奇亚苍蝇在DCV感染后以剂量依赖的方式表现出显著降低的存活率。DCV激活宿主中的抗病毒信号通路，这些通路对果蝇的抗病毒感染至关重要，而D者-2突变苍蝇的存活率下降和病毒载量增加就证明了这一点。在尝试此程序时，重要的是要记住，与沃尔巴契亚基因型的污染可能会影响果蝇黑色素素蝇的易感性到DV感染。按照这个程序，其他方法，如更大规模的基因筛查可以执行，以回答有关病毒感染或抗病毒反应所需的未定义的宿主基因的其他问题。该技术开发后，为人类病毒病领域的研究人员探索果蝇黑色素病模型中地方性人类病毒感染爆发机制铺平了道路。不要忘记，使用病毒可能非常危险，在执行此程序时，应始终采取预防措施，如佩戴适当的防护设备。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

富达的RNA病毒和病毒的突变频率的表征的变种的分离

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

科研

免疫与感染

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

解剖宿主 - 病毒相互作用模型疱疹病毒裂解性复制

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

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双光子活体显微镜感病毒感染时气管黏膜的影像细胞相互作用

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

肿瘤切片提取物的建立与分析是诊断检测的前提

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

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细胞培养和果蝇黑色素的氧化锌纳米颗粒的毒性研究

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...