Name: induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice
Uploaded: 2019-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par le centres de collaboration de le recherche (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, 324392634 # ; projet B03) (de K.H.) et CRC 1181 (CRC-DFG, projet B05) (K.H.), tous deux financement par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, fondation de recherche allemande).

Les méthodes expérimentales décrites ici ont été approuvés par le gouvernement de Mittelfranken, Bavière, Allemagne.
1. GvHD induction
<ol><li>Jour 0 : Irradiation corporelle totale des souris destinataires
	<ol>
<li>Utiliser des femelles CD45.2+ H2kd+ BALB/c souris qui sont vieux comme bénéficiaires d’au moins 10 semaines.</li>
		<li>Pesez et consignez le poids des souris avant induction de greffon contre l’hôte destinataires. <strong...

<ol>
	<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+pathogenesis+of+graft-versus-host+disease.">Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease.</a> British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).</li><li>Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+GvHD:+pathogenesis+and+classification.">Acute GvHD: pathogenesis and classification.</a> Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).</li><li>Naymagon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+graft-versus-host+disease+of+the+gut:+considerations+for+the+gastroenterologist.">Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14, 711-726 (2017).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation.</a> Blood. 127, 3117-3126 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Anthony, B. A., Hadley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+graft-versus-host+disease+and+in+vivo+T+cell+monitoring+using+an+MHC-matched+murine+model.">Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).</li><li>Beilhack, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+acute+graft-versus-host+disease+by+blocking+T-cell+entry+to+secondary+lymphoid+organs.">Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs.</a> Blood. 111, 2919-2928 (2008).</li><li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+colonoscopy+in+live+mice.">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).</li><li>Buchele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Inflammatory+T+Helper+Cells+via+Retinoic+Acid-Related+Orphan+Receptor+Gamma+t+Is+Ineffective+to+Prevent+Allo-Response-Driven+Colitis.">Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).</li><li>Ullrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BATF-dependent+IL-7RhiGM-CSF++T+cells+control+intestinal+graft-versus-host+disease.">BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).</li><li>Kaplan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+antigens+determine+graft-versus-host+disease+phenotype.">Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype.</a> Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).</li></ol>

Le protocole décrit la méthode d’induction et évaluation mini-endoscopique du côlon phénotype observé au cours de la GVH intestinale. Il a pour objectif plus large de permettre aux scientifiques d’étudier la GVH intestinale longitudinalement et non invasive au cours de toute maladie (c'est-à-dire, dès le début de la manifestation du côlon et de la progression jusqu'à l’activité maximale de la maladie).
Cependant, il y a certaines étapes critiques et des limitations importan...

Malignités hématopoïétiques qui résultent directement du compartiment de cellules souches hématopoïétiques et incontrôlée, progresse rapidement et graves troubles immunitaire sont souvent des indications pour effectuer des allo-HCT1,2. Cependant, bien que représentant l’apparition de la réponse de graft-versus-tumeur bénéfique pronostique, lymphocytes du donneur sont fréquemment induisant et promouvoir une attaque immunitaire indésirable des composants des tissus sains dans le destinataire allo-HCT , un processus qui est appelé graft - versus - host disease3. Manifestations dans le tube digestif, le soi-disant GVH intestinale, représentent la complication la plus redoutée du greffon contre l’hôte aiguë, des formes sévères qui sont systématiquement associées à une mortalité élevée1,2,4.
Modèles dans l’ensemble, murins de allo-HCT sont devenus des outils précieux pour identifier et étudier les mécanismes à médiation immunitaire qui sous-tendent la pathogénie du greffon contre l’hôte5. Cependant, cinétique évaluation de, par exemple, les effets bénéfiques de nouvelles interventions thérapeutiques au fil du temps chez les souris vivent régulièrement repose sur la détermination du greffon contre l’hôte clinique scores6. Alors que ces scores sont adaptés afin de tenir compte, par exemple, la global de morbidité (c'est-à-dire la GvHD systémique), clinique scores manque la sensibilité en miroir avec fiabilité les manifestations spécifiques d’organes (par exemple, dans le tube digestif). Par conséquent, conclusions, par exemple en ce qui concerne les effets de protection intestinale d’une intervention thérapeutique donnée, qui reposent sur ces notation systèmes habituellement tombent à courtes.
Malgré des avancées importantes grâce à l’invention de nouveaux corps modalités en combinaison avec l’utilisation de deux souris génétique bioluminescent ou fluorescent modèles7,8, directement et spécifiquement des méthodes d’imagerie évaluer l’intestin manifestation du greffon contre l’hôte chez les souris vivantes font défaut. Par conséquent, la raison d’être du protocole de l’évaluation endoscopique du phénotype GVH intestinale décrit dans la section suivante est de surmonter cet obstacle. En outre, la motivation est également de réduire le nombre de souris expérimental puisque, jusqu'à présent, une évaluation détaillée des caractéristiques morphologiques, cellulaires et moléculaires (p. ex., par histopathologie ou en biologie moléculaire) de GVH intestinale manifestation a finalement exigé le sacrifice de la souris de laboratoire.
Notre institution a précédemment rapporté sur la méthodologie d’une évaluation des mini-endoscopique des manifestations du côlon au cours de colite syngénique modèles9. Dans le protocole présenté ici, nous avons affiné et adapté le coloscopique marquant la matrice axée sur l’alloresponse ulcéro-hémorragique dans des souris vivantes avec GVH intestinale après transplantation d’alloréactives HCT et donateurs des lymphocytes dans une MHC classe j’ai totalement incompatibles réglage . Nous avons identifié quatre paramètres appropriés pour tenir compte des lésions coliques intestinales axés sur le greffon contre l’hôte. En outre, nous avons établi un système qui permet un classement affiné de n’importe quel déterminant unique, résultant en une nouvelle partition qui facilement informe le lecteur sur la sévérité de la GVH intestinale présente une souris donnée à un moment donné. Les analyses histopathologiques confirment qu’un score endoscopique dépassant un certain seuil est fiable prédire une inflammation des tissus grade modéré à élevé. Il appert donc qu’évaluation endoscopique mini pour représenter un substitut de travail pour l’histopathologie de l’étalon-or qui exige régulièrement le sacrifice des souris expérimentales. Ce qui est important, ce protocole peut être appliqué à pratiquement n’importe quel moment donné et peut être utilisé à plusieurs reprises au cours de la maladie10,11. En outre, contrairement à l’utilisation d’approches axées sur la bioluminescence, aucune mesure de travail intense et longue comme intercrossing génétiquement des souris modifiées n’est nécessaires et, par conséquent, la méthodologie peut être appliquée sur pratiquement n’importe quelle lignée de souris de intérêt.
Pris ensemble, étant donné le point de vue clinique néfaste des allo-HCT diabétiques GVH intestinale sévère, progrès scientifique rapide et mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénie immunitaire sont urgent. De même, considérations éthiques importantes exigent que le gain de la connaissance devrait être réalisé avec l’utilisation du nombre minimal des souris de laboratoire. Ainsi, tous les deux reconnu réclamations sur la communauté de recherche explorant la GVH intestinale peuvent être avancées en mettant en œuvre des évaluations endoscopique mini séries du côlon dans la chaîne de travail expérimental pour surveiller et GVH intestinale chez des souris expérimentale direct de grade modèles, tel que décrit et validés dans le protocole présenté ici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1249px;" width="1249">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator</td>
			<td style="width:216px;">Gamma-Service Meical GmbH</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:479px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Phosphate-buffered saline (PBS )</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>D8662-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>R8758-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Hypodermic needle (26G)</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">1 mL syring</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:152px;">9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">50 mL tube</td>
			<td style="width:216px;">Sarstedt Ag &#38; Co.KG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Cell strainer with a 40 &#181;m mesh screen</td>
			<td style="width:216px;">BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td style="width:152px;">11209</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">8043.2</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td style="width:152px;">1,048,540,500</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pan T Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-095-130</td>
			<td>magnet cell separation to isolate splenic T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>109822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>110730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Filtrated bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Pan Biotec</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>ingredient of FACS buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well polystyrene V-bottom plates</td>
			<td style="width:216px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">651201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:152px;">352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSRFortessa II flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Insulin syringe with sterile interior (30G)</td>
			<td style="width:216px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:152px;">324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Oxy Vet Oxymat 3</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>oxygen concentrator&#160; for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">NarkoVet&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">213062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Plexiglass chamber&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">214620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Straight Forward Telescope</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>64301 AA</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protection and Examination Sheath</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 C</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Examination Sheath with working channel</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 D</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Biopsy Forceps</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">61071 ZJ&#160;</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;175 Watt SCB XenonLight Source</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">20132120</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber Optic Light Cable</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">495 NL</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 S3 Camera Head</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22220030</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 SCB Camera Control Unit</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22200020</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">LCD monitor</td>
			<td style="width:216px;">Olympus</td>
			<td>OEV181H</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forane / Isofluran</td>
			<td>AbbVie Inc.&#160;</td>
			<td>B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution 37 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">7398.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5,0 mL Dispenser tip&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eppendorf AG</td>
			<td align="right">30089456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice

Aiguë graft - versus - host disease (GvHD) représente la complication la plus sévère que les patients subissant déjà visage (allo-HCT) la transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques et est souvent associée à un mauvais pronostic clinique. Certain temps, par exemple, des manifestations de greffon contre l’hôte de la peau sont généralement sensibles aux traitements immunitaire-suppressive reconnus et, par conséquent, ne prennent un cours fatal, la présence et l’intensité de la GVH intestinale, en particulier des pièces milieu-à-bas du tube digestif, fortement influencer le résultat et globalement la survie des patients atteints aiguë GvHD. options thérapeutiques sont essentiellement limitées aux agents immunitaire-suppressive classiques produisant seulement des effets modérés-atténuer les maladies. Ainsi, une connaissance détaillée sur la cascade immunitaire tissu-résident, les changements dans le microbiote intestinal et la réaction stromale avant, après et après l’apparition de GVH intestinale sont nécessaires d’urgence pour comprendre les événements et les mécanismes qui sous-tendent sa pathogénie et d’élaborer des options thérapeutiques innovantes. Modèles murins de greffon contre l’hôte sont souvent employées pour identifier et évaluer fonctionnellement les molécules et les voies présumément conduite GVH intestinale. Cependant, moyens spécifiquement, surveiller et évaluer l’inflammation intestinale dans le temps ne manquent essentiellement puisque les scores établis pour évaluer et GVH aiguë de grade sont systématiquement composées de divers paramètres qui reflètent plutôt la GvHD systémique manifestations. L’évaluation détaillée de la GVH intestinale a été limitée aux études en utilisant des souris euthanasiés, excluant ainsi essentiellement longitudinal (c.-à-d., cinétique) analyses du compartiment colique sous une condition expérimentale donnée (p. ex., médiée par les anticorps blocage d’une cytokine pro-inflammatoire) à des souris vivantes (c.-à-d. in vivo). L’évaluation in situe mini-endoscopique du côlon distal des souris traitées allo-HCT décrite ici permet une) une évaluation macroscopique détaillée des différents aspects de l’inflammation intestinale et b) la possibilité de recueillir des échantillons de tissus pour des analyses en aval à divers moments au cours de la période d’observation. Globalement, l’approche endoscopique mini fournit une avancée majeure dans le suivi non invasif préclinique et évaluation de GVH intestinale.

Le protocole actuel, qui décrit l’évaluation mini-endoscopique des lésions intestinales de greffon contre l’hôte associée à du côlon distal, a été établi et validé chez la souris préalablement soumis à l’induction systémique d’un modèle de greffon contre l’hôte aiguë sévère. Dans cette étude, nous avons utilisé un CMH de classe j’ai totalement incompatibles système modèle dans lesquelles BALB/c souris ont été mortellement irradiés, suivie par la trans...

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Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Induction of Intestinal Graft - versus - host Disease and son évaluation endoscopique Mini souris vivantes

Nous présentons ici un protocole qui décrit l’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques et permet répétitives évaluations mini-endoscopique du côlon distal in situ pour la présence, les caractéristiques et gravité de l’inflammation du côlon dans live souris souffrant d’intestinal graft - versus - host disease.

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

L’évaluation mini-endoscopique du côlon chez les souris vivantes fournit le soutien expérimental clé pour étudier des manifestations intestinales de la maladie graph-versus-hôte aiguë, GvHD, sur la transplantation allogénique et hématopoïétique de cellules souches. L’évaluation non invasive de la colite aiguë liée au GvHD peut fonctionner comme un substitut de travail à l’histopathologie d’étalon-or, rendant ainsi inutiles les sacrifices répétés d’animaux pour obtenir des spécimens de tissus. Vera Buchele, post-doc de mon laboratoire, démontrera la procédure.Un jour après l’irradiation du corps total des souris BALB/c receveurs, placez un CD-45.1 vivant 5B6 souris donneur SJL en position couchée sur une gaine de travail propre, et utilisez une pointe courbée et dentelé de 13 cm d’un forceps simkin pour soulever la fourrure à son talon d’Achille. À l’aide de ciseaux fins durcis de 8,5 cm avec des pointes droites, incisez la peau entre les forceps et un talon, allongeant l’incision cranially pour faciliter l’enlèvement de la peau et de la fourrure des membres postérieurs. Lorsque la peau a été enlevée des membres postérieurs, coupez chaque articulation de la hanche, de la cheville et du genou.Conservez la cuisse et la tige de chaque membre postérieur dans une seule boîte de Pétri de 92 mm remplie de PVS sur glace et retirez soigneusement autant de muscle que possible de chaque os, en transférant chaque fémur et tibia nettoyés dans un tube de 50 mL de RPMI stérile 1640 milieu sur glace mouillée. Pour isoler la moelle osseuse, transférez un os à la fois dans une nouvelle boîte de Pétri de 92 mL remplie d’un milieu RPMI 1640 frais, et utilisez un scalpel pour couper les extrémités de chaque os. Ensuite, utilisez une seringue de 1 mL équipée d’une aiguille de calibre 26 pour rincer les os avec 1 mL de milieu frais à la fois dans un tube de collecte de 50 mL contenant 5 mL de milieu.Lorsque tous les os ont été rincés, pipette doucement les morceaux de moelle osseuse friable de haut en bas à plusieurs reprises pour générer une suspension à cellule unique avant de filtrer les cellules à travers une passoire cellulaire à mailles de 40 micromètres dans un nouveau tube de collecte de 50 mL. Pelleter les cellules par centrifugation et suspendre à nouveau les cellules dans 5 mL de tampon de lyse de potassium chlorure d’ammonium pour une incubation de trois minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, arrêter la réaction avec 10 mL de PVS, et centrifuger les cellules à nouveau.Re-suspendre la pastille dans 2 mL de PVS frais pour le comptage, et mettre de côté un six fois 10 à la sixième cellule aliquot pour l’analyse cytométrique flux en aval. Ensuite, utilisez un kit de purification cellulaire disponible dans le commerce pour épuiser magnétiquement les lymphocytes T CD90.2 positifs de la suspension à cellule unique de la moelle osseuse, selon les instructions du fabricant, et mettez de côté une fois 10 à la sixième cellule aliquot de l’évauate épuisé par cellule T pour l’analyse cytométrique du flux en aval de la pureté et de la composition cellulaires avant et après la séparation. Ensuite, utilisez une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de calibre 30 pour injecter cinq fois 10 à la cinquième cellule T de moelle osseuse appauvrie en 100 microlitres de PVS par voie intraveineuse dans l’espace rétrobulbar du sinus veineux de chaque animal receveur irradié.Le lendemain, placez une rate récoltée chez un animal donneur sur une passoire en maille de 40 micromètres dans un tube de collecte de 50 mL, et utilisez un piston à seringues pour presser le tissu de la rate à travers la passoire dans le tube. Lavez la passoire et le piston avec pvs pour recueillir tous les splenocytes, et pelleter les cellules par centrifugation. Après la lyse rouge de globules rouges est démontrée, re-suspendre les globules blancs pour compter, et mettre de côté un six fois 10 à la sixième cellule aliquot pour l’analyse cytométrique de flux en aval.Pour un isolement total des lymphocytes T CD3 positifs par rapport au total des splenocytes, utilisez un kit de purification cellulaire disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant, et réservez un aliquot à cellule T un fois 10 à la sixième lymphocyte T CD3 positif de la fraction de cellule positive pour l’analyse cytométrique du flux en aval de la pureté et de la composition cellulaires avant et après la séparation. Ensuite, injectez sept fois 10 à la cinquième cellule T CD3-positive alloreactive dans 100 microlitres de PVS par voie intraveineuse dans l’espace rétrobulbar de chaque souris destinataire pour induire GvHD. Pour marquer les lésions liées à la GvHD par mini-endoscopie de la région colorectale distale, soulevez la queue d’un animal receveur juste au-dessus de la racine de la queue d’une main, et utilisez l’autre main pour insérer soigneusement l’endoscope dans le rectum par l’intermédiaire de l’anus.Tandis que le flux d’air gonfle le lumen côlorectal, déplacez lentement et soigneusement l’endoscope vers l’avant dans la direction aboral. Pour éviter les blessures de l’intestin du côlon, gardez l’endoscope dans la zone centrale du lumen en utilisant l’écran vidéo en direct pour aider à ce positionnement. Commencez à enregistrer le flux vidéo et marquer l’inflammation, en évaluant l’inflammation liée à GvHD du côlon en marquant les paramètres comme illustré.Lorsqu’un point de notation a été localisé, déplacez l’endoscope doucement et légèrement d’avant en arrière pour évaluer les différents paramètres. Pour évaluer la translucidité des paramètres et la consistance des selles, placez l’endoscope à une distance plus large par rapport à la paroi du côlon. Pour évaluer la granularité et la vascularité de la lésion, placez l’endoscope à proximité de la paroi du côlon, et appliquez soigneusement une tension bien dosée à la paroi du côlon avec la pointe de l’endoscope.À la fin du processus de notation, arrêtez l’enregistrement. Comparé aux contrôles, la transplantation allogénique de cellules souches hématopoïiques telle que démontrée produit une induction reproductiblement robuste d’un phénotype systémique de GvHD, avec des scores cliniques progressivement croissants de GvHD chez les animaux destinataires. Ces critères mini-endoscopiquement évaluables ont été spécifiquement adaptés de la colite syngénéique précédemment rapportée dans le contexte des paramètres de notation de colite allo-réponse-conduits pour la description précise, la notation, et le classement des lésions intestinales GvHD-maladie-associées dans le côlon distal.En effet, le système de classement mini-endoscopique permet une discrimination facile des souris recevant des lymphocytes donneurs avec des signes graves d’inflammation intestinale de souris témoins qui sont essentiellement dépourvues de GvHD. Invalidation du système de classement à base mini-endoscopique études histopathologiques a confirmé que le côlon des souris gravement affectées par l’inflammation liée à la GvHD affichent des signes histopathologiques similaires forte de l’inflammation. En revanche, les tissus du côlon des souris témoins ont montré non, tout au plus, aux signes histopathologiques doux de l’inflammation, en accord avec l’absence virtuelle des signes mini-endoscopiquement détectables de colite.En outre, les études de corrélation entre mini-endoscopically et histopathologically évalué l’activité de colite et les scores systémiques de GvHD démontrent que mini-endoscopically déterminé quelques scores de moins ou égal à trois prévoir de manière fiable l’absence des scores intestinaux mi-à plus élevés d’inflammation du côlon GvHD-associés obtenus du classement histopathologique. En outre, la sévérité du GvHD intestinal endoscopiquement évalué montre une corrélation avec l’activité systémique de maladie de GvHD. Pour normaliser les résultats de l’évaluation mini-endoscopique de l’inflammation du côlon et pour assurer la comparabilité entre différentes souris et expériences au fil du temps, un site anatomique défini devrait être sélectionné pour la notation.En plus de marquer l’inflammation du côlon, le canal de travail intégré dans la configuration mini-endoscopique permet la récupération de biopsies de tissus guidés par vue applicables à diverses analyses en aval, telles que l’histopathologie standard. En raison de la nature non invasive de la mini-endoscopie, la colite aiguë liée à la GvHD peut être évaluée à plusieurs reprises chez le même animal à pratiquement n’importe quel moment, donnant ainsi des aperçus fascinants de la GvHD intestinale.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

L&#39;induction de hypophysite auto-immune expérimentale chez la souris SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Recherche

Immunologie et infection

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L&#39;induction de la réaction du greffon contre l&#39;hôte et des maladies<em&gt; In Vivo</em&gt; Suivi des lymphocytes T utilisant un modèle murin MHC-apparié

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Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

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Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Haute</sup&gt; T cellules dans des souris immunodéficientes

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