Name: establishment of viral infection and analysis of host-virus interaction in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-03-14T13:30:00
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Gostaríamos de agradecer o laboratório Pan todo em IPS. CAS. Agradecemos o Dr. Lanfeng Wang (IPS, CAS) para assistência experimental e Dr. Gonalo Cordova Steger (natureza de Springer), Dr. Jessica VARGAS (IPS, Paris) e Dr. Seng Zhu (IPS, Paris) para comentários. Este trabalho foi apoiado por concessões do programa estratégico de pesquisa prioritárias da Academia Chinesa de Ciências L.P (XDA13010500) e h. t (XDB29030300), a Fundação ciência Natural nacional da China para L.P (31870887 e 31570897) e J.Y (31670909). L.P é um membro da Associação de promoção de inovação do CAS da juventude (2012083).

Nota: Antes de iniciar o experimento, as linhas celulares e voar estoques usados devem não ser contaminados por outros patógenos, especialmente para vírus como DCV, FHV, Drosophila X vírus (DXV) e nefrite aviária (ANV). Idealmente, a sequenciação do ARN ou uma simples identificação de PCR-baseados são usados para detectar a contaminação10,45. Se a contaminação ocorreu, as linhas celulares e estoques voar não devem ser usados mais, até que estejam ...

Neste artigo, apresentamos um procedimento detalhado sobre como estabelecer um sistema viral infeccioso em adultos Drosophila melanogaster , usando nano-injeção. Os protocolos incluem a preparação de linhas apropriadas de voar e estoque de vírus, técnicas de infecção, a avaliação dos indicadores de infecciosas e a medição da resposta antiviral. Apesar de DCV é usado como um exemplo de um patógeno viral, dezenas de tipos diferentes de vírus foi bem sucedidas para estudo no sistema da drosófila. Al...

Emergentes de infecções virais, especialmente por arbovírus, tais como o vírus de Chikungunya1, o vírus da Dengue, a febre amarela vírus2 e ovírusZika3, ter sido uma enorme ameaça para a saúde pública, causando pandemias 4. assim, uma melhor compreensão da interação vírus-hospedeiro tornou-se cada vez mais importante para o controle de epidemia e tratamento de doenças virais nos seres humanos. Para este objetivo, modelos mais apropriados e eficientes devem ser estabelecidos para investigar os mecanismos subjacentes a infecção pelo vírus.
Mosca da fruta, Drosophilamelanogaster (d. melanogaster), fornece um sistema poderoso para investigar de5,de interação vírus-hospedeiro6 e tem provado para ser um dos modelos mais eficientes para estudar doenças humanas virais7 , 8 , 9. antiviral altamente conservada, sinalização de caminhos e ferramentas de genéticas incomparáveis fazem voa um grande modelo para produzir resultados significativos com implicações reais para estudos antivirais humanos. Além disso, moscas são fáceis e baratas de manter no laboratório e são convenientes para triagem em larga escala de novos fatores regulatórios6,10 no vírus e o hospedeiro durante a infecção.
Quatro principais vias antivirais altamente conservadas (ex., o RNA de interferência (RNAi) via11, o JAK-STAT caminho12, via NF-κB e a caminho de autofagia13) são bem estudados em Drosophila nos últimos anos6. A via RNAi é um mecanismo antiviral amplo que pode suprimir a maioria dos tipos de vírus infecção6,14. Este caminho por mutações nos genes como Dicer-2 (Dcr-2) ou Argonaute 2 (AGO2) podem levar ao aumento de vírus título e host mortalidade15,16,17. O pathway JAK-STAT tem sido implicado no controle da infecção por um vírus da família Dicistroviridae e família Flaviviridae em insetos, por exemplo., vírus C drosófila (DCV) em moscas16 e vírus do Nilo Ocidental (WNV) e o vírus da Dengue em mosquitos18,19. O pedágio da drosófila (homólogo ao pathway NF-κB humana) e percursos de deficiência imunológica (IMD) (semelhantes ao humano pathway NF-κB e TNF) estão envolvidos na defesa de vírus invasão20,21, 22. autofagia é outro mecanismo conservado envolvidos na regulação da infecção viral, que é bem caracterizada em Drosophila23,24. Assim, a identificação de fatores regulatórios novela destas vias e dissecação crosstalk entre estes sinalização antiviral e outros caminhos biológicos, tais como metabolismo, envelhecimento, reação neural e assim por diante, podem ser facilmente configurados na drosófila sistema.
Embora modelos de infecciosos virais mais bem estabelecidos em drosófila são induzidos por vírus de RNA, infecção pelos invertebrados iridescente vírus 6I (IV-6) e vírus de Kallithea demonstraram o potencial para o estudo dos vírus de DNA em moscas25, 26. Além disso, o vírus também pode ser modificado para permitir a infecção de Drosophila, tais como o vírus da gripe9. Isto expandiu-se enormemente a aplicação da plataforma de triagem de Drosophila . Neste procedimento, usamos DCV como exemplo para descrever como desenvolver um sistema infeccioso viral em Drosophila. DCV é um positivo-sentido único encalhado RNA vírus de aproximadamente 9300 nucleotídeos, codificação de proteínas 927. Como um patógeno natural de d. melanogaster, DCV é considerado como um vírus adequado para estudar a resposta imune do hospedeiro fisiológicos, comportamentais e basal durante hospedeiro-vírus interação e co-evolução28. Além disso, sua taxa de mortalidade rápida após infecção em moscas do tipo selvagem torna DCV útil para triagem de genes resistentes ou suscetíveis no anfitrião29.
No entanto, há vários aspectos de preocupação quando estudar infecções virais em Drosophila. Por exemplo, bactérias simbióticas Wolbachia têm uma capacidade de inibir uma ampla espectros de proliferação de vírus de RNA em Drosophila e mosquito31,de30,32. Evidência recente mostra um possível mecanismo no qual Wolbachia blocos Sindbis vírus (SINV) infecção através o upregulation do methyltransferase Mt2 expressão no anfitrião33. Além disso, o fundo genético de insetos também é fundamental para a infecção viral. Por exemplo, o natural polimorfismo no gene, pastrel (pst), determina a suscetibilidade à infecção de DCV em Drosophila34,35, enquanto Locus E2H-Ubc e CG8492 estão envolvidos em vírus de paralisia de Cricket (CrPV) e infecção por vírus (FHV) rebanho casa, respectivamente,36.
Os modos particulares para estabelecer a interação vírus-hospedeiro em moscas, deve ser escolhido de acordo com fins de investigação, tais como uma tela de alta produtividade para componentes celulares do hospedeiro em Drosophila célula linhas37,38, oral infecção para estudar a resposta antiviral específico do intestino22,39,40, agulha picando41,42 ou nano-injeção, passando as barreiras epiteliais para estimular imune sistêmica respostas. Nano-injeção pode controlar com precisão a dose viral para induzir uma reação antiviral controlada e uma lesão fisiológica43, garantindo alta reprodutibilidade experimental44. Neste estudo, descrevemos um método de nano-injeção para estudar interações do vírus-anfitrião em Drosophila, destacando a importância dos efeitos de fundo dos moscas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22um filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 Replacement tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI 7500 qPCR system</td>
			<td>ABI</td>
			<td>7500</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MIR-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centriguge</td>
			<td>Eppendof</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centriguge</td>
			<td>Eppendof</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>151858</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95284-100ML</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Percival</td>
			<td>I-41NL</td>
			<td>Rearing Drosophila</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flat bottom 96-well-plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer (RNA extraction)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer (liquid sample RNA extraction)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10296028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td>Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive Film</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4360954</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plate</td>
			<td>ABI</td>
			<td>A32811</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9895</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>statistical software</td>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>TransScript</td>
			<td>AT301</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>VORTEX 3</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of viral infection and analysis of host-virus interaction in drosophila melanogaster

Propagação do vírus é das principais causas de doenças epidêmicas. Assim, compreender a interação entre o vírus e o hospedeiro é muito importante para estender o nosso conhecimento de prevenção e tratamento da infecção viral. A mosca de fruta Drosophila melanogaster provou para ser um dos organismos modelo mais eficiente e produtiva de tela para fatores antivirais e investigar a interação vírus-hospedeiro, devido a ferramentas poderosas de genéticas e altamente conservada imune inata vias de sinalização. O procedimento descrito aqui demonstra um método de nano-injeção para estabelecer a infecção viral e induzir respostas antivirais sistêmicas em moscas adultas. O controle preciso da dose injeção viral neste método permite alta reprodutibilidade experimental. Os protocolos descritos neste estudo incluem a preparação de moscas e o vírus, o método de injeção, análise de taxa de sobrevivência, a medição de carga de vírus e uma avaliação do percurso antiviral. Os efeitos da influência da infecção viral pelo fundo dos moscas foram mencionados aqui. Este método de infecção é fácil de executar e quantitativamente repetíveis; pode ser aplicado para a tela para anfitrião/viral factores envolvidos na interação vírus-hospedeiro e dissecar o crosstalk entre imune inata de sinalização e outras vias biológicas em resposta à infecção viral.

Após a infecção de DCV de d. melanogaster, obtêm-se resultados desta seção. A Figura 1 mostra o fluxograma de infecção viral em Drosophila. Moscas são injetadas intra-thoracically, e em seguida as amostras são coletadas para a medição do viral TCID50 e o nível do genoma de RNA (Figura 1). Infecção por vírus pode induzir lise celular e CPE é observada em 3 dias pós infecção (Figura 2A). Em consonância com a carga de vírus...

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Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Este protocolo descreve como estabelecer infecção viral na vivo em Drosophila melanogaster , usando o método de nano-injeção e técnicas básicas para analisar a interação vírus-hospedeiro.

Estabelecimento de infecção Viral e análise da interação vírus-hospedeiro em Drosophila Melanogaster.

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo de interação entre vírus e hospedeiros sobre como estabelecer efetivamente uma infecção viral em Drosophila melanogaster. Este método de nanoinjeção permite um controle preciso da dose de infecção do vírus e pode ser facilmente aplicado a infecções com outros patógenos microbianos. Comece crescendo uma vez 10 a a sétima células estelares S2 viáveis por mililitro como monocamada solta e semi-aderente em um prato de cultura celular de 10 centímetros com 10 mililitros de Drosophila Medium completo schneider sem dióxido de carbono adicional a 25 graus Celsius por uma hora.Durante a incubação, resuspenque o vírus Drosophila C ou DCV recém-descongelado para uma multiplicidade de infecção de 0,01 em um mililitro de meio completo e adicione solução de vírus aos pratos de cultura celular. Em seguida, devolva a placa para a incubadora Celsius de 25 graus por três a cinco dias. O vírus está pronto para coleta quando a morfologia celular parece embaçada e o meio de cultura está cheio de partículas negras indicativas de detritos celulares.Misture o supernasce por pipetar algumas vezes antes de transferir toda a cultura celular para um tubo de 15 mililitros para lise das células hospedeiras a menos 80 graus Celsius. Para gerar concentrações de trabalho do vírus, descongele a suspensão celular em um banho de água de 25 graus Celsius com agitação constante antes de pelotas dos detritos celulares por centrifugação. Em seguida, transfira o supernascer para um novo tubo estéril de 15 mililitros para vórtice e alíquota de até 200 microliters de solução de vírus por tubo.Para determinar a dose infecciosa média da cultura do tecido do vírus, primeira semente uma vez 10 para as cinco células estelares S2 em 100 microliters de meio completo em oito poços por coluna em 12 linhas de uma placa de 96 poços. Em seguida, devolva a placa para a incubadora Celsius de 25 graus. Selecione aleatoriamente cinco tubos de vírus a partir de menos 80 graus Celsius de armazenamento.Enquanto as células estão se instalando, encha 10 tubos de microcentrífugo estéreis de 1,5 mililitros com 450 microliters de meio completo estéril e adicione 50 microliters de estoque de vírus ao primeiro tubo de 1,5 mililitro contendo 450 microliters de meio estéril completo diluindo as suspensões 10 vezes por passo ao 12º poço. Ao final da incubação, adicione 50 microlitadores de cada diluição ao poço apropriado em cada coluna para esse tubo de vírus e adicione 50 microliters de meio de cultura sem vírus a um poço por coluna, bem como o controle negativo. Em seguida, coloque a placa na incubadora 25 graus Celsius por três dias e avalie o efeito citopático de cada estoque de vírus sob um microscópio Brightfield em uma ampliação de 20X diariamente.Classifique um poço em que as células pareçam embaçadas e o meio esteja cheio de fragmentos como um poço positivo e um poço no qual a morfologia celular é normal como um bem negativo. Antes da reprodução, misture completamente 400 microlitadores de 50 microgramas por mililitro de Tetraciclina com quatro gramas de alimentos frescos padrão de mosca de fubá e coloque o alimento a quatro graus Celsius durante a noite para evaporar o etanol. Na manhã seguinte, aqueça a comida à temperatura ambiente e coloque a comida e 20 fêmeas e 10 machos recém-eclosed adulto voam em um frasco de reprodução para uma incubação de reprodução de três a quatro dias a 25 graus Celsius e 60% de umidade sob um ciclo normal claro/escuro.Quando ovos suficientes foram colocados, colete as moscas adultas recém-eclosadas sob um fluxo leve de dióxido de carbono e crie o Drosophila novamente mais duas vezes como apenas demonstrado. Após três gerações de tratamento tetraciclina, colete cinco moscas sob um fluxo leve de dióxido de carbono e homogeneize as moscas com 250 microliters de água dupla destilada e algumas contas de cerâmica estéreis de 0,5 milímetros. Após um minuto, adicione 250 microliters de 2X Buffer A à amostra para vórtice antes de congelar as amostras a menos 80 graus Celsius.Em seguida, descongele rapidamente amostras de menos 80 graus Celsius armazenados em um banho de água de 25 graus Celsius, seguido de uma incubação de 30 minutos em um banho de água de 70 graus Celsius antes de extrair o DNA genômico e amplificar o DNA pela reação em cadeia de polimerase de acordo com os protocolos padrão. Confirme a ausência de Wolbachia 16 pequeno RNA e wsp em cada mosca homogeneizado por eletroforese de gel de acordo com os protocolos padrão. Em seguida, criar o estoque de mosca livre de Wolbachia em alimentos padrão de mosca de fubá, como demonstrado.Para infecção viral, primeiro use um estereómico e fórceps finos para quebrar a ponta de uma agulha capilar de vidro ao diâmetro apropriado para nanoinjeção. Para montar o injetor, coloque o teto o-ring e um espaçador branco sobre o êmbolo metálico do injetor com a covinha grande voltada para fora. Use uma seringa equipada com uma agulha calibre 30 para encher a agulha de vidro com óleo mineral e coloque a agulha através da coleira.Coloque o anel O maior ao redor da base do colarinho cerca de um milímetro da extremidade cega da agulha e coloque a agulha no êmbolo do injetor. Fixar a agulha no êmbolo e pressionar o botão vazio para estender o êmbolo do microinjetor até que um sinal sonoro seja ouvido. Agora pressione o preenchimento para retrair o êmbolo de cinco milímetros e mergulhe a agulha em uma suspensão viral de 100 unidades formadoras de placas.Agite suavemente um ou pelo menos três frascos de 20 Drosophila masculino sem Wolbachia no prato de injeção. Moscas dotadas machos são preferidas durante o acasalamento e a reprodução pode influenciar as fêmeas. Em seguida, injete o tórax de cada mosca com 50,6 nanolitros de solução de vírus na região colorida ligeiramente mais clara entre a mesopleura e a pteropleura e meça a carga de DCV por ensaio de efeito citopático e RT PCR quantitativo de moscas terrestres como apenas demonstrado.Após a injeção, transfira cuidadosamente as moscas para um frasco fresco e coloque o frasco em uma posição horizontal para evitar que as moscas grudem no meio enquanto se recuperam da anestesia. A injeção é demorada, mas a replicação do DCV é muito rápida, por isso é muito importante anotar o tempo exato no tubo uma vez que todas as moscas de cada frasco tenham sido injetadas. A infecção por vírus pode induzir a lise celular e os efeitos citopáticos são observados em três dias após a infecção.Os primers wolbachia 16s rRNA e wsp podem ser usados para detectar a presença de Wolbachia e Drosophila como demonstrado. As moscas livres de wolbachia apresentam uma taxa de sobrevivência significativamente reduzida após a infecção pelo DCV e de forma dependente de doses. O DCV ativa vias de sinalização antiviral no hospedeiro que são críticas para a infecção antiviral em Drosophila, como evidenciado pela diminuição da taxa de sobrevivência e aumento da carga viral em moscas mutantes Dicer-2.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a contaminação com o genótipo wolbachia pode afetar a suscetibilidade das moscas de Drosophila melanogaster para a infecção pelo DCV. Após este procedimento, outros métodos como uma tela genética de maior escala podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais sobre genes de hospedeiro definidos necessários para infecção viral ou respostas antivirais. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da doença viral humana explorarem os mecanismos subjacentes a surtos de infecções virais humanas endêmicas no modelo Drosophila melanogaster.Não se esqueça que trabalhar com vírus pode ser extremamente perigoso e que precauções como usar o equipamento de proteção apropriado devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolamento de variantes de vírus de RNA Fidelity e Caracterização de frequência de mutação de vírus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Imunologia e Infecção

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Dissecando interação hospedeiro-vírus em replicação lítica de um herpesvírus modelo

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

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Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Estabelecimento e análise do Tumor fatia Explants como um pré-requisito para o teste de diagnóstico

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Estudo de toxicidade de nanopartículas de óxido de zinco em cultura celular e em Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...