Name: determination of regulatory t cell subsets in murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen using flow cytometry
Uploaded: 2019-02-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry at JoVE.com

هذه الدراسة دعم مالي من مجلس البحوث السويدية، اكسودياب، ومؤسسة السكري السويدية والصندوق السكري الطفل السويدي، سيب ديابيتيسفوندين و O.E. أوتش ادلا جوهانسونس فيتينسكابليجا ستيفتيلسي. المؤلف يود أيضا بفضل كل علا كارلسون وساندلر ستيلان ليدعم والمناقشات.

وافقت لجنة الأخلاقيات الحيوانات المحلية في جامعة أوبسالا في التجارب على الحيوانات.
1-جمع الأجهزة من الحيوانات
<ol><li>التضحية الفئران بخلع عنق الرحم.</li>
	<li>مكان الغدد الغدة الصعترية والطحال في قنينات التﻷلؤ 20 مل أو 15 مل أنابيب مخروطية الشكل مليئة 5 مل Hanks´ متوازن الحل الملح (حب...

<ol>
	<li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4+CD25++regulatory+T+cells.">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li><li>Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+Scurfin+in+CD4+CD25++T+regulatory+cells.">An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li><li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+(CD25).+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases.">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li><li>Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+regulatory+T+cells+work.">How regulatory T cells work.</a> Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).</li><li>Thornton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Helios,+an+Ikaros+transcription+factor+family+member,+differentiates+thymic-derived+from+peripherally+induced+Foxp3++T+regulatory+cells.">Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).</li><li>Weiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin+1+is+expressed+on+thymus-derived+natural+regulatory+T+cells,+but+not+mucosa-generated+induced+Foxp3++T+reg+cells.">Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).</li><li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo.">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).</li><li>Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+analysis+of+Helios+and+Neuropilin-1+as+a+marker+to+detect+thymic+derived+regulatory+T+cells+in+naive+mice.">Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice.</a> Scientific Reports. 5, 7767 (2015).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator.">Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator.">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-35+administration+counteracts+established+murine+type+1+diabetes--possible+involvement+of+regulatory+T+cells.">Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, 12633 (2015).</li><li>Digre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+heparanase+enhances+T+lymphocyte+activities+and+intensifies+the+inflammatory+response+in+a+model+of+murine+rheumatoid+arthritis.">Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis.</a> Scientific Reports. 7, 46229 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-tumoral+immune+cell+alterations+in+wild+type+and+Shb-deficient+mice+in+response+to+4T1+breast+carcinomas.">Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas.</a> Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).</li></ol>

في هذه الدراسة، ونحن عزل الخلايا المفردة من الغدد الغدة الصعترية، بدلنس والطحال من الفئران إيماءة، والتحقيق في التعبير عن هيليوس و Nrp1 في خلايا CD4+CD8–CD25+Foxp3+ تريغ الخلايا باستخدام التدفق الخلوي. واستخدمت في هذه الدراسة، الفئران إيماءة، الذي هو نموذج مورين من داء الس?...

خلايا تي (تريغ) التنظيمية حاسمة بالنسبة للتوازن للجهاز المناعي. تعرف الخلايا تريغ التعبير عن المستضدات السطحية CD4 و CD25، والنسخ عامل فورخيد مربع P3 (Foxp3)1،،من23. وأظهرت ساكاجوتشى et al. أولاً أعرب CD25 هو مؤثرا في تي القامع الخلايا في الفئران4، الذي ينص مراقبة رائدة للتعرف على الخلايا البشرية تريغ. تريغ خلايا تلعب دوراً مركزياً في منأى عن التسامح بما تمارسه من قدرة قمعية عبر مجموعة متنوعة من الآليات، بما في ذلك سيتوليسيس عن طريق إفراز جرانزيميس للحث على المبرمج واستهلاك سيتوكين وتثبيط من خلال التعبير عن السامة للخلايا اللمفاويات التائية مستضد 45. بالإضافة إلى ذلك، أنها يمكن أن تفرز السيتوكينات المثبطة مثل تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)، انترلوكين-10 (إيل-10)، وايل-355. يمكن بطبيعة الحال أن يستمد تريغ خلايا من الغدة الصعترية، في هذه الحالة يتم تعيينهم الغدة الصعترية المشتقة من الخلايا تريغ (تريج)، أو أنهم يمكن أن يتسبب في الأجهزة الطرفية في هذا الحالة تسمى محيطيا المستحث تريغ (بتريج) الخلايا.
هيليوس، عضو الأسرة عامل النسخ إيكاروس، أفيد بأن علامة للتمييز بين خلايا تريج والخلايا بتريج6. في وقت لاحق، أفادت مجموعتين أخريين أن مستقبل الثالث سيمافورين، نيوروبيلين 1 (Nrp1)، يمكن أن تخدم كعلامة سطحية لخلايا تريج تحت بعض الظروف7،8. ومع ذلك، أظهرت سينغ et al. أن Helios علامة أفضل في هذا السياق بالسذاجة الفئران9.
مجموعات فرعية الخلايا تريغ تلعب دوراً محوريا في الحفاظ على التوازن في الجهاز المناعي، وفي الحماية من العدوى والمناعة الذاتية. ولذلك، من المهم تحديد أرقام ونسب هؤلاء السكان في الأنسجة اللمفاوية وغير اللمفاوية على حد سواء. ولتحقيق ذلك، يتعين على المرء أن إعداد تعليق خلية واحدة فقط من هذه الأجهزة. تم وصف عدد من البروتوكولات أو المستخدمة في الدراسات السابقة. أساسا، ديسوسياتورس التلقائي قد استخدمت في التقارير المنشورة سابقا10،11. ديسوسياتورس التلقائي باستخدام مناسب وتوفير الوقت، وإنما إجراء مكلفة. ولذلك، استخدمنا أسلوب يدوي لإعداد تعليق خلية مفردة من مورين الغدة الصعترية الغدد الليمفاوية تجفيف البنكرياس (بدلنس) والطحال من الفئران (الإيماءة) السكري غير السمنة نورموجليسيميك، وعزل الخلايا المفردة من هذه الأجهزة. وقد استخدم هذا الأسلوب في دراساتنا السابقة ووجدنا أن الطريقة اليدوية لإعداد تعليق خلية مفردة بكفاءة ديسوسياتور التلقائي الأسلوب9،12،،من1314. وعلاوة على ذلك، استخدمنا التدفق الخلوي لتحديد نسب CD4+CD8–CD25+Foxp3+ تريغ خلايا ومجموعات فرعية من تريغ الخلايا خلايا تريج وبتريج. تم تمييز خلايا تريج وبتريج استخدام هيليوس و Nrp1 كعلامات لخلايا تريج. وهكذا، تشير النتائج التي توصلنا إليها أن الطريقة اليدوية لإعداد الخلايا المفردة العمل بكفاءة، ويمكن استخدام تعليق خلية واحدة مستعدة كذلك لدراسات استخدام التدفق الخلوي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NOD mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house breading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Statens veterin&#228;rmedicinska anstalt</td>
			<td>991750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0883-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1011450500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4222-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0042-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-0251-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen&#160;APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB5994A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25-5773-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>137220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352235</td>
			<td>A 35 &#181;m nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 15ml, 120x17mm, PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable scintillation vials</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td>Inivai Technologies</td>
			<td>Flowlogic</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of regulatory t cell subsets in murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen using flow cytometry

لدينا الجهاز المناعي يتكون من عدد ومتنوعة من الخلايا المناعية بما في ذلك الخلايا خلايا (تريغ) T التنظيمية. ويمكن تقسيم الخلايا تريغ مجموعات فرعية اثنين والغدة الصعترية المشتقة من الخلايا تريغ (تريج) والمستحثه محيطيا تريغ (بتريج) الخلايا. وهي موجودة في مختلف أجهزة الجسم ويمكن تمييزها بعلامات معينة، مثل هيليوس ونيوروبيلين 1. وأفيد أن خلايا تريج وظيفيا القمعية أكثر من الخلايا بتريج. ولذلك، من المهم تحديد نسبة خلايا تريج وبتريج عند التحقيق في الخلية غير المتجانسة السكان. وهنا، جمعنا الغدة الصعترية الغدد الليمفاوية تجفيف البنكرياس والطحال من الفئران السكري غير السمنة نورموجليسيميك لتمييز خلايا تريج من الخلايا بتريج استخدام التدفق الخلوي. قمنا بإعداد تعليق خلية واحدة فقط من هذه الأجهزة يدوياً. Fluorochrome مترافق السطحية CD4، CD8، CD25، واستخدمت الأجسام المضادة نيوروبيلين 1 وصمة عار الخلايا. وضعوا في الثلاجة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، كانت ملطخة الخلايا fluorochrome مترافق أضداد Foxp3 وهيليوس داخل الخلايا. واستخدمت هذه العلامات لوصف المجموعات اثنين من الخلايا تريغ. هذا البروتوكول يوضح طريقة بسيطة ولكنها عملية لإعداد الخلايا المفردة من الغدة الصعترية مورين، البنكرياس تصب العقدة الليمفاوية والطحال واستخدامها لأغراض تحليل سيتوميتريك تدفق اللاحقة.

للتحقيق في التعبير عن Nrp1 وهيليوس في خلايا تريج وبتريج، إعداد الخلايا المفردة من الغدد الغدة الصعترية، بدلنس والطحال نورموجليسيميك إيماءة الفئران والملون منها مع علامات خلية تريغ CD4، CD25، Foxp3، هيليوس، و Nrp1 لتدفق سيتوميتريك تحليل. تم تحليل النتائج كما هو موضح في الممثل الن?...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry at JoVE.com

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

تحديد المجموعات الفرعية التنظيمية تي الخلية في الغدة الصعترية مورين، البنكرياس تصب العقدة الليمفاوية والطحال باستخدام التدفق الخلوي

وهنا، نقدم بروتوكول لإعداد الخلايا المفردة من الغدة الصعترية مورين، البنكرياس تصب العقدة الليمفاوية والطحال إلى مواصلة دراسة هذه الخلايا باستخدام التدفق الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذا البروتوكول لتحديد مجموعات فرعية الخلايا التائية التنظيمية باستخدام التدفق الخلوي.

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

يساعد هذا البروتوكول في التحقيق في دور الخلايا المناعية في أعضاء معينة في الصحة وعلم الأمراض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن هذه تقنية فعالة من حيث التكلفة لأنها تقنية يدوية. إثبات الإجراء سيكون تشنغكانغ لوه، طالب دكتوراه من مختبري.للبدء، ضع الغدد الصماء والطحال من الفئران القتل الرحيم سابقا في 20 مل فيمحات التلألؤ، أو 15 مل أنابيب المخروطية، مليئة 5 مل من محلول الملح المتوازن هانك. ضع العقد اللمفاوية التي تستنزف البنكرياس في أنابيب صغيرة 1.5 مل مملوءة بـ 1 مل من RPMI-1640. تأكد من استخدام الغدة الصعترية والطحال كله، وجميع من PDLNs.إبقاء الأجهزة على الجليد طوال العملية بأكملها. باستخدام زوج من مقص، والضغط بدقة الغدة الصعترية والطحال لإطلاق الخلايا المناعية. تجاهل كبسولات الزعتر والزبلين المتبقية.نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 433 مرات ز و 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق، والتخلص من فائقة. لlyse خلايا الدم الحمراء، وإعادة تعليق تعليق الخلية في 5 مل من كلوريد الأمونيوم 0.2 الزبار، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق.عكس الأنابيب بلطف كل دقيقتين. في نهاية الحضانة ، أضف 5 مل من HBSS لوقف التحلل. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 433 مرات ز و 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.تجاهل المابير، وإعادة تعليق الخلايا في حوالي 5 مل من HBSS. ثم، ملء الأنابيب مع HBSS. كرر هذه العملية، من الطرد المركزي للعينات لملء الأنبوب مع HBSS، مرة واحدة.أجهزة الطرد المركزي الأنابيب مرة أخرى في 433 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل المابير، وإعادة تعليق بيليه في HBSS. الحصول على 5 مل أنابيب مستديرة القاع مع قبعات خلية مصفاة.نقل 1 مل من تعليق الخلايا الزعترة و 500 ميكرولتر من تعليق الخلية المسيلة إلى الأنابيب عن طريق تطبيق التعليق على أغطية مصفاة الخلية. أولاً، ضع أنبوب مخروطي 15 مل في رف. ضع شبكة معدنية معقم 250 ميكرومتر فوق الأنبوب.شطف شبكة مع 1 مل من RPMI. بعد ذلك، نقل الغدد الليمفاوية إلى شبكة معدنية واستخدام زوج من ملاقط لطحن لهم من خلال شبكة. تطبيق 1 مل من RPMI على شبكة لطرد الخلايا في الأنبوب.كرر هذه العملية لنقل وطحن الغدد الليمفاوية ثلاث مرات لكل عينة، ثم قم بإزالة شبكة. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 433 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل افرا و إعادة تعليق الخلايا في حوالي 5 مل من RPMI.ثم، ملء الأنابيب مع RPMI. كرر هذه العملية، من الطرد المركزي للعينات لملء أنبوب مع دورة في الدقيقة، مرة واحدة. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب مرة أخرى في 433 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.تجاهل افرا وإعادة تعليق بيليه الخلية في 2 مل من RPMI. نقل 2 مل من تعليق الخلية إلى 5 مل أنابيب مستديرة القاع مع أغطية مصفاة الخلية. أولاً، الطرد المركزي تعليق الخلية من الغدة الصعترية والطحال وعينات PDLN في 433 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.تجاهل المُندفع. وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة السطحية كما هو مبين في بروتوكول النص، واحتضان الأنابيب على الجليد لمدة 40 دقيقة. بعد ذلك، إضافة 200 ميكرولترات من العازلة FACS إلى كل أنبوب.أجهزة الطرد المركزي في 433 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق، والتخلص من فائقة. كرر هذه العملية، وإضافة المخزن المؤقت، وrifuging، وتجاهل ااسخاء، مرة واحدة. إعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولتررس من العازلة التثبيت Permeabilization لإصلاح و permeabilize الخلايا.نقل الأنابيب إلى ثلاجة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. وفي اليوم التالي، تم تشغيل أجهزة الطرد المركزي في الأنابيب بمعدل 433 مرة ز وبأربعون درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولترات من عازلة الغسيل permeabilization.أجهزة الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 433 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق والتخلص من افرا. وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة داخل الخلايا، كما هو مبين في بروتوكول النص. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 1 ساعة.بعد هذا، إضافة 500 microliters من عازلة غسل permeabilization إلى كل أنبوب. أجهزة الطرد المركزي في 433 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant، وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولترات من عازلة الغسيل permeabilization.أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 433 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل عظمى وإعادة تعليق بيليه الخلية في 300 ميكرولترات من العازلة FACS. ثم، تحليل الخلايا على جهاز قياس تدفق، كما هو موضح في بروتوكول النص.في هذه الدراسة، يتم عزل الخلايا الفردية من الغدد الصماء، PDLNs والطحال من الفئران العادية إيماءة نسبة السكر في الدم، وملطخة مع علامات الخلايا Treg، CD4، CD25، Foxp3، هيليوس، وsoypilin-1 لتحليل تدفق الخلايا. يتم تحليل النتائج وتظهر هنا على أنها استراتيجيات تمثيلية لـ gating. نسبة الخلايا الإيجابية Helios بين CD4 إيجابية، CD8-السلبية، CD25 إيجابية، وينظر إلى خلايا Treg فوكسب3 إيجابية لتكون أعلى من الخلايا الإيجابية Nrp1 في جميع الأجهزة الثلاثة.وينظر إلى أكثر من 80٪ من خلايا Treg في الغدة الصعترية للتعبير عن هيليوس، وهو أعلى مما هو عليه في PDLN، والطحال. نسبة الخلايا الإيجابية NrP1 بين خلايا Treg الإيجابية Helios تعتبر أعلى في PDLN من تلك الموجودة في الغدة الصعترية أو الطحال. غالبية خلايا Treg إيجابية Nrp1 أيضا التعبير عن هيليوس، ونسبة الخلايا الإيجابية هيليوس بين Nrp1 خلايا Treg إيجابية ينظر إلى أن تكون أعلى في الغدة الصعترية والطحال مما كانت عليه في PDLN.معا, هذه النتائج تشير إلى أن Helios هو علامة أفضل للكشف عن الخلايا Treg T1 من Nrp1. العقد الليمفاوية صغيرة, ولكن بعض علامات داخل الخلايا تتطلب عددا كبيرا من الخلايا لإعطاء إشارة جيدة في تدفق الخلايا. لا يمكن تنفيذ أساليب أخرى بعد هذا الإجراء لأن الخلايا ملطخة بالفعل وميتة.ولكن يمكن استبدال علامات الخلايا الأربع للحيوان لدراسة أنواع أخرى من الخلايا المناعية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

غير الجراحية التقطير داخل الرغامى من الفئران مع تحليل الرئتين والعقد الليمفاوية والرئة التي تصريف التدفق الخلوي

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

التصوير خارج الحي من خلايا تي في الفئران شرائح العقدة الليمفاوية مع Widefield ومجاهر متحد البؤر

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

الفئران عقدة اللمفاوية السطحية جراحة

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital التصوير من العقدة اللمفية الفأر المأبضية

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

جيل من العقدة الليمفاوية الدسم سادة الوهم لدراسة العقدة الليمفاوية اللحمية خلية المنشأ

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

عزل خلايا الفئران العقدة الليمفاوية اللحمية

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

بين الخلايا تلطيخ والتدفق الخلوي لتحديد الخلايا الليمفاوية مجموعات فرعية ضمن الفئران الأورطي، الكلى والغدد الليمفاوية في نموذج من ارتفاع ضغط الدم

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...