Name: induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice
Uploaded: 2019-02-11T13:00:00
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这项研究得到了合作研究中心 221 (CRC/TR221-DFG) 的支持, #324392634; 项目 b03) (至 k. h.) 和 crc 11181 (crc-dfg, 项目 b05) (至 k. h.), 均由德国妇女基金会 (德国研究基金会) 供资。

这里描述的实验方法已经得到了德国巴伐利亚的密特弗兰肯政府的批准。
1. gvhd 感应
<ol><li>第0天: 受体细胞小鼠的全身照射
	<ol>
<li>使用女性 cd45.2+ h2kd+ balb1 小鼠, 这些小鼠至少有10周大的幼鼠作为受者。</li>
		<li>在 gvhd 诱导前称量并记录受体细胞的体重。 请注意:确保受者的最小体重为20克。起始体重将作为计算单个鼠标在 gvhd 诱?...

<ol>
	<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+pathogenesis+of+graft-versus-host+disease.">Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease.</a> British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).</li><li>Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+GvHD:+pathogenesis+and+classification.">Acute GvHD: pathogenesis and classification.</a> Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).</li><li>Naymagon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+graft-versus-host+disease+of+the+gut:+considerations+for+the+gastroenterologist.">Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14, 711-726 (2017).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation.</a> Blood. 127, 3117-3126 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Anthony, B. A., Hadley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+graft-versus-host+disease+and+in+vivo+T+cell+monitoring+using+an+MHC-matched+murine+model.">Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).</li><li>Beilhack, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+acute+graft-versus-host+disease+by+blocking+T-cell+entry+to+secondary+lymphoid+organs.">Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs.</a> Blood. 111, 2919-2928 (2008).</li><li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+colonoscopy+in+live+mice.">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).</li><li>Buchele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Inflammatory+T+Helper+Cells+via+Retinoic+Acid-Related+Orphan+Receptor+Gamma+t+Is+Ineffective+to+Prevent+Allo-Response-Driven+Colitis.">Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).</li><li>Ullrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BATF-dependent+IL-7RhiGM-CSF++T+cells+control+intestinal+graft-versus-host+disease.">BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).</li><li>Kaplan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+antigens+determine+graft-versus-host+disease+phenotype.">Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype.</a> Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).</li></ol>

该方案描述了诱导和微型内镜评估的结肠表型观察过程中的肠道 gvhd。它的作用更广泛的目的, 使科学家能够研究肠道 gvhd 纵向和非侵入整个疾病过程 (即, 从结肠表现和进展的开始, 直到最大的疾病活动)。
然而, 实验者在将技术应用于各自的科学背景之前, 需要注意所提出的方法所固有的一些关键步骤和重要限制。首先, 虽然我们已经成功地使用了微型内窥镜评估肠道 GvHD-relate...

造血恶性肿瘤直接产生的造血干细胞室和不受控制的, 快速进展, 和严重的免疫介导的疾病往往是迹象, 执行全环 hct1,2。然而, 尽管考虑到预后有益的移植物抗肿瘤反应的发生, 供体淋巴细胞经常诱导和促进不需要的免疫介导的攻击健康组织成分在所有 hct 受者, 一个被称为移植物抗宿主病3的过程.肠道中的表现, 即所谓的肠道 gvhd, 是急性 gvhd 最可怕的并发症, 其严重的形式通常与高死亡率1,2,4有关。
总体而言, 小鼠的全聚 hct 模型已成为识别和研究免疫介导机制的宝贵工具, 其发病机制的 gvhd5。然而, 动态评估, 例如, 随着时间的推移, 新的治疗干预措施的有益效果活小鼠通常是基于临床 gvhd 分数6的测定。虽然这些分数适合反映, 例如, 整体疾病负担 (即系统的 gvhd), 临床得分缺乏敏感性, 以可靠地反映器官特定的表现 (例如,在肠道)。因此, 例如关于特定治疗干预措施的肠道保护作用的结论, 以这些评分系统为基础, 通常是不够的。
尽管通过发明新的全身成像模式, 结合生物发光或荧光遗传小鼠模型7,8的结合, 直接和具体的方法取得了重大进展活鼠肠道 gvhd 的评估缺乏。因此, 下一节描述的肠道 gvhd 表型内窥镜评估协议背后的理由是克服这一障碍。此外, 动机还包括减少实验小鼠的数量, 因为到目前为止, 对肠道 gvhd 的细胞、形态和分子特性 (例如,通过组织病理学或分子生物学) 进行了详细评估显化最终需要实验小鼠的牺牲。
我们的机构以前曾报告过在同一性结肠炎模型9 过程中对结肠表现进行小型内镜评估的方法。在这里介绍的协议中, 我们在 mhc 类的 mhc i 中移植同种异体 hct 和供体淋巴细胞后, 对肠道 gvhd 活小鼠的同种异体引起结肠炎的结肠镜评分矩阵进行了细化和调整.我们确定了四个参数, 适合反映肠道 GvHD-related 相关的结肠病变。此外, 我们还建立了一个系统, 允许对任何单个行列式进行微调分级, 从而产生一个新的分数, 很容易通知读者在给定时间点存在的肠道 gvhd 的严重程度。病理组织学分析证实, 超过一定阈值的内窥镜评分可靠地预测中、高级组织炎症。因此, 迷你内窥镜评估似乎是金标准组织病理学的有效替代品, 通常需要实验小鼠的牺牲。重要的是, 该协议几乎可以在任何特定的时间点应用, 并可在疾病发生过程中反复使用, 10、11.此外, 与使用与生物照明有关的方法不同的是, 不需要像转基因小鼠交叉这样的劳动密集和耗时的措施, 因此, 该方法几乎可以应用于任何小鼠。兴趣。
综合来看, 鉴于严重肠道 gvhd 患者的临床观点是有害的, 因此迫切需要快速的科学进步和对免疫发病机制背后的分子机制的更深入的了解。同样, 重要的、合乎道德的考虑要求, 应通过使用最少数量的实验小鼠来获得知识。因此, 通过在实验工作链中对结肠进行连续的微内窥镜评估, 对活体实验小鼠的肠道 gvhd 进行监测和分级, 可以提高研究界探索肠道 gvhd 的公认说法。模型, 如本文中提供的协议中所述和验证。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1249px;" width="1249">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator</td>
			<td style="width:216px;">Gamma-Service Meical GmbH</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:479px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Phosphate-buffered saline (PBS )</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>D8662-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>R8758-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Hypodermic needle (26G)</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">1 mL syring</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:152px;">9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">50 mL tube</td>
			<td style="width:216px;">Sarstedt Ag &#38; Co.KG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Cell strainer with a 40 &#181;m mesh screen</td>
			<td style="width:216px;">BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td style="width:152px;">11209</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">8043.2</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td style="width:152px;">1,048,540,500</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pan T Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-095-130</td>
			<td>magnet cell separation to isolate splenic T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>109822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>110730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Filtrated bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Pan Biotec</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>ingredient of FACS buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well polystyrene V-bottom plates</td>
			<td style="width:216px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">651201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:152px;">352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSRFortessa II flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Insulin syringe with sterile interior (30G)</td>
			<td style="width:216px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:152px;">324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Oxy Vet Oxymat 3</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>oxygen concentrator&#160; for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">NarkoVet&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">213062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Plexiglass chamber&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">214620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Straight Forward Telescope</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>64301 AA</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protection and Examination Sheath</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 C</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Examination Sheath with working channel</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 D</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Biopsy Forceps</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">61071 ZJ&#160;</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;175 Watt SCB XenonLight Source</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">20132120</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber Optic Light Cable</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">495 NL</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 S3 Camera Head</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22220030</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 SCB Camera Control Unit</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22200020</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">LCD monitor</td>
			<td style="width:216px;">Olympus</td>
			<td>OEV181H</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forane / Isofluran</td>
			<td>AbbVie Inc.&#160;</td>
			<td>B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution 37 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">7398.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5,0 mL Dispenser tip&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eppendorf AG</td>
			<td align="right">30089456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice

急性移植物抗宿主病 (gvhd) 是最严重的并发症, 患者以前接受异基因造血干细胞移植 (allo-hct) 的脸, 并经常与不良的临床结果。例如, 皮肤的 gvhd 表现通常对既定的免疫抑制疗法有反应, 因此, 没有采取致命的过程, 肠道 gvhd 的存在和强度, 特别是肠道的中下部,治疗方案基本上仅限于传统的免疫抑制剂, 只对轻度疾病的缓解作用。因此, 迫切需要详细了解组织驻场免疫级联、肠道微生物群的变化以及肠道 gvhd 发病前、肠前和肠道后的基质反应, 以了解其组织居民免疫级联的事件和机制。并开发创新的治疗方案。小鼠模型的 gvhd 经常被用来识别和功能评估分子和途径, 假定驱动肠道 gvhd。然而, 随着时间的推移, 专门监测和评估肠道炎症的手段基本上是缺乏的, 因为评估和评分急性 gvhd 的既定分数通常是由各种参数, 而反映了系统性 gvhd表现。肠道 gvhd 的详细评估仅限于使用安乐死小鼠的研究, 因此基本上排除了在特定实验条件下 (例如抗体介导) 结肠室的纵向 (即动力学) 分析在活小鼠 (即体内) 中阻断促炎细胞因子。这里描述的对所有 hct 治疗小鼠远端结肠的微型内镜原位评估允许: (a) 对肠道炎症的不同方面进行详细的宏观评估, b) 收集组织样本进行下游分析的选项, 可在观察期间的不同时间点。总体而言, 微型内窥镜方法为临床前无创监测和评估肠道 gvhd 提供了一项重大进展。

目前的协议, 描述了肠道内镜评估的肠道 gvd 相关病变的远端结肠, 已建立和验证的小鼠以前受到严重急性 gvhd 模型的系统诱导。在这项研究中, 我们使用 mhc 类完全不匹配的模型系统, 其中 balb1 小鼠进行了致命的辐照, 其次是 t-细胞耗尽的异基因骨髓的移植和 gvhd 诱导的异位反应 c57bl6 cd3 + 的给药t 淋巴细胞。采用磁选技术对 gvhd 诱导的 t 细胞耗尽骨髓细胞和脾脏 t ?...

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Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

活小鼠肠道移植物对宿主病的诱导及微内窥镜评价

在这里, 我们提出了一个协议, 描述异基因造血干细胞移植, 并允许重复的微内窥镜评估远端结肠原位的存在, 特点, 和严重程度的结肠炎症在生活患有肠道移植物抗宿主病的小鼠。

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

对活鼠结肠的微型内窥镜评估为研究急性图与宿主疾病GvHD的肠道表现提供了关键的实验支持，包括全源性造血干细胞移植。急性GvHD相关结肠炎的非侵入性评估可以作为金本位组织病理学的工作替代品，从而使动物重复牺牲以获得组织标本变得没有必要。演示程序将是维拉布切尔，一个后医生从我的实验室。在接收者BALB/c小鼠全身照射一天后，将一只CD-45.1活体5B6 SJL供体小鼠放在清洁工作护套上的易发位置，并使用一个13厘米的弯曲和锯齿状尖的模拟钳子将毛皮抬到一个致命弱点上。使用硬化的8.5厘米细剪刀与直尖，切开钳子和一脚跟之间的皮肤，拉长切口颅，以方便从后肢去除皮肤和毛皮。当皮肤从后肢上取下时，切开每个臀部、脚踝和膝盖关节。将每个后肢的大腿和柄存放在一个装满 PVS 的 92 毫米 Petri 盘中，并小心地从每块骨头上取出尽可能多的肌肉，将每个清洁的股骨和头骨转移到湿冰上无菌 RPMI 1640 介质的 50 mL 管中。要分离骨髓，一次将一根骨头转移到一个新的92-mL培养皿中，里面装满了新鲜的RMRI 1640培养基，然后用手术刀切掉每根骨头的末端。接下来，使用装有 26 米针的 1 mL 注射器，一次用 1 mL 新鲜介质冲洗骨骼，并放入含有 5 mL 介质的 50 mL 收集管中。当所有骨骼都齐冲洗后，轻轻移液，上下移液，产生单细胞悬浮液，然后通过40微米网状细胞滤网将细胞过滤到新的50 mL收集管中。通过离心使细胞分裂，并在5 mL氯化铵钾解液缓冲液中重新悬浮细胞，在室温下孵育3分钟。在孵育结束时，停止与10mL的PVS反应，并再次离心细胞。将颗粒重新悬浮在2 mL新鲜PVS中进行计数，并留出6倍10至第六细胞等分，用于下游流量细胞测量分析。接下来，使用市售的细胞纯化试剂盒，根据制造商的指示，从骨髓单细胞悬浮液中对CD90.2阳性T细胞进行磁力消耗，并留出1倍10至第六细胞等分的T细胞耗竭的除液，用于下游细胞对细胞纯度和成分的分离前和分离后的分析。然后，使用装有30量针的1mL注射器，将5倍10注射到5倍的T细胞耗尽的骨髓细胞中，100微升PVS静脉注射到每个受辐射接受动物静脉窦的回溯柱空间中。第二天，将从捐赠动物身上采集的脾脏放入 50 mL 收集管中的 40 微米网状过滤器上，并使用注射器柱塞将脾脏组织通过过滤器压入管中。用PVS清洗过滤器和柱塞，收集所有飞毛细胞，通过离心对细胞进行颗粒化。红细胞解压后，重新悬浮白细胞进行计数，并留出六倍10至第六细胞等分，用于下游流量细胞计量分析。对于完全CD3阳性T细胞从总孢子细胞分离，使用市售细胞纯化套件根据制造商的指示，并留出1倍10至第六CD3阳性T细胞等分，用于下游流细胞对细胞纯度和成分分离前的和分离后的分析。然后，将7倍10注射到第五个全活性CD3阳性T细胞中，在100微升PVS静脉注射到每个接受小鼠的逆光杆空间，以诱导GvHD。要通过心骨结直肠区域的迷你内窥镜对GvHD相关病变进行评分，请用一只手抬起尾根上方的受接受动物的尾巴，用另一只手通过肛门小心地将内窥镜插入直肠。当气流膨胀结肠直肠流明时，缓慢而小心地将内窥镜向前移动。为避免结肠肠损伤，请使用实时视频屏幕将内窥镜放在流明的中间区域，以帮助进行此定位。开始录制视频流并评分炎症，通过按图所示对参数进行评分来评估结肠的GvHD相关炎症。找到计分点后，轻轻移动内窥镜，然后稍微来回移动，以评估不同的参数。要评估参数半透明性和大便一致性，请将内窥镜相对于结肠壁的内窥镜定位在更宽的距离。要评估病变的粒度和血管性，将内窥镜定位在靠近结肠壁的位置，并小心地用内窥镜的尖端将良好的张力应用到结肠壁上。完成评分过程后，停止录制。与对照组相比，所证明的同源造血干细胞移植可产生全身GvHD表型的可重复的强健诱导，接受动物的临床GvHD分数逐渐增加。这些可评估的迷你内窥镜标准是专门根据先前报告的合成结肠炎在异体反应驱动的结肠炎评分参数的背景下，对远端结肠肠道GvHD疾病相关病变的精确描述、评分和评分。事实上，基于微型内窥镜的分级系统能够很容易地对患有肠道炎症严重迹象的供体淋巴细胞接收小鼠进行歧视，这些小鼠基本上没有GvHD。 基于微型内窥镜的分级系统组织病理学研究证实，受GvHD相关炎症严重影响的小鼠的结肠表现出同样强烈的炎症组织病理迹象。相比之下，对照小鼠的结肠组织对炎症的轻度组织病理学症状表现出的不明显，这与实际上没有可检测到的结肠炎小内窥镜迹象一致。此外，迷你内窥镜和组织病理学评估结肠炎活动与系统GvHD分数之间的相关研究表明，迷你内窥镜确定一些分数小于或等于三，可靠地预测缺乏中高档肠道GvHD相关结肠炎症分数从组织病理学评分获得。此外，内窥镜评估肠道GvHD的严重程度显示与全身GvHD疾病活动相关。为了标准化结肠炎症的微型内窥镜评估结果，并确保不同小鼠和实验的可比性，应选择一个定义的解剖位点进行评分。除了评分结肠炎症外，微型内窥镜设置内内置的工作通道还允许检索适用于各种下游分析的视图引导组织活检，如标准组织病理学。由于迷你内窥镜的非侵入性，急性GvHD相关结肠炎几乎可以在任何时间在同一动物中反复评估，从而产生对肠道GvHD的迷人见解。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

SJL小鼠诱导实验性自身免疫性垂体炎

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

科研

免疫与感染

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

移植物抗宿主病的诱导和<em在体内</em&gt; T细胞监测中的应用MHC匹配的小鼠模型

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

诱导小鼠肠道炎症由效应CD4的过继转移<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高</sup&gt; T细胞免疫缺陷小鼠

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

在免疫细胞在不同组织与疾病相关的分布和小鼠实验评价性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

在小鼠实验为细菌性肺炎的诱导和表型非侵入性和技术上非密集型方法

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

从小鼠在原代肝细胞培养物的炎性反应的诱导

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

人精切肺切片中物质的细胞毒性及免疫调节作用的评价

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

在异种性鼠模型中的移植-无源疾病的诱导和评分,以及使用数字PCR对小鼠组织中人类T细胞的定量

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

诱导BALB/c小鼠药物诱导的自身免疫性肝炎研究其致病机制

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

骨髓移植平台研究树突状细胞在移植与宿主疾病中的作用

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...