Name: induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice
Uploaded: 2019-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

Diese Studie wurde unterstützt durch die Collaborative Research Center (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634, Projekt B03) (um K.H) und CRC 1181 (CRC-DFG Projekt B05) (um K.H), beide von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) finanziert.

Die hier beschriebenen experimentellen Methoden wurden von der Regierung von Mittelfranken, Bavaria, Germany genehmigt.
(1) GvHD Induktion
<ol><li>Tag 0: Ganzkörper-Bestrahlung der Empfänger Mäuse
	<ol>
<li>Verwenden Sie weiblichen CD45.2+ H2kd+ BALB/c Mäuse, die mindestens 10 Wochen alt als Empfänger sind.</li>
		<li>Weigh und nimmt das Gewicht der Empfänger Mäuse vor GvHD Induktion. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der Empf...

<ol>
	<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+pathogenesis+of+graft-versus-host+disease.">Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease.</a> British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).</li><li>Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+GvHD:+pathogenesis+and+classification.">Acute GvHD: pathogenesis and classification.</a> Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).</li><li>Naymagon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+graft-versus-host+disease+of+the+gut:+considerations+for+the+gastroenterologist.">Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14, 711-726 (2017).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation.</a> Blood. 127, 3117-3126 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Anthony, B. A., Hadley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+graft-versus-host+disease+and+in+vivo+T+cell+monitoring+using+an+MHC-matched+murine+model.">Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).</li><li>Beilhack, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+acute+graft-versus-host+disease+by+blocking+T-cell+entry+to+secondary+lymphoid+organs.">Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs.</a> Blood. 111, 2919-2928 (2008).</li><li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+colonoscopy+in+live+mice.">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).</li><li>Buchele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Inflammatory+T+Helper+Cells+via+Retinoic+Acid-Related+Orphan+Receptor+Gamma+t+Is+Ineffective+to+Prevent+Allo-Response-Driven+Colitis.">Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).</li><li>Ullrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BATF-dependent+IL-7RhiGM-CSF++T+cells+control+intestinal+graft-versus-host+disease.">BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).</li><li>Kaplan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+antigens+determine+graft-versus-host+disease+phenotype.">Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype.</a> Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).</li></ol>

Das Protokoll beschreibt die Methode der Induktion und Mini-endoskopische Beurteilung des Kolon Phänotyps im Zuge der intestinalen GvHD beobachtet. Es dient breiter ermöglichen Wissenschaftlern, Darm GvHD längs und nicht-invasiv über den gesamten Krankheitsverlauf (z.B. durch das Auftreten von Kolon Manifestation und Verlauf bis maximale Krankheitsaktivität) zu studieren.
Allerdings gibt es einige wichtige Schritte und wichtige Einschränkungen, die die vorgestellten Methoden muss der Exp...

Hämatopoetischen Tumoren entstehen direkt aus dem Fach der hämatopoetischen Stammzellen und unkontrollierte, sind gehen zügig voran und schweren immunvermittelte Erkrankungen oft Indikationen allo-HCT1,2durchführen. Obwohl für das Auftreten der prognostische Vorteil Graft-versus-Tumor Reaktion Buchhaltung, sind Spender-Lymphozyten jedoch häufig induzieren und fördern einen unerwünschten immunvermittelte Angriff von gesundem Gewebe Komponenten innerhalb der allo-HCT-Empfänger , ein Prozess, der Graft - Versus - Host-Seuche3aufgerufen wird. Manifestationen im Darm, der so genannte intestinale GvHD repräsentieren die am meisten gefürchtete Komplikation der akuten GvHD, schwere Formen von denen routinemäßig verbunden mit einer hohen Mortalität1,2,4sind.
Insgesamt, murine Modelle von allo-HCT entstanden als wertvolle Werkzeuge, um zu identifizieren und immunvermittelte Mechanismen der Pathogenese von GvHD5zu studieren. Jedoch kinetische Bestimmung, z. B. wohltuende Wirkung der neue therapeutische Interventionen im Laufe der Zeit im Leben Mäuse routinemäßig basiert auf der Bestimmung der klinischen GvHD punktet6. Während diese Werte entsprechend geeignet sind, zum Beispiel die Krankheit Gesamtbelastung (d. h. die systemische GvHD), klinische punktet fehlen die Empfindlichkeit um zuverlässig Organ-spezifischen Manifestationen spiegeln (z.B., im Darm). Daher fallen Schlussfolgerungen, zum Beispiel in Bezug auf die Darm-protektive Effekte einer bestimmten therapeutischen Intervention, die auf diese scoring-Systeme in der Regel kurz.
Trotz der großen Fortschritte durch die Erfindung von neuartigen Ganzkörper-bildgebende Modalitäten in Kombination mit der Verwendung von entweder Biolumineszenz oder fluoreszierende genetische Maus Modelle7,8, Methoden, direkt und spezifisch Bewerten der intestinalen Manifestation von GvHD in live Mäuse fehlen. Daher ist die Beweggründe für das Protokoll der endoskopischen Beurteilung des intestinalen GvHD Phänotyps im nächsten Abschnitt beschrieben, dieses Hindernis zu überwinden. Darüber hinaus ist die Motivation auch experimentellen Mäuse Zahlen seit, so weit, eine detaillierte Bewertung der zellulären, morphologischen und molekularen Eigenschaften zu reduzieren (z. B., durch Histopathologie oder Molekularbiologie) der Darm GvHD Manifestation ist letztlich das Opfer der experimentellen Maus erforderlich.
Unsere Institution wurde zuvor auf die Methodik einer Mini-endoskopische Beurteilung der Kolon Manifestationen im Zuge Phänomen ulcerosa Modelle9berichtet. In dem hier vorgestellten Protokoll haben wir weiterentwickelt und angepasst die koloskopischen scoring Matrix für Alloresponse-gesteuerte Kolitis bei live Mäusen mit Darm GvHD nach Transplantation von Alloreactive HCT und Spender-Lymphozyten in einem MHC-Klasse ich vollständig übereinstimmende Einstellung . Wir identifizierten vier Parameter für intestinale GvHD-bezogene Kolon Läsionen widerspiegeln. Darüber hinaus haben wir ein System, das ermöglicht eine fein abgestimmte Verschneidung einzige Determinante, wodurch eine neue Partitur, die leicht den Leser über die Schwere der intestinalen GvHD in einer bestimmten Maus zu einem bestimmten Zeitpunkt vorhanden informiert. Histopathologische Untersuchungen bestätigt, dass eine endoskopische Score ab einem bestimmten Schwellenwert Moderate bis hohe Grade Gewebe Entzündungen zuverlässig vorherzusagen ist. Mini-endoskopische Beurteilung scheint daher arbeiten Ersatz für den Goldstandard Histopathologie darstellen, die routinemäßig das Opfer der experimentellen Mäuse erfordert. Wichtig ist, dieses Protokoll kann an nahezu jedem gegebenen Zeitpunkt angewendet werden und kann im Verlauf der Krankheit10,11wiederholt verwendet werden. Außerdem, im Gegensatz zu der Verwendung von Biolumineszenz-abhängige Ansätze, keine Arbeits-intensive und zeitaufwendige Maßnahmen wie kreuzende genetisch Mäuse geändert erforderlich sind und daher kann die Methodik auf praktisch jede Maus Interesse.
Zusammengenommen, in Anbetracht der nachteilige klinischen Perspektive allo-HCT-Patienten mit schweren Darm GvHD, rasanten wissenschaftlichen Fortschritt und einen besseren Einblick in die molekularen Mechanismen der Pathogenese immun sind dringend notwendig. Ebenso fordern wichtigere, ethische Überlegungen, dass der Erkenntnisgewinn bei der Nutzung der minimalen Anzahl von experimentellen Mäuse erreicht werden soll. Daher erkannt beide, Ansprüche auf die Forschungsgemeinschaft erkunden Darm GvHD vorangebracht werden können, durch die Implementierung von seriellen Mini-endoskopische Auswertungen des Dickdarms in der experimentellen Arbeit Kette zu überwachen und zu benoten Darm GvHD in live experimentelle Maus Modelle, wie beschrieben und im hier vorgestellten Protokoll validiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1249px;" width="1249">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator</td>
			<td style="width:216px;">Gamma-Service Meical GmbH</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:479px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Phosphate-buffered saline (PBS )</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>D8662-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>R8758-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Hypodermic needle (26G)</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">1 mL syring</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:152px;">9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">50 mL tube</td>
			<td style="width:216px;">Sarstedt Ag &#38; Co.KG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Cell strainer with a 40 &#181;m mesh screen</td>
			<td style="width:216px;">BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td style="width:152px;">11209</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">8043.2</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td style="width:152px;">1,048,540,500</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pan T Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-095-130</td>
			<td>magnet cell separation to isolate splenic T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>109822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>110730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Filtrated bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Pan Biotec</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>ingredient of FACS buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well polystyrene V-bottom plates</td>
			<td style="width:216px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">651201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:152px;">352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSRFortessa II flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Insulin syringe with sterile interior (30G)</td>
			<td style="width:216px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:152px;">324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Oxy Vet Oxymat 3</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>oxygen concentrator&#160; for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">NarkoVet&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">213062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Plexiglass chamber&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">214620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Straight Forward Telescope</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>64301 AA</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protection and Examination Sheath</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 C</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Examination Sheath with working channel</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 D</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Biopsy Forceps</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">61071 ZJ&#160;</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;175 Watt SCB XenonLight Source</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">20132120</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber Optic Light Cable</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">495 NL</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 S3 Camera Head</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22220030</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 SCB Camera Control Unit</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22200020</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">LCD monitor</td>
			<td style="width:216px;">Olympus</td>
			<td>OEV181H</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forane / Isofluran</td>
			<td>AbbVie Inc.&#160;</td>
			<td>B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution 37 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">7398.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5,0 mL Dispenser tip&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eppendorf AG</td>
			<td align="right">30089456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice

Akute Graft - Versus - Host-Seuche (GvHD) stellt die schwersten Komplikation, dass Patienten, die zuvor allogene hämatopoetische Stammzell-Transplantation (allo-HCT) Gesicht und ist häufig mit einem schlechten klinischen Ergebnis verbunden. Weile, zum Beispiel GvHD Manifestationen der Haut sind in der Regel auf etablierten immun-unterdrückende Therapien und, daher nehmen keinen fatalen Kurs, das Vorhandensein und die Intensität der intestinalen GvHD, vor allem von der Mitte zum unteren Teile des Darms, Das Ergebnis stark beeinflussen und insgesamt Überlebenszeit von Patienten mit akuten GvHD. therapeutische Optionen sind im Wesentlichen beschränkt sich auf die klassischen immun-unterdrückende Agenten nur moderate Krankheit mildern Wirkungen nachgeben. Daher detaillierte Kenntnisse über die Gewebe-Resident immun Kaskade, Veränderungen in der intestinalen Mikrobiota, und die stromale Reaktion vor, nach und nach Darm GvHD auftreten sind dringend erforderlich, um die Ereignisse und die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen sein Pathogenese und innovative Therapiemöglichkeiten zu entwickeln. Murine Modelle von GvHD werden häufig eingesetzt zur Feststellung und Beurteilung funktional Moleküle und wegen vermeintlich Darm GvHD fahren. Mittel, insbesondere Überwachung und Evaluierung der Darmentzündung im Laufe der Zeit im Wesentlichen fehlt aber da etablierten Resultate zu bewerten und benoten akuten GvHD routinemäßig verschiedener Parameter bestehen die eher systemische GvHD widerspiegeln Manifestationen. Die detaillierte Auswertung der intestinalen GvHD euthanasierten Mäusen, damit im wesentlichen ausgenommen longitudinale Studien eingeschränkt wurde (z.B. kinetische) Analysen von Kolon Fach unter einem bestimmten Versuchsbedingung (z. B. Antikörper-vermittelten Blockade von einem proinflammatorischen Zytokinen) in live Mäuse (in Vivo). Die Mini-endoskopische in-situ Beurteilung der distalen Dickdarm von allo-HCT-behandelten Mäusen, die hier beschriebenen ermöglicht (a) eine detaillierte makroskopische Auswertung der verschiedenen Aspekte der Darmentzündung und (b) die Möglichkeit, Gewebeproben für nachgelagerte Analysen zu sammeln verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf des Beobachtungszeitraums. Insgesamt bietet der Mini-endoskopische Ansatz einen großen Fortschritt in präklinischen nichtinvasive Überwachung und Bewertung der intestinalen GvHD.

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Mini-endoskopische Bewertung der intestinalen GvHD-assoziierten Läsionen des distalen Colon wurde etabliert und validiert bei Mäusen, die vorher zur systemischen Induktion eines schweren akuten GvHD-Modells unterzogen. In dieser Studie verwendeten wir eine MHC-Klasse, die ich vollständig Modellsystem in welche BALB/c Mäuse letal bestrahlten übereinstimmende wurden, gefolgt von T-Zelle-abgereicherte Allogene Knochenmark-Transplantation und die Ver...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Induktion der intestinalen Graft - Versus - Host-Seuche und seiner Mini-endoskopische Beurteilung in Live Mäuse

Hier präsentieren wir Ihnen eine Protokoll, die beschreibt allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation und ermöglicht sich wiederholenden Mini-endoskopische Auswertungen des distalen Colon an Ort und Stelle für die Präsenz, die Merkmale und die Schwere der Kolon Entzündung im live Mäuse Darm Graft - Versus - Host-Seuche leiden.

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Die mini-endoskopische Bewertung des Dickdarms bei lebenden Mäusen bietet eine wichtige experimentelle Unterstützung für die Untersuchung von Darmmanifestationen der akuten Graph-versus-Host-Krankheit GvHD bei allogener, hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Die nicht-invasive Beurteilung der akuten GvHD-bedingten Kolitis kann als funktionierender Ersatz für Goldstandard-Histopathologie fungieren, wodurch wiederholte Tieropfer überflüssig werden, um Gewebeproben zu erhalten. Demonstriert wird das Verfahren von Vera Buchele, einer Post-Doc aus meinem Labor.Einen Tag nach der Ganzkörperbestrahlung der Empfänger-BALB/c-Mäuse legen Sie eine CD-45.1 live 5B6 SJL-Spendermaus in die anfällige Position auf eine saubere Arbeitshülle und verwenden Sie eine 13 cm gekrümmte und gezackte Spitze einer Simkinzange, um das Fell an einer Achillesferse zu heben. Mit gehärteten 8,5 cm feine Schere mit geraden Spitzen, incise die Haut zwischen der Zange und eine Ferse, längen den Schnitt kranially, um die Entfernung der Haut und Fell von den Hinterbeinen zu erleichtern. Wenn die Haut von den Hinterbeinen entfernt wurde, durchschneiden Sie jede Hüfte, knöchel- und Kniegelenk.Bewahren Sie den Oberschenkel und den Schaft jedes Hinterteils in einer einzigen 92-mm-Petrischale auf Eis, und entfernen Sie sorgfältig so viel Muskel wie möglich von jedem Knochen, wobei jeder gereinigte Oberschenkelknochen und jede Tibia in ein 50-ml-Rohr sterilen RPMI 1640 Medium auf nassem Eis übertragen wird. Um das Knochenmark zu isolieren, übertragen Sie einen Knochen nach dem anderen in eine neue 92-ml Petrischale, die mit frischem RPMI 1640 Medium gefüllt ist, und verwenden Sie ein Skalpell, um die Enden von jedem Knochen abzuschneiden. Als nächstes verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 26-Spur-Nadel, um die Knochen mit 1 ml frischem Medium gleichzeitig in ein 50-ml-Sammelrohr mit 5 ml Medium zu spülen.Wenn alle Knochen gespült wurden, pipette die krümeligen Knochenmarkstücke mehrmals auf und ab, um eine einzellige Suspension zu erzeugen, bevor die Zellen durch ein 40-Mikrometer-Netzsieb-Zellensieb in ein neues 50-ml-Sammelrohr gefiltert werden. Pellet die Zellen durch Zentrifugation und re-suspendieren die Zellen in 5 ml Ammoniumchlorid Kaliumlyse Puffer für eine dreiminütige Inkubation bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation, stoppen Sie die Reaktion mit 10 ml PVS, und zentrifugieren Sie die Zellen wieder.Setzen Sie das Pellet in 2 ml frischer PVS zum Zählen wieder aus, und legen Sie sechsmal 10 auf die sechste Zelle aliquot für die zytometrische Analyse des Downstream-Flusses beiseite. Als nächstes verwenden Sie ein handelsübliches Zellreinigungskit, um die CD90.2-positiven T-Zellen aus der einzelzelligen Knochenmarksuspension nach den Anweisungen des Herstellers magnetisch zu dezimieren und eine einmal 10 bis zur sechsten Zelle aliquot des T-Zell-depleted Eluats für die nachgeschaltete zytometrische Analyse der Zellreinheit und -zusammensetzung vor und nach der Trennung beiseite zu legen. Verwenden Sie dann eine 1-ml-Spritze, die mit einer 30-Spur-Nadel ausgestattet ist, um fünfmal 10 in die fünfte T-Zell-depleted Knochenmarkzellen in 100 Mikroliter PVS intravenös in den retrobulbaren Raum der venösen Sinus jedes bestrahlten Empfängers zu injizieren.Legen Sie am nächsten Tag eine Milz, die von einem Spendertier geerntet wurde, auf ein 40-Mikrometer-Netzsieb in einem 50-ml-Sammelrohr und drücken Sie mit einem Spritzenkolben das Milzgewebe durch das Sieb in das Rohr. Waschen Sie das Sieb und den Kolben mit PVS, um alle Splenozyten zu sammeln, und pellet die Zellen durch Zentrifugation. Nachdem rote Blutzelllyse nachgewiesen wurde, suspendieren Sie die weißen Blutkörperchen für die Zählung erneut und legen Sie eine sechsmal 10 zur sechsten Zelle aliquot für die nachgeschaltete zytometrische Analyse des Flusses beiseite.Für eine gesamtCD3-positive T-Zell-Isolierung von Gesamtsplenozyten verwenden Sie ein handelsübliches Zellreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers und legen sie ein mal 10 bis zum sechsten CD3-positiven T-Zell-Aliquot aus der positiven Zellfraktion für die nachgeschaltete zytometrische Analyse der Zellreinheit und -zusammensetzung vor und nach der Trennung beiseite. Dann injizieren Sie siebenmal 10 in die fünfte alloreaktive CD3-positive T-Zellen in 100 Mikroliter PVS intravenös in den Retrobulbar-Raum jeder Empfängermaus, um GvHD zu induzieren. Um GvHD-bezogene Läsionen durch Mini-Endoskopie des distalen dickdarmen Bereichs zu bewerten, heben Sie den Schwanz eines Empfängertiers mit einer Hand knapp über die Schwanzwurzel und verwenden sie mit der anderen Hand, um das Endoskop vorsichtig über den Anus in das Rektum einzufügen.Während der Luftstrom das kolorektale Lumen aufbläht, bewegen Sie das Endoskop langsam und vorsichtig in aboraler Richtung vorwärts. Um Darmverletzungen zu vermeiden, halten Sie das Endoskop im mittleren Bereich des Lumens mit dem Live-Videobildschirm, um bei dieser Positionierung zu helfen. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung des Videostreams und der Bewertung der Entzündung, indem Sie die GvHD-bedingte Entzündung des Dickdarms bewerten, indem Sie die Parameter wie dargestellt bewerten.Wenn ein Punkt gefunden wurde, bewegen Sie das Endoskop sanft und leicht hin und her, um die verschiedenen Parameter zu bewerten. Um den Parameter Transluzenz und Stuhlkonsistenz zu beurteilen, positionieren Sie das Endoskop in einem größeren Abstand in Bezug auf die Kolonwand. Um die Granularität und Vaskularität der Läsion zu beurteilen, positionieren Sie das Endoskop in unmittelbarer Nähe zur Kolonwand und tragen Sie sorgfältig gut dosierte Spannung auf die Kolonwand mit der Spitze des Endoskops auf.Beenden Sie nach Abschluss des Bewertungsprozesses die Aufzeichnung. Im Vergleich zu Kontrollen produziert die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation, wie gezeigt, eine reproduzierbar robuste Induktion eines systemischen GvHD-Phänotyps mit zunehmend steigenden klinischen GvHD-Scores bei Empfängertieren. Diese mini-endoskopisch bewertbaren Kriterien wurden speziell an die zuvor gemeldete syngene Kolitis im Zusammenhang mit allo-response-gesteuerten Colitis-Scoring-Parametern für die genaue Beschreibung, Bewertung und Einstufung von Darm-GvHD-Krankheit-assoziierten Läsionen im distalen Dickdarm angepasst.Tatsächlich ermöglicht das mini-endoskopisch basierte Benotungssystem eine einfache Diskriminierung von spender-lymphozytenempfangenden Mäusen mit schweren Anzeichen einer Darmentzündung von Kontrollmäusen, die im Wesentlichen ohne GvHD sind. Die Invalidität des mini-endoskopisch basierten Benotungssystems bestätigte, dass der Dickdarm von Mäusen, die stark von GvHD-bedingten Entzündungen betroffen sind, ähnlich starke histopathologische Anzeichen einer Entzündung aufweisen. Im Gegensatz dazu zeigten Dickdarmgewebe von Kontrollmäusen keine möglichst leichten histopathologischen Anzeichen einer Entzündung, im Einvernehmen mit dem virtuellen Fehlen von mini-endoskopisch nachweisbaren Anzeichen einer Kolitis.Darüber hinaus zeigen Korrelationsstudien zwischen mini-endooskopischer und histopathologisch bewerteter Kolitisaktivität und systemischen GvHD-Scores, dass mini-endoskopisch bestimmte Partituren von weniger als oder gleich drei zuverlässig das Fehlen von mittel- bis höhergradigen darmen GvHD-assoziierten Kolonentzündungen vorhersagen, die aus histopathologischer Benotung erhalten wurden. Darüber hinaus zeigt die Schwere der endoskopisch bewerteten Darm-GvHD eine Korrelation mit der systemischen GvHD-Krankheitsaktivität. Um die Ergebnisse der mini-endoskopischen Bewertung von Darmentzündungen zu standardisieren und die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Mäusen und Experimenten im Laufe der Zeit zu gewährleisten, sollte eine definierte anatomische Stelle für die Bewertung ausgewählt werden.Neben der Punktierung von Kolonentzündungen ermöglicht der eingebaute Arbeitskanal innerhalb des mini-endoskopischen Aufbaus das Abrufen von sichtgeführten Gewebebiopsien, die für verschiedene nachgeschaltete Analysen, wie z. B. standardhistopathische Analysen, anwendbar sind. Aufgrund der nicht-invasiven Natur der Mini-Endoskopie kann die akute GvHD-bedingte Kolitis nahezu jederzeit innerhalb desselben Tieres wiederholt beurteilt werden, was faszinierende Einblicke in Darm-GvHD gibt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Induktion der experimentellen autoimmunen Hypophysitis in SJL Mäuse

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

Die Induktion einer entzündlichen Reaktion in der Primär Hepatozyten-Kulturen von Mäusen

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Bewertung der zytotoxischen und immunmodulatorische Wirkung von Substanzen im menschlichen Precision-Cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Induktion und Bewertung der Graft-Versus-Host-Krankheit in einem xenogenen Murine-Modell und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mit digitaler PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Induktion der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis bei BALB/c-Mäusen zur Untersuchung ihrer pathogenen Mechanismen

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Knochenmarktransplantationsplattform zur Untersuchung der Rolle dendritischer Zellen bei Graft-versus-Host-Krankheit

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...