Name: establishment of viral infection and analysis of host-virus interaction in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-03-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить весь Пан лаборатории в IPS. CAS. Мы благодарим Ванг Lanfeng (IPS, CAS) для экспериментальной помощи и доктор Gonalo Cordova Steger (Springer природы), доктор Джессика Варгас (IPS, Париж) и доктор Seng Чжу (IPS, Париж) для комментариев. Эта работа была поддержана грантов из стратегических приоритетных исследований программы Китайской академии наук L.P (XDA13010500) и H.T (XDB29030300), Национальный фонд естественных наук Китая L.P (31870887 и 31570897) и J.Y (31670909). L.P является членом CAS молодежных инноваций ассоциации (2012083).

Примечание: Перед началом эксперимента, клеточных линий и летать запасов используются должны не быть загрязнены патогенами, особенно для вирусов, таких как DCV, FHV, дрозофила X вирус (DXV) и вирус птичьего нефрит (ANV). В идеале РНК последовательности или простой идентификации на основе ПЦР ис?...

В этой статье мы представляем подробную процедуру о том, как создать вирусный инфекционных систему в взрослых Drosophila melanogaster с использованием нано инъекции. Протоколы включают подготовку соответствующих летать линий и вирус фондовой, инфекции методов, оценки инфекционных показате...

Новые вирусные инфекции, особенно путем арбовирусов, таких, как вирус чикунгуньи1, вирус денге, желтой лихорадки вирус2 ивирусЗика3, были огромную угрозу для общественного здоровья, вызывая пандемий 4. Таким образом, более глубокого понимания взаимодействия вируса хост становится все более важным для эпидемического контроля и лечения вирусных заболеваний в организме человека. Для этой цели необходимо создать более адекватных и эффективных моделей для изучения механизмов лежащие в основе вирусной инфекции.
Плодовая муха, Drosophilamelanogaster (D. melanogaster), обеспечивает мощную систему для изучения вируса хост взаимодействия5,6 и оказался одним из наиболее эффективных моделей для изучения вирусных заболеваний человека7 , 8 , 9. высоко сохранены противовирусное, сигнальные пути и несравненный генетических инструменты делают мухи большой модели для получения существенных результатов с реальные последствия для человека антивирусных исследований. Кроме того мух, простой и недорогой для поддержания в лаборатории и удобны для крупномасштабных скрининг Роман регуляторные факторы6,10 вирус и принимающей во время инфекции.
Четыре основных высоко сохранены противовирусное пути (например., РНК интерференции (RNAi) путь11, Як-STAT путь12, NF-κB путь и путь autophagy13) хорошо изучены в дрозофила в последние лет6. Интерференции является широкий противовирусное механизмом, который может подавить большинства видов вирусной инфекции6,14. Нарушение этого пути, мутации в генах как Dicer-2 (Dcr-2) или Argonaute 2 (давности2) может привести к увеличению вирус титр и принимающих смертности15,16,17. Як-STAT путь был вовлечен в контроля инфекции вирусом из семьи Dicistroviridae и Flaviviridae семьи в насекомые, например., дрозофила C вирус (DCV) в16 мух и вирус Западного Нила (ВЗН) и вирус денге комаров18,19. Дрозофилы платных (гомологичных человека NF-κB путь) и иммунодефицит (IMD) тропы (похож на человеческий путь NF-κB и TNF) являются оба участвовали в защите вирусов вторжения20,21, 22. autophagy это еще сохраняется механизм, участвует в регуляции вирусной инфекции, которая характеризуется хорошо дрозофилы23,24. Таким образом, идентификация Роман регуляторные факторы этих путей и рассечения перекрестных помех между этими противовирусное сигнализации и другие биологические пути, таких как метаболизм, старение, нейронные реакции и так далее, можно легко настроить в дрозофилы системы.
Хотя наиболее устоявшихся вирусных инфекционных модели в дрозофилы индуцированных РНК-вирусов, инфекции, беспозвоночных радужные вирус 6I (IV-6) и Калифея вирусы продемонстрировали потенциал для исследования ДНК вирусов в мух25, 26. Кроме того вирус может также быть изменен инфекции дрозофилы, таких как вирус гриппа9. Это значительно расширил применение дрозофилы скрининг платформы. В этой процедуре мы используем DCV в качестве примера для описания как развивать систему вирусных инфекционных дрозофилы. DCV представляет собой положительный смысл единого мель РНК вирус примерно 9300 нуклеотидов, кодирование 9 белки27. Как естественный возбудитель D. melanogasterDCV считается подходящим вирус изучать физиологические, поведенческие и базальной иммунного ответа во время пребывания вирус взаимодействия и коэволюции28. Кроме того его быстрого смертности после инфицирования в дикого типа мух делает DCV полезным экран для устойчивостью или подверженных генов в принимающей29.
Однако есть несколько аспектов озабоченности при изучении вирусных инфекций у дрозофилы. К примеру симбиотические бактерии Wolbachia имеют способность ингибировать широкого спектра РНК вируса распространения дрозофилы и комаров30,,3132. Последние данные показывает возможный механизм, в котором Wolbachia блоков синдбис вирус (SINV) инфекции через upregulation метилтрансфераза Mt2 выражение в принимающей33. Кроме того генетический фон насекомых также имеет решающее значение для вирусной инфекции. К примеру, естественный полиморфизм гена pastrel (pst), определяет восприимчивость к инфекции DCV дрозофилы34,35, хотя локусов Ubc-E2H и CG8492 участвуют в крикет паралич вирус (CrPV) и стадо заражения вирусом (FHV) дом, соответственно36.
Конкретных способов установить вирус хост взаимодействия в мух, должны быть выбраны согласно научно-исследовательских целей, таких как экран высокой пропускной способностью для принимающей клетчатых компонентов в дрозофилы клеток линии37,38, устные -инфекции обучения гут конкретных противовирусное ответ22,39,40, иглы, покалывание41,42 или нано инъекции, передав эпителиальных барьеры для стимулирования системной иммунной ответы. Нано инъекции можно точно контролировать вирусный доза побудить контролируемых противовирусное реакции и физиологических поражения43, таким образом гарантируя высокую воспроизводимость экспериментальной44. В этом исследовании мы описываем метод нано инъекции для изучения взаимодействия вирус хост у дрозофилы, подчеркнув важность эффекты фона мух.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22um filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 Replacement tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI 7500 qPCR system</td>
			<td>ABI</td>
			<td>7500</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MIR-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centriguge</td>
			<td>Eppendof</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centriguge</td>
			<td>Eppendof</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>151858</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95284-100ML</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Percival</td>
			<td>I-41NL</td>
			<td>Rearing Drosophila</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flat bottom 96-well-plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer (RNA extraction)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer (liquid sample RNA extraction)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10296028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td>Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive Film</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4360954</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plate</td>
			<td>ABI</td>
			<td>A32811</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9895</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>statistical software</td>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>TransScript</td>
			<td>AT301</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>VORTEX 3</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of viral infection and analysis of host-virus interaction in drosophila melanogaster

Вирус распространяется является одной из основных причин эпидемических заболеваний. Таким образом понимание взаимодействия между вирусом и принимающей страны очень важно расширить наши знания о профилактики и лечения вирусной инфекции. Плодовой мушки Drosophila Меланаogaster оказался одним из наиболее эффективных и продуктивных модельных организмов экрана для противовирусное факторов и изучения взаимодействия вируса хост, из-за генетических мощные инструменты и высоко сохраняется врожденный иммунный сигнальные пути. Процедуру, описанную здесь демонстрирует метод нано инъекции для установления вирусной инфекции и побудить системных противовирусное ответы взрослых мух. Точный контроль вирусных инъекций доза в этот метод позволяет высокую воспроизводимость экспериментальной. Протоколы, описанные в данном исследовании включают подготовку мух и вирус, метод впрыска, выживание курс анализа, измерения нагрузки вирус, и противовирусное путь оценки. Влияние последствий вирусной инфекции на фоне мухи были упомянуты здесь. Этот метод инфекции легко выполнять и количественно повторяемости; Он может применяться для хост/вирусные факторы взаимодействия вируса хост и вскрыть перекрестных помех между врожденной иммунной сигнализации и другие биологические пути в ответ на вирусную инфекцию.

Результаты этого раздела после инфекции DCV D. melanogaster. Рисунок 1 показывает схему вирусной инфекции у дрозофилы. Мухи являются вводят внутри thoracically, а затем собраны образцы для измерения вирусной TCID50 и уровень РНК генома (рис. 1). Вирус может вызвать лизис к...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Этот протокол описывает в Drosophila melanogaster с использованием нано инъекционный метод и основные методы для анализа взаимодействия вируса узла создать вирусной инфекции в естественных условиях .

Создание вирусной инфекции и анализа взаимодействия хост вирус в Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия вирус-хозяин о том, как эффективно установить вирусную инфекцию в Drosophila меланогастер. Этот метод наноинъекции позволяет точно контролировать дозу инфекции вируса и может быть легко применен к инфекциям с другими микробными патогенами. Начните с роста в один раз от 10 до седьмой жизнеспособной S2 звездных клеток на миллилитр, как свободные, полуприемник монослой в 10 сантиметров клеточной культуры блюдо с 10 миллилитров полного Шнайдера Drosophila Medium без дополнительного углекислого газа при 25 градусов по Цельсию в течение одного часа.Во время инкубации, resuspend свежеоттая Дрозофила C Вирус или DCV к множественности инфекции 0,01 в один миллилитр полной среды и добавить вирусный раствор в блюда клеточной культуры. Затем верните пластину в инкубатор 25 градусов по Цельсию в течение трех-пяти дней. Вирус готов к сбору, когда морфология клеток выглядит размытой, а среда культуры полна черных частиц, указывающих на клеточный мусор.Смешайте супернатант путем пипетки несколько раз, прежде чем передать всю культуру клеток в 15 миллилитровую трубку для лиза клеток-хозяина при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для генерации рабочих концентраций вируса, оттепель клеточной подвески в 25 градусов по Цельсию водяной бане с постоянной тряской перед pelleting клеточного мусора центрифугации. Затем перенесите супернатант в новую стерильную 15-миллилитровую трубку для вихревого и алицитирования до 200 микролитров вирусного раствора на трубку.Чтобы определить среднюю культуру вирусной ткани инфекционной дозы, первое семя один раз от 10 до пяти звездных клеток S2 в 100 микролитров полной среды в восемь скважин на столбец в 12 рядах 96 пластины скважины. Затем верните пластину в инкубатор 25 градусов по Цельсию. Случайным образом выберите пять трубок вируса из хранилища минус 80 градусов по Цельсию.Пока клетки оседают, заполните 10 стерильных 1,5 миллилитров микроцентрифугных трубок с 450 микролитров стерильной полной среды и добавьте 50 микролитров вирусного бульона к первой 1,5 миллилитровой трубке, содержащей 450 микролитров стерильной полной среды, разбавляющих подвески 10 раз за шаг до 12-й хорошо. В конце инкубации добавьте 50 микролитров каждого разбавления в соответствующий колодец в каждой колонке для этой трубки вируса и добавьте 50 микролитров среды культуры без вируса к одному колодец на столбец в качестве отрицательного контроля хорошо. Затем поместите пластину в инкубатор 25 градусов по Цельсию в течение трех дней и оцените цитопатический эффект каждого вирусного бульона под микроскопом Brightfield при ежедневном увеличении на 20X.Классифицируемый колодец, в котором клетки выглядят размытыми, а среда полна фрагментов, как положительный колодец и колодец, в котором морфология клеток нормальная как отрицательная хорошо. Перед размножением тщательно смешайте 400 микролитров по 50 микрограмм на миллилитр тетрациклина с четырьмя граммами свежей стандартной кукурузной муки мухи пищи и поместите пищу при четырех градусах по Цельсию на ночь, чтобы испаряться этанола. На следующее утро, тепло пищи до комнатной температуры и место пищи и 20 женщин и 10 мужчин недавно eclosed взрослых мух в племенной флакон для трех-четырехдневного инкубации размножения при 25 градусов по Цельсию и 60% влажности при нормальном светло-темном цикле.Когда достаточное количество яиц были заложены, собирать недавно eclosed взрослых мух под легким потоком углекислого газа и породы Drosophila снова еще два раза, как только что продемонстрировали. После трех поколений тетрациклинной обработки, собрать пять мух под легким потоком углекислого газа и гомогенизировать мух с 250 микролитров двойной дистиллированной воды и несколько 0,5 миллиметр стерильных керамических бусин. Через минуту добавьте 250 микролитров 2X Buffer A в образец для вихревого замораживания образцов при температуре минус 80 градусов по Цельсию.Далее, быстро оттепели образцов от минус 80 градусов по Цельсию хранения в 25 градусов по Цельсию водяной бане, а затем 30-минутной инкубации в 70 градусов по Цельсию водяной бане до извлечения геномной ДНК и усиления ДНК полимеразы цепной реакции в соответствии со стандартными протоколами. Подтвердите отсутствие Wolbachia 16 малых РНК и wsp в каждой мухе гомогената гель электрофорез в соответствии со стандартными протоколами. Затем задняя Wolbachia-бесплатный запас летать на стандартной кукурузной муки летать пищи, как попродемонстрировано.Для вирусной инфекции, сначала используйте стереомикроскоп и тонкие типсы, чтобы сломать кончик стеклянной капиллярной иглы до соответствующего диаметра для наноинъекции. Чтобы собрать инжектор, поместите потолок O-кольцо и белый проем на металлический поршень инжектора с большой ямочка лицом наружу. Используйте шприц, оснащенный иглой 30 калибра, чтобы заполнить стеклянную иглу минеральным маслом и поместить иглу через воротник.Поместите больше O-кольцо вокруг основания воротника около одного миллиметра от тупой конец иглы и смонтировать иглу на поршень инжектора. Закрепите иглу на поршене и нажмите пустую кнопку, чтобы расширить поршень микроинжектора до тех пор, пока не будет слышен звуковой сигнал. Теперь нажмите заполнить втягивать поршень пять миллиметров и окунуть иглу в 100 доска формирования единицы вирусной подвески.Аккуратно встряхните один или, по крайней мере, три флакона из 20 Wolbachia свободных мужчин Drosophila на инъекцию блюдо. Мужские наделенные мухи предпочтительнее во время спаривания и воспроизводства может влиять на самок. Затем ввимите грудную клетку каждой мухи с 50,6 нанолитров вирусного раствора в слегка светлую цветную область между мезоплюрой и птероплеурой и измерьте нагрузку DCV с помощью анализа цитопатических эффектов и количественного РТР от наземных мух, как только что продемонстрировано.После инъекции осторожно перенесите мух на свежий флакон и поместите флакон в горизонтальное положение, чтобы мухи не прилипли к среде, восстанавливаясь после анестезии. Инъекции отнимая много времени, но репликация DCV очень быстрая, поэтому очень важно записать точное время на трубке, как только все мухи из каждого флакона были введены. Вирусная инфекция может вызвать клеточный лиз и цитопатические эффекты наблюдаются в течение трех дней после заражения.Wolbachia 16s rRNA и wsp праймеры могут быть использованы для обнаружения присутствия Wolbachia и Drosophila, как попродемонстрировано. Wolbachia свободных мух экспонат значительно снизилась выживаемость после инфекции DCV и в дозе зависимых образом. DCV активирует противовирусные сигнальные пути у хозяина, которые имеют решающее значение для противовирусной инфекции в Дрозофиле, о чем свидетельствует снижение выживаемости и повышенная вирусная нагрузка у мух-мутантов Dicer-2.При попытке этой процедуры, важно помнить, что загрязнение генотипом Wolbachia может повлиять на восприимчивость Drosophila меланогастер летит к инфекции DCV. После этой процедуры, другие методы, такие как более масштабный генетический экран могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы о под определенными генами хозяина, необходимых для вирусной инфекции или противовирусных ответов. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области вирусных заболеваний человека, чтобы изучить механизмы, лежащие в основе вспышек эндемических вирусных инфекций человека в модели Drosophila melanogaster.Не забывайте, что работа с вирусом может быть чрезвычайно опасной и что такие меры предосторожности, как ношение соответствующего защитного оборудования, всегда должны приниматься при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Выделение вариантов Fidelity РНК-содержащих вирусов и характеристика вирусов Частота мутаций

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Пройдя Host-вирус Взаимодействие в Литические репликации Модель Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Системная бактериальная инфекция и иммунная Фенотипы обороны в<em&gt; Дрозофилы</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Развитие Лиофилизированный Loop опосредованных изотермических реагенты для амплификации для обнаружения<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Метод тампон Отбор проб для обнаружения человека норовирус на поверхностях

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Извлечение Hemocytes из личинки Drosophila melanogaster микробной инфекции и анализа

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Обнаружение низких копии число комплексных вирусной ДНК, образованный в Vitro инфекции гепатита B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Изображений взаимодействия клеток в слизистой оболочки трахеи во время инфекции вируса гриппа с помощью двух Фотон прижизненной микроскопии

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Создание и анализ кусочек опухоли эксплантах как предпосылкой для диагностики

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Исследование токсичности наночастиц оксида цинка в клеточной культуре и в Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...