Name: induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice
Uploaded: 2019-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door de gezamenlijke onderzoek centra (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; project B03) (naar K.H.) en CRC 1181 (CRC-DFG, project B05) (naar K.H.), beide gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Duits Research Foundation).

De experimentele methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de regering van Oberbayern, Beieren, Duitsland.
1. GVGH-inductie
<ol><li>Dag 0: Totale lichaam bestraling van de ontvangende muizen
	<ol>
<li>Gebruik van de vrouwelijke CD45.2+ H2kd+ BALB/c muizen die ten minste 10 oud als ontvangers weken.</li>
		<li>Wegen en het gewicht van de ontvangende muizen voorafgaand aan GVGH-inductie. Opmerking: Zorg ervoor dat de on...

<ol>
	<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+pathogenesis+of+graft-versus-host+disease.">Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease.</a> British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).</li><li>Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+GvHD:+pathogenesis+and+classification.">Acute GvHD: pathogenesis and classification.</a> Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).</li><li>Naymagon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+graft-versus-host+disease+of+the+gut:+considerations+for+the+gastroenterologist.">Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14, 711-726 (2017).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation.</a> Blood. 127, 3117-3126 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Anthony, B. A., Hadley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+graft-versus-host+disease+and+in+vivo+T+cell+monitoring+using+an+MHC-matched+murine+model.">Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).</li><li>Beilhack, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+acute+graft-versus-host+disease+by+blocking+T-cell+entry+to+secondary+lymphoid+organs.">Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs.</a> Blood. 111, 2919-2928 (2008).</li><li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+colonoscopy+in+live+mice.">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).</li><li>Buchele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Inflammatory+T+Helper+Cells+via+Retinoic+Acid-Related+Orphan+Receptor+Gamma+t+Is+Ineffective+to+Prevent+Allo-Response-Driven+Colitis.">Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).</li><li>Ullrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BATF-dependent+IL-7RhiGM-CSF++T+cells+control+intestinal+graft-versus-host+disease.">BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).</li><li>Kaplan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+antigens+determine+graft-versus-host+disease+phenotype.">Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype.</a> Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).</li></ol>

Het protocol beschrijft de methodologie van inductie en mini-Endoscopische beoordeling van het Colon fenotype waargenomen in de loop van intestinale GVGH. Het serveert het bredere doel van het toelaten van wetenschappers die het bestuderen van intestinale GVGH lengterichting en noninvasively in de gehele ziekte loop (dat wil zeggen, vanaf het begin van het Colon manifestatie en de progressie tot maximale ziekte-activiteit).
Er zijn echter enkele kritische stappen en belangrijke beperkingen die...

Hematopoietische maligniteiten die rechtstreeks voortvloeien uit het compartiment hematopoietische stamcellen en ongecontroleerde, zijn snel vordert, en ernstige immuun-gemedieerde aandoeningen vaak aanwijzingen voor het uitvoeren van allo-HCT1,2. Hoewel boekhouding voor het vóórkomen van de prognostische gunstig graft-versus-tumor reactie, zijn donor lymfocyten echter vaak inducerende en bevordering van een ongewenste immuun-gemedieerde aanval van gezond weefsel componenten binnen de allo-HCT-ontvanger , een proces dat graft - versus - host-ziekte3 heet. Uitingen in de darm, de zogenaamde intestinale GVGH, vertegenwoordigen de meest gevreesde complicatie van acute GVGH, ernstige vormen van die routinematig geassocieerd met een hoge mortaliteit1,2,4 worden.
Algemene, lymfkliertest modellen van allo-HCT opgedoken als waardevolle instrumenten te identificeren en immuun-gemedieerde mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van GVGH5te bestuderen. Echter, kinetische beoordeling van, bijvoorbeeld, gunstige effecten van nieuwe therapeutische ingrepen na verloop van tijd in levende muizen routinematig berust op de vaststelling van klinische GVGH scoort6. Terwijl deze scores geschikt om na te denken zijn, bijvoorbeeld, de totale ziektelast (dat wil zeggen, de systemische GVGH), klinische scoort ontbreken de gevoeligheid betrouwbaar gespiegeld orgel-specifieke manifestaties (b.v., in de darm). Vandaar, conclusies, bijvoorbeeld met betrekking tot de gut-beschermende effecten van een bepaalde therapeutische interventie, die zijn gebaseerd op deze systemen meestal scoren tekortkomen.
Ondanks de grote vooruitgang door de uitvinding van nieuwe gehele lichaam imaging modaliteiten in combinatie met het gebruik van beide bioluminescente of TL genetische muis modellen7,8, methodologieën om rechtstreeks en specifiek beoordelen de intestinale manifestatie van GVGH in levende muizen ontbreken. Vandaar, de grondgedachte achter het protocol van de Endoscopische beoordelingvan de intestinale GVGH fenotype beschreven in de volgende sectie is het overwinnen van deze hindernis. Bovendien, de motivatie ook is om experimentele muizen nummers sinds, tot nu toe een gedetailleerde evaluatie van de moleculaire, cellulaire en morfologische kenmerken (bijvoorbeeld, door histopathologie of moleculaire biologie) voor intestinale GVGH manifestatie heeft uiteindelijk het offer van de experimentele muis nodig.
Onze instelling heeft eerder gerapporteerd over de methodologie van een mini-Endoscopische beoordeling van Colon manifestaties in de loop van syngeneic ulcerosa modellen9. In het protocol hier gepresenteerd, hebben we verfijnd en aangepast de colonoscopic matrix scoren voor alloresponse-gedreven colitis in levende muizen met intestinale GVGH na transplantatie van alloreactive HCT en donor lymfocyten in een MHC klasse ik volledig verkeerde instelling . We geïdentificeerd vier parameters geschikt om na te denken van intestinale GVGH-gerelateerde Colon laesies. Bovendien vastgesteld we een systeem dat toelaat een verfijnd sortering van enkele determinant, resulterend in een nieuwe stand die gemakkelijk de lezer over de ernst van intestinale GVGH aanwezig in een bepaalde muis op een bepaald tijdstip informeert. Histopathologische analyses bevestigd dat een Endoscopische score boven een bepaalde drempel is betrouwbaar het voorspellen van matige tot hoge rang weefsel ontsteking. Vandaar, mini-Endoscopische evaluatie lijkt te vertegenwoordigen invaller werken voor de goudstandaard histopathologisch onderzoek waarvoor routinematig het offer van de experimentele muizen. Bovenal dit protocol kan worden toegepast op vrijwel elk punt gegeven moment en kan herhaaldelijk worden gebruikt in de loop van de ziekte10,11. Bovendien, in tegenstelling tot het gebruik van bioluminescentie-afhankelijke benaderingen, geen arbeid-intensieve en tijdrovende maatregelen zoals intercrossing genetisch muizen gemodificeerde zijn vereist en, vandaar, de methodologie kan worden toegepast op vrijwel elke regel van de muis van de belang.
Tezamen, gegeven het schadelijk klinische perspectief van allo-HCT patiënten met ernstige intestinale GVGH, zijn snelle wetenschappelijke vooruitgang en meer inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de immuun pathogenese dringend noodzakelijk. Evenzo eisen belangrijk, ethische overwegingen dat de winst van kennis moet worden bereikt met het gebruik van het minimale aantal experimentele muizen. Vandaar, zowel erkende vorderingen op de onderzoekgemeenschap verkennen van intestinale GVGH kunnen worden gevorderd door de uitvoering van seriële mini-Endoscopische evaluaties van de dikke darm in de experimenteel werk-keten te controleren en rang van intestinale GVGH in levende experimentele muis modellen, als beschreven en gevalideerde in het protocol hier gepresenteerd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1249px;" width="1249">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator</td>
			<td style="width:216px;">Gamma-Service Meical GmbH</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:479px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Phosphate-buffered saline (PBS )</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>D8662-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>R8758-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Hypodermic needle (26G)</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">1 mL syring</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:152px;">9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">50 mL tube</td>
			<td style="width:216px;">Sarstedt Ag &#38; Co.KG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Cell strainer with a 40 &#181;m mesh screen</td>
			<td style="width:216px;">BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td style="width:152px;">11209</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">8043.2</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td style="width:152px;">1,048,540,500</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pan T Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-095-130</td>
			<td>magnet cell separation to isolate splenic T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>109822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>110730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Filtrated bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Pan Biotec</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>ingredient of FACS buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well polystyrene V-bottom plates</td>
			<td style="width:216px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">651201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:152px;">352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSRFortessa II flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Insulin syringe with sterile interior (30G)</td>
			<td style="width:216px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:152px;">324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Oxy Vet Oxymat 3</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>oxygen concentrator&#160; for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">NarkoVet&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">213062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Plexiglass chamber&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">214620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Straight Forward Telescope</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>64301 AA</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protection and Examination Sheath</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 C</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Examination Sheath with working channel</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 D</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Biopsy Forceps</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">61071 ZJ&#160;</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;175 Watt SCB XenonLight Source</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">20132120</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber Optic Light Cable</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">495 NL</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 S3 Camera Head</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22220030</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 SCB Camera Control Unit</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22200020</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">LCD monitor</td>
			<td style="width:216px;">Olympus</td>
			<td>OEV181H</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forane / Isofluran</td>
			<td>AbbVie Inc.&#160;</td>
			<td>B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution 37 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">7398.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5,0 mL Dispenser tip&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eppendorf AG</td>
			<td align="right">30089456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice

Acute graft - versus - host-ziekte (GVGH) vertegenwoordigt de meest ernstige complicatie dat patiënten eerder ondergaan Allogene hematopoietische stamcel transplantatie (allo-HCT) gezicht en wordt vaak geassocieerd met een slechte klinische uitkomst. Terwijl, bijvoorbeeld, GVGH uitingen van de huid zijn meestal inspelen op gevestigde immuun-onderdrukkende therapieën en, vandaar, niet nemen een fatale cursus, de aanwezigheid en de intensiteit van intestinale GVGH, vooral van de medio-aan-onderste delen van de darm, sterk beïnvloeden het resultaat en algehele overleving van patiënten met acute GVGH. therapeutische opties zijn in wezen beperkt tot de klassieke immuun-onderdrukkende agenten slechts matig ziekte-beperkende effecten oplevert. Vandaar, gedetailleerde kennis over de weefsel-ingezeten immuun cascade, veranderingen in de intestinale microbiota, en het voorafgaande, op en na intestinale GVGH begin stromale antwoord dringend nodig zijn om te begrijpen van de gebeurtenissen en de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese en het ontwikkelen van innovatieve therapeutische opties. Lymfkliertest modellen van GVGH zijn vaak aangewend om te kunnen bepalen en beoordelen functioneel moleculen en trajecten vermeende rijden intestinale GVGH. Echter, kunnen specifiek monitoren en evalueren van intestinale ontsteking na verloop van tijd in wezen ontbreken aangezien gevestigde scores te beoordelen en rang van acute GVGH routinematig bestaan uit verschillende parameters die eerder systemische GVGH weerspiegelen manifestaties. De gedetailleerde evaluatie van intestinale GVGH is beperkt met behulp van euthanized muizen, waardoor in wezen exclusief longitudinale studies (dat wil zeggen, kinetische) analyses van het Colon compartiment onder een bepaalde experimentele voorwaarde (bijvoorbeeld antilichaam-gemedieerde blokkade van een cytokine proinflammatoire) in levende muizen (dat wil zeggen, in vivo). De mini-Endoscopische in situ evaluatie van de distale dikke darm van allo-HCT-testgroep muizen hier beschreven staat a) een gedetailleerde macroscopische evaluatie van verschillende aspecten van darmontstekingen en b) de mogelijkheid om het verzamelen van weefselmonsters voor downstream analyses op verschillende tijdstippen in de loop van de waarnemingsperiode. De mini-Endoscopische benadering biedt over het algemeen een grote stap vooruit in de preklinische noninvasive monitoring en evaluatie van intestinale GVGH.

Het huidige protocol, met een beschrijving van de mini-Endoscopische evaluatie van intestinale GVGH-geassocieerde letsels van het distale dikke darm, is gevestigd en gevalideerd in muizen eerder onderworpen aan de systemische inductie van een ernstige acute GVGH model. In deze studie, gebruikten we een MHC klasse ik volledig modelsysteem in welke BALB/c muizen waren dodelijk bestraald verkeerde, gevolgd door transplantatie van allogene beenmerg T-cel-uitgeput en het beheer van GVGH-induce...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Inductie van intestinale Graft - versus host klauwzeer en haar Mini-Endoscopische beoordeling in levende muizen

Hier presenteren we een protocol waarin wordt beschreven van Allogene hematopoietische stamceltransplantatie en repetitieve mini-Endoscopische evaluaties van de distale dubbelpunt ter plaatse voor de aanwezigheid, de kenmerken en de ernst van Colon ontsteking binnen live kunt muizen intestinale graft - versus - host-ziekte lijden.

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Mini-endoscopische evaluatie van de dikke darm bij levende muizen biedt belangrijke experimentele ondersteuning voor het onderzoeken van darmmanifestaties van acute graf-versus-gastheerziekte, GvHD, bij allogene, hematopoietische stamceltransplantatie. De niet-invasieve beoordeling van acute GvHD-gerelateerde colitis kan functioneren als een werkende substituut voor goudstandaard histopathologie, waardoor herhaalde dierenoffers om weefselmonsters te verkrijgen overbodig worden. Het aantonen van de procedure zal Vera Buchele zijn, een post-doc van mijn laboratorium.Een dag na de totale lichaamstraling van de ontvanger BALB / c muizen, plaats een CD-45.1 live 5B6 SJL donor muis in de gevoelige positie op een schone werkende schede, en gebruik een 13-cm gebogen en gekartelde tip van een simkin tang om de vacht te heffen op een achilleshiel. Met behulp van geharde 8,5 cm fijne schaar met rechte uiteinden, insnijden van de huid tussen de tangen en een hiel, het verlengen van de incisie cranially om de verwijdering van de huid en bont uit de achterste ledematen te vergemakkelijken. Wanneer de huid is verwijderd uit de achterste ledematen, gesneden door elke heup, enkel, en knie gewricht.Bewaar de dij en de steel van elke achterpoot in een enkele petrischaal van 92 mm gevuld met PVS op ijs en verwijder voorzichtig zoveel mogelijk spieren van elk bot, waarbij elk schoongemaakt dijbeen en scheenbeen worden overgebracht in een 50 mL-buis van steriel RPMI 1640-medium op nat ijs. Om het beenmerg te isoleren, breng je één bot tegelijk over in een nieuwe petrischaal van 92 mL gevuld met vers RPMI 1640-medium en gebruik je een scalpel om de uiteinden van elk bot af te snijden. Gebruik vervolgens een 1-mL spuit uitgerust met een 26-gauge naald om de botten met 1 mL vers medium per keer door te spoelen in een 50-mL collectiebuis met 5 mL medium.Wanneer alle botten zijn gespoeld, voorzichtig pipette de kruimelige beenmerg stukken op en neer meerdere malen om een eencellige suspensie te genereren voordat het filteren van de cellen door middel van een 40-micrometer mesh-screen cel zeef in een nieuwe 50-mL collectie buis. Pellet de cellen door centrifugatie en schort de cellen opnieuw op in 5 mL ammoniumchloride kaliumkaliumbuffer voor een incubatie van drie minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie stopt u de reactie met 10 mL PVS en centrifugeert u de cellen opnieuw.Schort de pellet opnieuw op in 2 mL verse PVS voor het tellen en zet een zes keer 10 tot de zesde cel aliquot opzij voor downstream flow cytometrische analyse. Gebruik vervolgens een commercieel verkrijgde celzuiveringskit om de CD90.2-positieve T-cellen magnetisch uit te putten uit de enkelcellige suspensie van het beenmerg, volgens de instructies van de fabrikant, en zet een één keer 10 opzij tot de zesde cel aliquot van de T-cel-uitgeput eluaat voor downstream flow cytometrische analyse van de celzuiverheid en samenstelling voor en na de scheiding. Gebruik vervolgens een 1-mL spuit uitgerust met een 30-gauge naald om vijf keer 10 te injecteren tot de vijfde T-cel-uitgeputte beenmergcellen in 100 microliter PVS intraveneus in de retrobulbar ruimte van de veneuze sinus van elk bestraald ontvangend dier.De volgende dag, plaats een milt geoogst van een donor dier op een 40-micrometer mesh zeef in een 50-mL collectie buis, en gebruik een spuit zuiger om het miltweefsel pers door de zeef in de buis. Was de zeef en zuiger met PVS om alle splenocyten te verzamelen en de cellen te pelleteren door centrifugatie. Nadat rode bloedcellyse is aangetoond, opnieuw opschorten van de witte bloedcellen voor het tellen, en zet een zes keer 10 tot de zesde cel aliquot voor downstream flow cytometrische analyse.Voor een totale CD3-positieve T-cel isolatie van totale splenocyten, gebruik maken van een commercieel verkrijgbaar celzuivering kit volgens de instructies van de fabrikant, en zet een keer 10 tot de zesde CD3-positieve T-cel aliquot van de positieve cel fractie voor downstream flow cytometrische analyse van de cel zuiverheid en samenstelling voor en na de scheiding. Injecteer vervolgens zeven keer 10 tot de vijfde alloreactive CD3-positieve T-cellen in 100 microliter pvs-cellen intraveneus in de retrobulbarruimte van elke ontvangende muis om GvHD te induceren. Om GvHD-gerelateerde laesies te scoren door mini-endoscopie van het distale colorectale gebied, til je de staart van een ontvangend dier net boven de staartwortel met één hand op en gebruik je de andere hand om de endoscoop via de anus zorgvuldig in het rectum te steken.Terwijl de luchtstroom het colorectale lumen opblaast, beweegt u de endoscoop langzaam en voorzichtig naar voren in de aborale richting. Om darmletsels te voorkomen, houdt u de endoscoop in het middelste gedeelte van het lumen met behulp van het live videoscherm om te helpen bij deze positionering. Start het opnemen van de videostream en het scoren van de ontsteking, de evaluatie van de GvHD-gerelateerde ontsteking van de dikke darm door het scoren van de parameters zoals geïllustreerd.Wanneer een scoreplek is gevonden, beweegt u de endoscoop voorzichtig en licht heen en weer om de verschillende parameters te beoordelen. Om de parametertranslucency en ontlastingsconsistentie te beoordelen, plaatst u de endoscoop op een grotere afstand ten opzichte van de darmwand. Om de granulariteit en vasculariteit van de laesie te beoordelen, plaats de endoscoop in de nabijheid van de darmwand en breng u zorgvuldig goed gedoseerde spanning aan op de darmwand met het puntje van de endoscoop.Na voltooiing van het scoreproces, stop de opname. Vergeleken met controles produceert allogene hematopoieïsche stamceltransplantatie zoals aangetoond een reproduceerbaar robuuste inductie van een systemisch GvHD-fenotype, met geleidelijk toenemende klinische GvHD-scores bij ontvangende dieren. Deze mini-endoscopisch beoordelingscriteria werden specifiek aangepast aan eerder gemelde syngeneïsche colitis in de context van allo-response-driven colitis scoring parameters voor de precieze beschrijving, score, en indeling van darm-GvHD-ziekte-geassocieerde laesies in de distale dikke darm.Inderdaad, de mini-endoscopisch gebaseerde indeling systeem maakt een gemakkelijke discriminatie van donor-lymfocyten-ontvangende muizen met ernstige tekenen van darmontsteking van controle muizen die in wezen verstoken zijn van GvHD. Invalidatie van de mini-endoscopisch gebaseerde grading systeem histopathologische studies bevestigd dat de dikke darm van muizen ernstig getroffen door GvHD-gerelateerde ontsteking vertonen eveneens sterke histopathologische tekenen van ontsteking. Daarentegen toonden darmweefsels van controlemuizen nee tegen hooguit milde histopathologische tekenen van ontsteking, in overeenstemming met de virtuele afwezigheid van mini-endoscopisch detecteerbare tekenen van colitis.Bovendien tonen correlatiestudies tussen mini-endoscopisch en histopathologisch beoordeelde colitisactiviteit en systemische GvHD-scores aan dat mini-endoscopisch bepaalde sommige scores van minder dan of gelijk aan drie betrouwbaar voorspellen dat de afwezigheid van mid-to-higher-grade darm-GvHD-geassocieerde colonische ontstekingsscores verkregen uit histopathologische sortering. Bovendien toont de ernst van de endoscopisch beoordeelde darmgvHD een correlatie met systemische GvHD-ziekteactiviteit. Om de resultaten van mini-endoscopische evaluatie van darmontsteking te standaardiseren en om de vergelijkbaarheid tussen verschillende muizen en experimenten in de loop van de tijd te garanderen, moet een gedefinieerde anatomische site worden geselecteerd om te scoren.Naast het scoren van colonische ontsteking, het ingebouwde werkkanaal binnen de mini-endoscopische setup maakt het ophalen van view-guided weefsel biopten van toepassing op verschillende downstream-analyses, zoals standaard histopathologie. Vanwege het niet-invasieve karakter van de mini-endoscopie kan acute GvHD-gerelateerde colitis op vrijwel elk moment herhaaldelijk binnen hetzelfde dier worden beoordeeld, waardoor fascinerende inzichten in intestinale GvHD ontstaan.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Inductie van experimentele auto-immune Hypophysitis in SJL Muizen

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Inductie van Graft-versus-host ziekte en<em&gt; In Vivo</em&gt; T-cel monitoren door gebruik van een MHC-matched muizenmodel

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Een niet-invasieve en Technisch Niet-intensieve methode voor Inductie en fenotypering van experimentele bacteriële longontsteking in Muizen

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

Inductie van een ontstekingsreactie in het jeugdwerk hepatocytenculturen van Muizen

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Beoordeling van de cytotoxische en immunomodulerende effecten van stoffen in menselijke precisie-cut Lung plakjes

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene Murine model en kwantificering van menselijke T cellen in muizen weefsels met behulp van digitale PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Inductie van geneesmiddel-geïnduceerde, auto-immune hepatitis bij BALB / c-muizen voor de studie van de pathogene mechanismen

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Beenmergtransplantatie Platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...