Name: induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice
Uploaded: 2019-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af den kollaborative forskning Centre (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; projekt B03) (til K.H.) og CRC 1181 (CRC-DFG, projekt B05) (til K.H.), begge finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tysk Research Foundation).

De eksperimentelle metoder beskrevet her er blevet godkendt af regeringen i Mittel, Bayern, Tyskland.
1. GvHD induktion
<ol><li>Dag 0: Kroppens samlede bestråling af de modtagende mus
	<ol>
<li>Bruge kvindelige CD45.2+ H2kd+ BALB/c mus der er mindst 10 uger gammel som modtagere.</li>
		<li>Vejer og vægt af de modtagende mus før GvHD induktion. Bemærk: Sikre, at modtageren har en minimal vægt 20 g. Start kropsvægten vil tjene so...

<ol>
	<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+pathogenesis+of+graft-versus-host+disease.">Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease.</a> British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).</li><li>Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+GvHD:+pathogenesis+and+classification.">Acute GvHD: pathogenesis and classification.</a> Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).</li><li>Naymagon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+graft-versus-host+disease+of+the+gut:+considerations+for+the+gastroenterologist.">Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14, 711-726 (2017).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation.</a> Blood. 127, 3117-3126 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Anthony, B. A., Hadley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+graft-versus-host+disease+and+in+vivo+T+cell+monitoring+using+an+MHC-matched+murine+model.">Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).</li><li>Beilhack, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+acute+graft-versus-host+disease+by+blocking+T-cell+entry+to+secondary+lymphoid+organs.">Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs.</a> Blood. 111, 2919-2928 (2008).</li><li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+colonoscopy+in+live+mice.">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).</li><li>Buchele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Inflammatory+T+Helper+Cells+via+Retinoic+Acid-Related+Orphan+Receptor+Gamma+t+Is+Ineffective+to+Prevent+Allo-Response-Driven+Colitis.">Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).</li><li>Ullrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BATF-dependent+IL-7RhiGM-CSF++T+cells+control+intestinal+graft-versus-host+disease.">BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).</li><li>Kaplan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+antigens+determine+graft-versus-host+disease+phenotype.">Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype.</a> Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).</li></ol>

Protokollen beskriver metode til induktion og mini-endoskopisk vurdering af Colon fænotype observeret i løbet af intestinal GvHD. Det tjener det større formål af gør det muligt for forskere at studere intestinal GvHD på langs og noninvasively over det hele sygdomsforløb (dvs. fra starten af Colon manifestation og progression indtil maksimal sygdomsaktivitet).
Der er imidlertid nogle kritiske trin og vigtige begrænsninger iboende at de præsenterede metoder eksperimentatoren skal være ...

Hæmatopoietisk maligniteter som hidrører direkte fra hæmatopoietisk stamcelle rum og ukontrolleret, er hurtigt forløber, og svær immun-medierede sygdomme ofte tegn på at udføre allo-HCT1,2. Selv om regnskab for forekomst af prognostiske gavnlige graft-versus-tumor respons, er donor lymfocytter dog ofte overtalelse og fremme en uønsket immun-medieret angreb af sunde væv komponenter i allo-HCT modtageren , en proces, der kaldes graft - versus - host-sygdommen3. Manifestationer i tarmen, den såkaldte intestinal GvHD, repræsenterer den mest frygtede komplikation til akut GvHD, alvorlige former som er rutinemæssigt forbundet med en høj dødelighed1,2,4.
Samlede, murine modeller af allo-HCT er dukket op som uvurderlige værktøjer til at identificere og undersøge immun-medierede mekanismer patogenesen af GvHD5. Dog kinetic vurdering af, for eksempel, gavnlige virkninger af nye terapeutiske interventioner over tid i levende mus er rutinemæssigt baseret på bestemmelse af kliniske GvHD scorer6. Mens disse scores er egnet til at afspejle, for eksempel, den samlede sygdom byrde (dvs. den systemiske GvHD), kliniske scorer manglende følsomhed for at pålideligt spejle orgel-specifikke manifestationer (f.eks., i tarmen). Derfor, konklusioner, for eksempel med hensyn til gut-beskyttende virkninger af en given terapeutisk intervention, der er baseret på disse scoring systemer normalt kommer til kort.
Trods store fremskridt gennem opfindelsen af romanen hele kroppen imaging modaliteter i kombination med brug af enten en bioluminescerende eller fluorescerende genetiske mus modeller7,8, metoder til direkte og specifikt vurdere den intestinale manifestation af GvHD i levende mus mangler. Rationalet bag protokollen af endoskopisk vurderingen af intestinal GvHD fænotype beskrevet i næste afsnit er derfor, at overvinde denne hindring. Motivationen er derudover også at reducere eksperimentelle mus tal siden hidtil, en detaljeret vurdering af de cellulære, morfologiske og molekylære karakteristika (f.eks., ved histopatologi eller Molekylærbiologi) af intestinal GvHD manifestation har i sidste ende kræves ofringen af eksperimentelle musen.
Vores institution har tidligere rapporteret på metode for en mini-endoskopisk vurdering af Colon manifestationer i løbet af syngeneic colitis modeller9. I protokollen præsenteres her, har vi forfinet og tilpasset den colonoscopic scoring matrix for alloresponse-drevet colitis i levende mus med tarm GvHD ved transplantation af alloreactive HCT og donor lymfocytter i en MHC klasse jeg helt forkert indstilling . Vi identificerede fire parametre egnet til at afspejle intestinal GvHD-relaterede Colon læsioner. Desuden, vi etableret et system, der tillader en finjusteret sortering af en enkelt faktor, hvilket resulterer i en ny score, der let informerer læseren om sværhedsgraden af intestinal GvHD stede i en given musen på et givet tidspunkt. Histopatologisk analyser bekræftet, at en endoskopisk score over en vis tærskel er pålideligt at forudsige moderat til høj grade væv betændelse. Derfor, mini-endoskopisk evaluering synes at repræsentere en arbejdende erstatning for den guld standard histopatologisk undersøgelse, der rutinemæssigt kræver ofringen af de eksperimentelle mus. Vigtigst, denne protokol kan anvendes til næsten enhver given tid og kan bruges flere gange i løbet af sygdommen10,11. Desuden, i modsætning til brugen af bioluminescens-afhængige tilgange, ingen labor-intens og tidskrævende foranstaltninger som intercrossing genetisk modificerede mus er påkrævet, og dermed metoden kan anvendes på stort set alle mus linje af interesse.
Taget under ét, givet den skadelige klinisk perspektiv af allo-HCT patienter med svær intestinal GvHD, er hurtige videnskabelige fremskridt og større indsigt i de molekylære mekanismer bag immun patogenesen tvingende nødvendigt. Vigtigt, etiske overvejelser kræver ligeledes, at gevinst på viden bør opnås med brugen af det minimale antal eksperimentelle mus. Derfor anerkendte både fordringer på Fællesskabets forskning at udforske intestinal GvHD kan være avanceret ved at gennemføre serie mini-endoskopisk evalueringer af tyktarmen i eksperimentelle arbejde kæden til at overvåge og grade intestinal GvHD i live eksperimentelle mus modeller, som beskrevet og valideret i protokollen præsenteres her.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1249px;" width="1249">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator</td>
			<td style="width:216px;">Gamma-Service Meical GmbH</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:479px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Phosphate-buffered saline (PBS )</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>D8662-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>R8758-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Hypodermic needle (26G)</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">1 mL syring</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:152px;">9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">50 mL tube</td>
			<td style="width:216px;">Sarstedt Ag &#38; Co.KG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Cell strainer with a 40 &#181;m mesh screen</td>
			<td style="width:216px;">BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td style="width:152px;">11209</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">8043.2</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td style="width:152px;">1,048,540,500</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pan T Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-095-130</td>
			<td>magnet cell separation to isolate splenic T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>109822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>110730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Filtrated bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Pan Biotec</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>ingredient of FACS buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well polystyrene V-bottom plates</td>
			<td style="width:216px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">651201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:152px;">352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSRFortessa II flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Insulin syringe with sterile interior (30G)</td>
			<td style="width:216px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:152px;">324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Oxy Vet Oxymat 3</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>oxygen concentrator&#160; for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">NarkoVet&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">213062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Plexiglass chamber&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">214620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Straight Forward Telescope</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>64301 AA</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protection and Examination Sheath</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 C</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Examination Sheath with working channel</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 D</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Biopsy Forceps</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">61071 ZJ&#160;</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;175 Watt SCB XenonLight Source</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">20132120</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber Optic Light Cable</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">495 NL</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 S3 Camera Head</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22220030</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 SCB Camera Control Unit</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22200020</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">LCD monitor</td>
			<td style="width:216px;">Olympus</td>
			<td>OEV181H</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forane / Isofluran</td>
			<td>AbbVie Inc.&#160;</td>
			<td>B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution 37 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">7398.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5,0 mL Dispenser tip&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eppendorf AG</td>
			<td align="right">30089456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice

Akut graft - versus - host-sygdommen (GvHD) repræsenterer den mest alvorlige komplikation at patienter tidligere i allogen hæmatopoietisk stamcelle transplantation (allo-HCT) ansigt og er ofte forbundet med en dårlig klinisk resultat. Stykke tid, for eksempel GvHD manifestationer af huden er normalt lydhør over for etablerede immun-undertrykkende behandlingsformer og, derfor, tage ikke en fatal kurs, tilstedeværelse og intensiteten af intestinal GvHD, især af de mid-til-nedre dele af tarmen, påvirke stærkt resultatet og samlet overlevelse af patienter med akut GvHD. terapeutiske muligheder er hovedsagelig begrænset til de klassiske immun-undertrykkende agenter giver kun moderat sygdom-formildende effekter. Derfor, detaljeret viden om væv-resident immun kaskade, ændringer i den tarmens mikrobiota, og stromale svaret før, på og efter tarm GvHD indsættende det er tvingende nødvendigt at forstå de begivenheder og underliggende mekanismer sin patogenese og udvikle nyskabende terapeutiske muligheder. Murine modeller af GvHD er ofte ansat til at identificere og funktionelt vurdere molekyler og veje derfor køre intestinal GvHD. Dog mangler midler til specielt at overvåge og evaluere tarmbetændelse over tid væsentlige da etablerede noder til at vurdere og grade akut GvHD rutinemæssigt består af forskellige parametre, som snarere afspejler systemisk GvHD manifestationer. Den detaljerede evaluering af intestinal GvHD er blevet begrænset til undersøgelser ved hjælp af aflivede mus, derved hovedsagelig undtagen længderetningen (dvs., kinetic) analyser af Colon rum under en given eksperimentelle tilstand (fx antistof-medieret blokade af en proinflammatoriske cytokin) i levende mus (dvs., i vivo). Mini-endoskopisk in situ vurderingen af den distale colon af allo-HCT-behandlede mus beskrevet her tillader en) en detaljeret makroskopisk evaluering af forskellige aspekter af tarmbetændelse og b) mulighed for at indsamle vævsprøver for downstream analyser på forskellige tidspunkter i løbet af observationsperioden. Generelt, den mini-endoskopiske tilgang giver et stort fremskridt i prækliniske noninvasive overvågning og vurdering af intestinal GvHD.

Den nuværende protokol, der beskriver den mini-endoskopisk evaluering af intestinal GvHD-associeret læsioner af den distale colon, er etableret og godkendt i mus tidligere udsat for systemisk induktion af en svær akut GvHD model. I denne undersøgelse, brugte vi en MHC klasse jeg fuldt uoverensstemmende modelsystem i hvilke BALB/c mus var lethally bestrålet, efterfulgt af transplantation af T-celle-forarmet allogen knoglemarv og administration af GvHD-inducerende alloreactive C57BL/6 ...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Induktion af Intestinal Graft - versus host klovesyge og sin Mini-endoskopisk vurdering i levende mus

Vi præsenterer her, en protokol, der beskriver allogene hæmatopoietisk stamcelletransplantation og tillader gentagne mini-endoskopisk evalueringer af den distale colon på levestedet for tilstedeværelse, egenskaber og sværhedsgraden af Colon betændelse i live mus lider af intestinal graft - versus - host sygdom.

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Mini-endoskopisk evaluering af tyktarmen i levende mus giver vigtige eksperimentelle støtte til undersøgelse af tarm manifestationer af akut graf-versus-host sygdom, GvHD, på allogen, hæmatopoietisk stamcelletransplantation. Den ikke-invasive vurdering af akut GvHD-relateret colitis kan fungere som en fungerende erstatning for guldstandard histopatologi, hvorved gentagne dyreofringer for at opnå vævsprøver unødvendige. At demonstrere proceduren vil være Vera Buchele, en post-doc fra mit laboratorium.En dag efter total-krop bestråling af modtageren BALB / c mus, placere en CD-45.1 levende 5B6 SJL donor mus i den udsatte position på en ren arbejdsskive, og bruge en 13-cm buet og savtakket spids af en simkin pincet til at løfte pelsen på en Achilles hæl. Brug hærdet 8,5 cm fin saks med lige tips, incise huden mellem snænder og en hæl, aflange indsnittet kranielly at lette fjernelse af hud og pels fra baglemmer. Når huden er blevet fjernet fra baglemmer, skæres gennem hver hofte, ankel, og knæleddet.Opbevar låret og skaftet af hver baglem i en enkelt 92 mm petriskål fyldt med PVS på is og fjern forsigtigt så mange muskler som muligt fra hver knogle, hvor hver renset lårben og skinneben overføres til et 50-ml rør sterilt RPMI 1640-medium på våd is. At isolere knoglemarven, overføre en knogle ad gangen i en ny 92-ml petriskål fyldt med frisk RPMI 1640 medium, og bruge en skalpel til at skære enderne ud af hver knogle. Brug derefter en 1-ml sprøjte udstyret med en 26-gauge nål til at skylle knoglerne med 1 ml frisk medium ad gangen i et 50-ml opsamlingsrør, der indeholder 5 ml medium.Når alle knoglerne er skyllet, pipetters forsigtigt de smuldrende knoglemarvsstykker op og ned flere gange for at generere en enkeltcellesuspension, før cellerne filtreres gennem en cellesien på 40 mikrometer i et nyt 50-ml opsamlingsrør. Cellerne pellets ved centrifugering, og cellerne suspenderes igen i 5 ml ammoniumchloridkalumlyisbuffer i en tre minutters inkubation ved stuetemperatur. Ved slutningen af inkubationen skal reaktionen stoppes med 10 ml PVS, og cellerne centrifugeres igen.Pellet i 2 ml frisk PVS til optælling suspenderes igen, og der afsættes en 6 gange 10 til den sjette celle aliquot til cytometrisk analyse af strømstrømmen. Dernæst skal du bruge et kommercielt tilgængeligt cellerensningssæt til magnetisk at nedbryde cd90,2-positive T-celler fra knoglemarvenseningcelleaffjedring i henhold til producentens anvisninger og afsætte en gange 10 til den sjette celle aliquot af T-celle-forarmet eluat til downstream flow cytometrisk analyse af cellerenhed og sammensætning før og efter adskillelse. Brug derefter en 1 ml sprøjte udstyret med en 30-gauge nål til at injicere fem gange 10 til den femte T-celle-forarmet knoglemarvsceller i 100 mikroliter af PVS intravenøst ind i retrobulbar rummet af venøs sinus af hver bestrålet modtager dyr.Den næste dag, placere en milt høstet fra et donordyr på en 40-mikrometer mesh si i en 50-ml indsamling rør, og bruge en sprøjte stemplet til at presse milten væv gennem sien ind i røret. Vask sien og stemplet med PVS for at indsamle alle miltytterne, og pellet cellerne ved centrifugering. Efter røde blodlegemer lysis er påvist, re-suspendere de hvide blodlegemer til optælling, og der er afsat en seks gange 10 til den sjette celle aliquot for downstream flow cytometrisk analyse.For en total CD3-positiv T-celle isolation fra samlede splenocytter, skal du bruge en kommercielt tilgængelig cellerensning kit i henhold til producentens anvisninger, og der er afsat en gange 10 til den sjette CD3-positive T-celle aliquot fra den positive celle fraktion for downstream flow cytometrisk analyse af celle renhed og sammensætning før og efter adskillelse. Derefter injiceres syv gange 10 til den femte alloreaktive CD3-positive T-celler i 100 mikroliter PVS intravenøst ind i retrobulbarrummet på hver modtagermus for at fremkalde GvHD. For at score GvHD-relaterede læsioner ved mini-endoskopi af den distale kolorektal region, løft halen af en modtager dyr lige over haleroden med den ene hånd, og bruge den anden hånd til omhyggeligt at indsætte endoskopet i endetarmen via anus.Mens luftstrømmen puster farveøktale lumen op, skal du langsomt og forsigtigt flytte endoskopet fremad i aboral retning. For at undgå colon tarm skader, holde endoskopet i midten af lumen ved hjælp af live video skærmen til støtte i denne positionering. Begynd at optage videostreamen og score betændelsen og evaluere GvHD-relateret betændelse i tyktarmen ved at score parametrene som illustreret.Når en scoringsplads er placeret, skal du flytte endoskopet forsigtigt og lidt frem og tilbage for at vurdere de forskellige parametre. For at vurdere parameterens gennemsigtighed og afføringskonsistens skal endoskopet placeres i en bredere afstand i forhold til den colone væg. For at vurdere læsionens granularitet og vaskularisering skal endoskopet placeres i nærheden af den colone væg og forsigtigt påføre den velbesøgte spænding på den colon væg med spidsen af endoskopet.Når scoringsprocessen er afsluttet, skal du stoppe optagelsen. Sammenlignet med kontroller, allogen hæmatopoieic stamcelletransplantation som påvist producerer en reproducerbar robust induktion af en systemisk GvHD fænotype, med gradvist stigende kliniske GvHD scores i recipientdyr. Disse mini-endoskopisk assessable kriterier blev specifikt tilpasset fra tidligere rapporterede syngeneic colitis i forbindelse med allo-respons-drevne colitis scoring parametre for den præcise beskrivelse, scoring, og klassificering af tarm GvHD-sygdom-relaterede læsioner i det distale kolon.Faktisk muliggør mini-endoskopisk baseret klassificeringssystem en nem forskelsbehandling af donor-lymfocyt-modtagende mus med alvorlige tegn på tarmbetændelse fra kontrolmus, der stort set er blottet for GvHD. Ugyldiggørelse af de mini-endoskopisk baserede klassificeringssystem histopatologiske undersøgelser bekræftede, at tyktarmen af mus alvorligt ramt af GvHD-relateret inflammation udviser tilsvarende stærke histoologiske pattetegn på inflammation. I modsætning hertil viste kolon væv af kontrol mus ingen til, på de fleste, milde histopatologiske tegn på betændelse, i overensstemmelse med den virtuelle mangel på mini-endoskopisk påviselige tegn på colitis.Desuden viser korrelationsundersøgelser mellem mini-endoskopisk og histopatologisk vurderet colitisaktivitet og systemiske GvHD-scorer, at mini-endoskopisk bestemmes nogle scorer på mindre endoskopisk, hvilket pålideligt forudsiger fraværet af mellem-til-højere grad intestinal GvHD-associeret kolon inflammationsscorer opnået ved histopatologisk klassificering. Desuden viser sværhedsgraden af den endoskopisk vurderede tarm GvHD en sammenhæng med systemisk GvHD sygdomsaktivitet. For at standardisere resultaterne af mini-endoskopisk evaluering af colon inflammation og for at sikre sammenlignelighed på tværs af forskellige mus og eksperimenter over tid, bør et defineret anatomisk sted vælges til scoring.Ud over at score colon inflammation, den indbyggede arbejdskanal inden for mini-endoskopisk setup giver mulighed for at hente visning-guidede væv biopsier gælder for forskellige downstream analyser, såsom standard histopatologi. På grund af mini-endoskopiens ikke-invasive karakter kan akut GvHD-relateret colitis gentagne gange vurderes inden for samme dyr på stort set ethvert tidspunkt, hvilket giver fascinerende indsigt i tarm-GvHD.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion af graft-versus-host sygdom og<em&gt; In Vivo</em&gt; T Cell Monitoring Brug en MHC-matchet murin model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion af murine tarmbetændelse ved adoptiv overførsel af effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høj</sup&gt; T celler i immunsvækkede mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induktion af Experimental Autoimmune Encephalomyelitis i mus og evaluering af sygdommen-afhængige Fordeling af immunceller i forskellige væv

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

En ikke-invasiv og Teknisk Ikke-intensive Metode til induktion og fænotype for Eksperimentel bakteriel lungebetændelse i mus

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

Induktion af et inflammatorisk respons i Primary hepatocytkulturer fra mus

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Vurdering af den cytotoksiske og immunmodulerende virkninger af stoffer i menneskelige præcision-cut lunge skiver

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Induktion og scoring af graft-versus-Host-sygdom i en xenogen Murinmodel og kvantificering af humane T-celler i muse væv ved hjælp af digital PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Induktion af lægemiddelinduceret, autoimmun hepatitis i BALB / c-mus til undersøgelse af dets patogene mekanismer

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Knoglemarvstransplantation platform til at undersøge den rolle, dendritiske celler i Graft-versus-Host Sygdom

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...