Name: establishment of viral infection and analysis of host-virus interaction in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-03-14T13:30:00
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Nous tenons à remercier le laboratoire Pan entier en IPS. CAS. Nous remercions m. Lanfeng Wang (IPS, CAS) pour assistance expérimentale et Dr Gonalo Cordova Steger (nature Springer), Dr. Jessica VARGAS (IPS, Paris) et m. Seng Zhu (IPS, Paris) pour commentaires. Ce travail a été soutenu par des subventions du programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des Sciences à L.P (XDA13010500) et Haddad (XDB29030300), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine L.P (31870887 et 31570897) et Jean-Yves (31670909). L.P est membre de l’Association de Promotion de l’Innovation des jeunes CAS (2012083).

Remarque : Avant de commencer l’expérience, les lignées cellulaires et les stocks de mouche utilisées ne doivent pas être contaminés par d’autres agents pathogènes, en particulier pour les virus tels que DCV, FHV, Drosophila X virus (DXV) et le virus aviaire néphrite (ANV). Idéalement, le séquençage de RNA ou une identification plus simple basées sur la PCR sont utilisés pour détecter la contamination10,45. En cas de contamination, les lignées ...

Dans cet article, nous présentons une procédure détaillée sur la façon d’établir un système infectieux viral chez l' adulte Drosophila melanogaster à l’aide de nano-injection. Les protocoles comprennent la préparation de lignes mouches appropriées et stock de virus, techniques d’infection, l’évaluation des indicateurs infectieux et la mesure de la réponse antivirale. Bien que DCV est utilisé comme un exemple d’un virus pathogène, des dizaines de différents types de virus ont été avec s...

Emerging infections virales, surtout par les arbovirus, telles que le Chikungunya virus1, virus de la Dengue, la fièvre jaune virus2 et levirusde Zika3, ont été une énorme menace pour la santé publique en causant des pandémies 4. ainsi, une meilleure compréhension de l’interaction virus-hôte a pris une importance croissante pour la lutte contre les épidémies et le traitement des maladies virales chez l’homme. Pour atteindre cet objectif, des modèles plus adéquate et efficaces s’impose pour étudier les mécanismes sous-jacents d’infection par le virus.
La mouche à fruit, Drosophilamelanogaster (d. melanogaster), fournit un système puissant pour étudier les interactions de virus-hôte5,6 et s’est avéré pour être un des modèles plus efficaces pour étudier des maladies virales humaines7 , 8 , 9. antiviral hautement conservée de signalisation des voies et incomparables outils génétiques font vole un excellent modèle pour produire des résultats significatifs ayant des implications réelles pour études antivirale chez l’homme. En outre, les mouches sont faciles et peu coûteux de maintenir en laboratoire et sont confortables pour un dépistage à grande échelle de nouveaux facteurs de régulation6,10 dans le virus et l’hôte au cours de l’infection.
Quatre grandes voies antivirales hautement conservées (e.g., le RNA interférence (Arni) voie11, la voie de JAK-STAT12, la voie NF-κB et l’autophagie voie13) sont bien étudiés chez la drosophile au cours des dernières années6. La voie de l’ARNi est un mécanisme d’antiviraux large qui peut supprimer la plupart des types de virus infection6,14. Perturbation de cette voie de mutation des gènes comme Dicer-2 (Dcr-2) ou 2 Argonaute (AGO2) peut conduire à une augmentation des virus titre et hôte mortalité15,16,17. La voie de JAK-STAT a été impliquée dans la lutte contre l’infection par un virus de la famille des Dicistroviridae et de la famille des Flaviviridae chez les insectes, par exemple., Drosophila C virus (DCV) mouches16 et le virus du Nil occidental (VNO) et le Virus de la Dengue moustique18,19. Les frais de drosophile (homologue à la voie NF-κB humaine) et les voies de déficit immunitaire (IMD) (semblables à la voie NF-κB et TNF humaine) sont tous deux impliqués dans la défense de virus invasion20,21, 22. autophagie est un autre mécanisme conservé impliquée dans la régulation de l’infection virale, qui est bien caractérisée dans drosophile23,24. Ainsi, l’identification de nouveaux facteurs de régulation de ces voies et dissection diaphonie entre ces antiviraux de signalisation et d’autres voies biologiques, tels que le métabolisme, vieillissement, réaction neurale et ainsi de suite, peuvent être facilement configurés chez la drosophile système.
Bien que les modèles infectieuses virales plus bien établis chez la drosophile sont induites par les virus à ARN, infection par les invertébrés 6I irisé de Virus (IV-6) et virus de Kallithea ont montré le potentiel pour l’étude de virus à ADN le mouches25, 26. En outre, le virus peuvent également être modifié pour permettre l’infection de la drosophile, par exemple, le virus de la grippe9. Cela a considérablement élargi l’application de la plate-forme de criblage de drosophile . Dans cette procédure, nous utilisons DCV à titre d’exemple pour décrire comment développer un système infectieux viral chez la drosophile. DCV est un virus ARN monocaténaire seul polarité positive d’environ 9300 nucléotides, codage 9 protéines27. Comme un pathogène naturel de d. melanogaster, DCV est considéré comme un virus adapté pour étudier l’hôte physiologiques, comportementales et basale système immunitaire lors d’interaction et co-évolution hôte-virus28. En outre, son taux de mortalité rapide suite à une infection chez les mouches de type sauvage rend DCV utile pour dépister les gènes résistants ou sensibles dans l' hôte29.
Cependant, il y a plusieurs aspects préoccupants lorsque l'on étudie des infections virales chez la drosophile. Par exemple, les bactéries symbiotiques Wolbachia ont une capacité d’inhiber un large spectre de la prolifération de virus à ARN dans la drosophile et moustique30,31,32. Données récentes montrent un mécanisme possible quel Wolbachia blocs Sindbis (SINV) d’infection virale par le biais de l’upregulation de methyltransferase Mt2 expression dans l' hôte33. En outre, le bagage génétique des insectes est également critique pour une infection virale. Par exemple, le naturel polymorphisme du gène pastrel (pst), détermine la sensibilité aux infections DCV dans drosophile34,35, tandis que les locus de Ubc-E2H et CG8492 sont impliqués dans les virus de paralysie de Cricket (CrPV) et l’infection par les virus (FHV) maison de troupeau, respectivement36.
La manière d’établir l’interaction hôte-virus dans les mouches, doivent être choisies selon des fins de recherche tel qu’un écran de haut débit pour les composants cellulaires hôte Drosophila cellule lignes37,38, oral infection à étudier la réponse antivirale spécifique gut22,39,40, aiguille piquant41,42 ou nano-injection en passant les barrières épithéliales pour stimuler immunitaire systémique réponses. Nano-injection peut contrôler avec précision la dose virale pour induire une réaction antivirale contrôlée et une lésion physiologiques43, garantissant ainsi la grande reproductibilité expérimental44. Dans cette étude, nous décrivons une méthode de nano-injection pour étudier les interactions virus-hôte chez la drosophile, en soulignant l’importance des effets de fond des mouches.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22um filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 Replacement tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI 7500 qPCR system</td>
			<td>ABI</td>
			<td>7500</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MIR-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centriguge</td>
			<td>Eppendof</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centriguge</td>
			<td>Eppendof</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>151858</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95284-100ML</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Percival</td>
			<td>I-41NL</td>
			<td>Rearing Drosophila</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flat bottom 96-well-plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer (RNA extraction)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer (liquid sample RNA extraction)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10296028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td>Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive Film</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4360954</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plate</td>
			<td>ABI</td>
			<td>A32811</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9895</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>statistical software</td>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>TransScript</td>
			<td>AT301</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>VORTEX 3</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of viral infection and analysis of host-virus interaction in drosophila melanogaster

Propagation du virus est une cause majeure de maladies épidémiques. Ainsi, la compréhension de l’interaction entre le virus et l’hôte est très important d’élargir nos connaissances de la prévention et le traitement de l’infection virale. La drosophile Drosophila melanogaster s’est avéré pour être un des organismes de modèle plus efficace et productif pour dépister les facteurs antiviraux et d’étudier l’interaction virus-hôte, grâce à puissants outils génétiques et immunitaire innée hautement conservée voies de signalisation. La procédure décrite ici illustre une méthode de nano-injection afin d’établir une infection virale et induisent des réponses antivirales systémiques chez les mouches adultes. Le contrôle précis de la dose d’injection virale dans cette méthode permet de haute reproductibilité expérimentale. Protocoles décrits dans la présente étude comprennent la préparation des mouches et le virus, la méthode d’injection, analyse du taux de survie, la mesure de la charge virus et une évaluation de la voie antivirale. Les effets de l’influence d’une infection virale par le fond des mouches ont été mentionnés ici. Cette méthode d’infection est facile à réaliser et quantitativement reproductible ; Il peut être appliqué à l’écran pour hôte/virale facteurs impliqués dans l’interaction virus-hôte et à disséquer la diaphonie entre immunitaire innée de signalisation et autres voies biologiques en réaction à l’infection virale.

Résultats de la présente section sont obtenus après l’infection DCV de d. melanogaster. La figure 1 montre l’organigramme de l’infection virale chez la drosophile. Les mouches sont injectées intra-thoracically, et ensuite les échantillons sont prélevés pour la mesure de la virale TCID50 et le niveau de RNA de génome (Figure 1). Infection par le virus peut provoquer la lyse cellulaire et ECP n’est observé à 3 jours après l’infection (<stro...

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Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Ce protocole décrit comment établir une infection virale in vivo chez Drosophila melanogaster en utilisant la méthode de nano-injection et les techniques de base pour analyser l’interaction virus-hôte.

Mise en place d’une Infection virale et analyse de l’Interaction hôte-Virus chez Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de l’interaction virus-hôte sur la façon d’établir efficacement une infection virale chez Drosophila melanogaster. Cette méthode de nanoinjection permet un contrôle précis de la dose d’infection du virus et peut être facilement appliquée aux infections par d’autres agents pathogènes microbiens. Commencez par cultiver une fois 10 à la septième cellule S2 viable par millilitre comme monocouche lâche et semi-adhérente dans un plat de culture cellulaire de 10 centimètres avec 10 millilitres de drosophile moyen complet de Schneider sans dioxyde de carbone supplémentaire à 25 degrés Celsius pendant une heure.Pendant l’incubation, resuspendez le virus Drosophila C ou DCV fraîchement décongelé à une multiplicité d’infection de 0,01 dans un millilitre de milieu complet et ajoutez une solution virale aux plats de culture cellulaire. Ensuite, retournez la plaque à l’incubateur de 25 degrés Celsius pendant trois à cinq jours. Le virus est prêt pour la collecte lorsque la morphologie cellulaire semble floue et que le milieu de culture est plein de particules noires révélatrices de débris cellulaires.Mélanger le supernatant en pipetant à quelques reprises avant de transférer toute la culture cellulaire à un tube de 15 millilitres pour la lyse des cellules hôtes à moins 80 degrés Celsius. Pour générer des concentrations de travail de virus, décongeler la suspension cellulaire dans un bain d’eau de 25 degrés Celsius avec des secousses constantes avant de pelleter les débris cellulaires par centrifugation. Ensuite, transférez le supernatant dans un nouveau tube stérile de 15 millilitres pour le vortex et aliquot jusqu’à 200 microlitres de solution virale par tube.Pour déterminer la dose infectieuse moyenne de culture de tissu de virus, première graine une fois 10 aux cinq cellules d’étoile de S2 dans 100 microlitres du milieu complet dans huit puits par colonne dans 12 rangées d’une plaque de puits 96. Retournez ensuite la plaque à l’incubateur de 25 degrés Celsius. Sélectionnez au hasard cinq tubes de virus de moins 80 degrés Celsius de stockage.Pendant que les cellules se tassent, remplissez 10 tubes stériles de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre avec 450 microlitres de milieu complet stérile et ajoutez 50 microlitres de stock de virus au premier tube de 1,5 millilitre contenant 450 microlitres de milieu complet stérile diluant les suspensions 10 fois par étape jusqu’au 12e puits. À la fin de l’incubation, ajouter 50 microlitres de chaque dilution au puits approprié dans chaque colonne pour ce tube de virus et ajouter 50 microlitres de milieu de culture sans virus à un puits par colonne que le puits de contrôle négatif. Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de 25 degrés Celsius pendant trois jours et évaluez l’effet cytopathique de chaque stock de virus sous un microscope Brightfield à un grossissement de 20 X par jour.Classez un puits dans lequel les cellules semblent floues et le milieu est plein de fragments comme un puits positif et un puits dans lequel la morphologie cellulaire est normale comme un puits négatif. Avant la reproduction, bien mélanger 400 microlitres de 50 microgrammes par millilitre de tétracycline avec quatre grammes de nourriture fraîche standard de mouche de semoule de maïs et placer les aliments à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour évaporer l’éthanol. Le lendemain matin, réchauffez la nourriture à température ambiante et placez la nourriture et 20 mouches adultes femelles et 10 mâles nouvellement enfermés dans un flacon reproducteur pour une incubation de reproduction de trois à quatre jours à 25 degrés Celsius et 60% d’humidité sous un cycle normal lumière/obscurité.Lorsque suffisamment d’œufs ont été pondus, recueillir les mouches adultes nouvellement fermées sous un flux léger de dioxyde de carbone et élever la Drosophile à nouveau deux fois de plus comme il vient de le démontrer. Après trois générations de traitement à la tétracycline, recueillir cinq mouches sous un léger flux de dioxyde de carbone et homogénéiser les mouches avec 250 microlitres d’eau distillée double et quelques perles de céramique stériles de 0,5 millimètre. Après une minute, ajouter 250 microlitres de tampon A 2X à l’échantillon pour le vortex avant de congeler les échantillons à moins 80 degrés Celsius.Ensuite, décongelez rapidement des échantillons de moins 80 degrés Celsius dans un bain d’eau de 25 degrés Celsius, suivi d’une incubation de 30 minutes dans un bain d’eau de 70 degrés Celsius avant d’extraire l’ADN génomique et d’amplifier l’ADN par réaction en chaîne de polymése selon les protocoles standard. Confirmer l’absence de Wolbachia 16 petits ARN et wsp dans chaque mouche homogénéisé par électrophoresis gel selon les protocoles standard. Puis élever le stock de mouches sans Wolbachia sur la nourriture standard de mouche de semoule de maïs comme démontré.Pour l’infection virale, utilisez d’abord un stéréomicroscope et des forceps minces pour briser la pointe d’une aiguille capillaire en verre au diamètre approprié pour la nanoinjection. Pour assembler l’injecteur, placez l’anneau O du plafond et un espaceur blanc sur le piston métallique de l’injecteur avec la grande fossette orientée vers l’extérieur. Utilisez une seringue munie d’une aiguille de calibre 30 pour remplir l’aiguille en verre d’huile minérale et placer l’aiguille à travers le collier.Placez l’anneau O plus grand autour de la base du collier à environ un millimètre de l’extrémité émoussée de l’aiguille et montez l’aiguille sur le piston de l’injecteur. Fixez l’aiguille sur le piston et appuyez sur le bouton vide pour prolonger le piston du microinjecteur jusqu’à ce qu’un signal sonore soit entendu. Maintenant, appuyez sur remplir pour rétracter le piston de cinq millimètres et tremper l’aiguille dans une suspension virale unité de formation de plaque de 100.Agiter délicatement un ou au moins trois flacons de 20 drosophiles mâles sans Wolbachia sur le plat d’injection. Les mouches dotées de mâles sont préférées lors de l’accouplement et la reproduction peut influencer les femelles. Injectez ensuite le thorax de chaque mouche avec 50,6 nanolitres de solution virale dans la région légèrement plus claire entre la mésopleura et la pteropleura et mesurez la charge de DCV par analyse d’effet cytopathique et RT PCR quantitatif à partir de mouches au sol comme nous venons de le démontrer.Après l’injection, transférez soigneusement les mouches dans un flacon frais et placez le flacon dans une position horizontale pour empêcher les mouches de coller au milieu tout en se remettant de l’anesthésie. L’injection prend beaucoup de temps, mais la réplication DCV est très rapide, il est donc très important d’écrire l’heure exacte sur le tube une fois que toutes les mouches de chaque flacon ont été injectés. L’infection virale peut induire une lyse cellulaire et des effets cytopathiques sont observés trois jours après l’infection.Wolbachia 16s rRNA et wsp amorces peuvent être utilisés pour détecter la présence de Wolbachia et Drosophila comme démontré. Les mouches sans wolbachia présentent un taux de survie significativement diminué après l’infection par le DCV et d’une manière dépendante de la dose. Le DCV active les voies de signalisation antivirales chez l’hôte qui sont critiques pour l’infection antivirale à Drosophila, comme en témoigne la diminution du taux de survie et l’augmentation de la charge virale chez les mouches mutantes Dicer-2.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que la contamination avec le génotype de Wolbachia peut affecter la susceptibilité du melanogaster de Drosophila vole à l’infection de DCV. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme un dépistage génétique à plus grande échelle peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions sur les gènes hôtes sous-définis requis pour l’infection virale ou les réponses antivirales. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine des maladies virales humaines pour explorer les mécanismes sous-jacents aux flambées d’infections virales humaines endémiques dans le modèle melanogaster Drosophila.N’oubliez pas que travailler avec le virus peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de l’équipement de protection approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Research

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