Name: induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice
Uploaded: 2019-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי שיתופי מחקר מרכזי (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; פרוייקט B03) (כדי בעדותה) 1181 בדיקת יתירות מחזורית (CRC-DFG, פרוייקט B05) (כדי בעדותה), שניהם במימון פתוח (DFG, קרן מחקר גרמני).

ניסיוני בשיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הממשלה של Mittelfranken, בוואריה, גרמניה.
1. GvHD אינדוקציה
<ol><li>יום 0: גופית של העכברים הנמען
	<ol>
<li>השתמש הנשי CD45.2+ H2kd+ BALB/c עכברים כי הם בן כ נמענים לפחות 10 שבועות.</li>
		<li>שוקל ולהקליט את המשקל של העכברים הנמען לפני GvHD אינדוק?...

<ol>
	<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+pathogenesis+of+graft-versus-host+disease.">Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease.</a> British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).</li><li>Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+GvHD:+pathogenesis+and+classification.">Acute GvHD: pathogenesis and classification.</a> Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).</li><li>Naymagon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+graft-versus-host+disease+of+the+gut:+considerations+for+the+gastroenterologist.">Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14, 711-726 (2017).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation.</a> Blood. 127, 3117-3126 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Anthony, B. A., Hadley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+graft-versus-host+disease+and+in+vivo+T+cell+monitoring+using+an+MHC-matched+murine+model.">Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).</li><li>Beilhack, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+acute+graft-versus-host+disease+by+blocking+T-cell+entry+to+secondary+lymphoid+organs.">Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs.</a> Blood. 111, 2919-2928 (2008).</li><li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+colonoscopy+in+live+mice.">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).</li><li>Buchele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Inflammatory+T+Helper+Cells+via+Retinoic+Acid-Related+Orphan+Receptor+Gamma+t+Is+Ineffective+to+Prevent+Allo-Response-Driven+Colitis.">Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).</li><li>Ullrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BATF-dependent+IL-7RhiGM-CSF++T+cells+control+intestinal+graft-versus-host+disease.">BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).</li><li>Kaplan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+antigens+determine+graft-versus-host+disease+phenotype.">Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype.</a> Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).</li></ol>

הפרוטוקול מתאר את המתודולוגיה של אינדוקציה ובחינת מיני-אנדוסקופית פנוטיפ חוקן נצפתה במהלך GvHD מעיים. היא מגישה את מטרת הרחב מאפשר למדענים ללמוד GvHD מעיים longitudinally ו noninvasively במהלך המחלה כולו (כלומר, מתוך תחילתה של ביטוי חוקן והתקדמות עד פעילות המחלה מקסימלי).
עם זאת, ישנם כמה של?...

Hematopoietic ממאירות הנובעת ישירות מן התא בתאי גזע hematopoietic בלתי מבוקרת, מתקדם במהירות, הפרעות קשות בתיווך החיסונית לעתים קרובות אינדיקציות לביצוע מאפשר-של HCT1,2. עם זאת, למרות החשבונאי המופע של התגובה שתל-נגד-גידול prognostic מועיל, התורם לימפוציטים הם לעתים קרובות גרימת וקידום התקפה בתיווך החיסון לא רצויים של רקמה בריאה רכיבים בתוך המטופל מאפשר-של HCT , תהליך זה נקרא שתל – מול – מארח מחלות3. ביטויים בבטן, GvHD מעיים, כביכול מייצגים הסיבוך המפחיד ביותר של GvHD אקוטי, צורות חמורות אשר קשורים באופן שגרתי עם תמותה גבוהה1,2,4.
באופן כללי, מאתר דגמי מאפשר-של HCT הופיעו כלי יקר ערך לזהות וללמוד מנגנוני החיסון בתיווך שבבסיס בפתוגנזה של GvHD5. עם זאת, ההערכה קינטי, למשל, ההשפעות המיטיבות של התערבויות טיפוליות הרומן לאורך זמן בעכברים בשידור חי באופן שגרתי מבוסס על הקביעה של GvHD קליניים ציונים6. בעוד אלה ציונים מתאימים לשקף, למשל, המחלה הנטל הכולל (קרי, מערכתית GvHD), קליניים ציונים חוסר הרגישות באופן אמין לשקף ביטויים ייחודיים (למשל, בבטן). לפיכך, מסקנות, למשל בכל הנוגע תופעות בטן-מגן של התערבות טיפולית נתון, בהתבסס על אלה הבקיע מערכות בדרך כלל נופל קצר.
למרות התקדמות גדולה דרך ההמצאה של הרומן לכל הגוף הדמיה שיטות בשילוב עם השימוש של עכבר גנטי זוהרים או פלורסנט דגמי7,8, מתודולוגיות ישירות, במיוחד להעריך את המעי ביטוי של GvHD בעכברים בשידור חי חסרים. ומכאן, הרציונל מאחורי הפרוטוקול של הערכת אנדוסקופי פנוטיפ GvHD מעיים המתוארים בסעיף הבא הוא כדי להתגבר על מכשול זה. יתר על כן, המוטיבציה היא גם לצמצם מספרים עכברים ניסיוני מאז, עד כה, הערכה מפורטת של המאפיינים הסלולר, מורפולוגיים מולקולרית (למשל, על ידי histopathology או ביולוגיה מולקולרית) של GvHD מעיים ביטוי דרש בסופו של דבר את ההקרבה של העכבר ניסיוני.
המוסד שלנו דיווח בעבר על המתודולוגיה של הערכה מיני-אנדוסקופית של המעי הגס הגילויים במהלך syngeneic קוליטיס מודלים9. בפרוטוקול המובאת כאן, יש מעודן ואנו הותאם colonoscopic את הניקוד מטריקס עבור מונחי-alloresponse קוליטיס בעכברים בשידור חי עם מעיים GvHD על השתלת של alloreactive של HCT ושל התורמים לימפוציטים מחלקה MHC מלא תואמים הגדרה . זיהינו ארבעה פרמטרים מתאימים לשקף נגעים חוקן הקשורות GvHD מעיים. יתר על כן, הקמנו מערכת המאפשרת מכויל לדירוג של כל דטרמיננטה יחידה, וכתוצאה מכך ניקוד חדש המודיעה בקלות לקורא חומרת מעיים GvHD נוכח עכבר נתון בנקודת זמן נתונה. ניתוחים histopathological אישר כי ניקוד אנדוסקופי מעל לסף מסוים הוא אמין חיזוי דלקת ברקמות כיתה בינונית-גבוהה. לפיכך, מיני-אנדוסקופית להערכה מופיעה כדי לייצג תחליף עובד histopathology תקן זהב הדורש באופן שגרתי את ההקרבה של העכברים ניסיוני. חשוב, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כמעט בכל נקודת זמן נתון, ניתן להשתמש שוב ושוב במהלך המחלה10,11. יתר על כן, בניגוד השימוש ביולומינסנציה תלוית גישות, אין אמצעי העבודה רגשניים ולגזול כמו intercrossing גנטית שונה עכברים נדרשים, לפיכך, המתודולוגיה יכול להיות מיושם על העכבר כמעט בכל תחום ריבית.
יחדיו, בהתחשב ההיבט הקליני מזיקה מחולי מאפשר-של HCT GvHD מעיים חמורה, התקדמות מדעית מהירה, תובנה רבה יותר המנגנונים המולקולריים שבבסיס בפתוגנזה המערכת החיסונית הם צורך דחוף. באופן דומה, שיקולים חשובים, אתי דורשים כי הרווח של הידע צריך להיות מושגת עם הקישורים של מספר מינימלי של עכברים ניסיוני. לפיכך, שניהם מזוהה טענות על קהילת המחקר חקר GvHD מעיים ניתן מתקדמים על-ידי יישום הערכות טורי מיני-אנדוסקופית של המעי הגס בשרשרת עבודה ניסויית כדי לפקח, כיתה GvHD מעיים עכבר ניסיוני בשידור חי מודלים, כמו שמתואר המאומת בפרוטוקול המוצג כאן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1249px;" width="1249">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator</td>
			<td style="width:216px;">Gamma-Service Meical GmbH</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:479px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Phosphate-buffered saline (PBS )</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>D8662-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>R8758-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Hypodermic needle (26G)</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">1 mL syring</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:152px;">9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">50 mL tube</td>
			<td style="width:216px;">Sarstedt Ag &#38; Co.KG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Cell strainer with a 40 &#181;m mesh screen</td>
			<td style="width:216px;">BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td style="width:152px;">11209</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">8043.2</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td style="width:152px;">1,048,540,500</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pan T Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-095-130</td>
			<td>magnet cell separation to isolate splenic T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>109822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>110730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Filtrated bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Pan Biotec</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>ingredient of FACS buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well polystyrene V-bottom plates</td>
			<td style="width:216px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">651201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:152px;">352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSRFortessa II flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Insulin syringe with sterile interior (30G)</td>
			<td style="width:216px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:152px;">324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Oxy Vet Oxymat 3</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>oxygen concentrator&#160; for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">NarkoVet&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">213062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Plexiglass chamber&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">214620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Straight Forward Telescope</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>64301 AA</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protection and Examination Sheath</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 C</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Examination Sheath with working channel</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 D</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Biopsy Forceps</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">61071 ZJ&#160;</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;175 Watt SCB XenonLight Source</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">20132120</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber Optic Light Cable</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">495 NL</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 S3 Camera Head</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22220030</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 SCB Camera Control Unit</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22200020</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">LCD monitor</td>
			<td style="width:216px;">Olympus</td>
			<td>OEV181H</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forane / Isofluran</td>
			<td>AbbVie Inc.&#160;</td>
			<td>B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution 37 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">7398.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5,0 mL Dispenser tip&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eppendorf AG</td>
			<td align="right">30089456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice

חריפה שתל – מול – מארח מחלות (GvHD) מייצג סיבוך חמור ביותר כי חולים שעברו בעבר גזע allogeneic התא hematopoietic (מאפשר-של HCT) השתלת הפנים, קשורה לעיתים קרובות עם תוצאה קליניים עניים. למשל, GvHD ביטויים של העור הם בדרך כלל מגיבים טיפולים מדכאים חיסונית הוקמה ותוך, לפיכך, לא לוקח קורס קטלנית, הנוכחות, האינטנסיביות של GvHD מעיים, במיוחד חלקים באמצע להתחתון של הבטן, משפיעים מאוד על התוצאה, באופן כללי ההישרדות של חולים עם חריפה GvHD. טיפולית אפשרויות מוגבלות בעיקרו הסוכנים מדכאים חיסונית קלאסי מניבים רק מתון מקלים-מחלת אפקטים. לפיכך, ידע מפורט על המפל רקמות תושב המערכת החיסונית, שינויים microbiota מעיים, התגובה סטרומה לפני, בעת ואחרי תחילת GvHD מעיים נחוצים בדחיפות כדי להבין את האירועים ובמנגנונים שבבסיס שלה הפתוגנזה לפתח אפשרויות טיפוליות חדשניות. מודלים מאתר של GvHD מועסקים לעיתים קרובות כדי לזהות ולהעריך באופן פונקציונלי מולקולות מסלולים putatively נהיגה GvHD מעיים. עם זאת, אומר במפורש לפקח ולהעריך דלקת מעיים לאורך זמן חסרים בעצם מאז הוקמה ציונים כדי להעריך כיתה GvHD אקוטי באופן שגרתי מורכבות של פרמטרים שונים המשקפים מעדיף GvHD מערכתית ביטויים. הערכה מפורטת של GvHD מעיים הוגבלה ללימודים שימוש בעכברים לאללה, ובכך למעשה למעט האורך (קרי, קינטי) ניתוחים של תא שטיפת המעי הגס תחת תנאי הניסוי (למשל, נוגדן בתיווך המצור ציטוקינים proinflammatory) בעכברים בשידור חי (קרי, in vivo). ההערכה באתרו מיני-אנדוסקופית של המעי הגס דיסטלי של מאפשר של HCT-מטופלים עכברים המתוארים כאן מאפשר a) הערכה מאקרוסקופית מפורט של היבטים שונים של דלקת מעיים ו- b) את האפשרות לאסוף דגימות רקמה עבור ניתוחים במורד הזרם- נקודות זמן שונות במהלך תקופת תצפית. באופן כללי, הגישה מיני-אנדוסקופית מספק התקדמות גדולה ב פרה לא פולשנית ניטור והערכה של GvHD מעיים.

בפרוטוקול הנוכחי, המתארת את ההערכה מיני-אנדוסקופית של המעי GvHD-הקשורים נגעים של המעי הדיסטלי, הוקמה ואומת בעכברים בעבר נתון של אינדוקציה מערכתית של מודל GvHD אקוטי חמורה. במחקר זה, היינו מחלקה MHC אני תואמים באופן מלא מערכת מודל אשר BALB/ג' עכברים היו אולם מוקרן, ולאחר מכן את השת?...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

אינדוקציה של מעיים שתל – מול – מארח מחלות והערכה מיני-אנדוסקופית שלה בעכברים בשידור חי

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מתאר השתלת תא גזע allogeneic hematopoietic ומאפשרת חוזרות הערכות מיני-אנדוסקופית של המעי הגס דיסטלי באתרו נוכחות, מאפיינים של חומרת דלקת מעי בתוך בשידור חי עכברים הסובלים מעיים שתל – מול – מארח מחלות.

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

הערכה מיני אנדוסקופית של המעי הגס בעכברים חיים מספקת תמיכה ניסיונית מרכזית בחקירת ביטויי מעיים של מחלה חריפה של גרף מול מארח, GvHD, על השתלת תאי גזע אלוגניים, hematopoietic. ההערכה הלא פולשנית של קוליטיס חריפה הקשורה ל- GvHD יכולה לתפקד כתחליף עובד להיסטופתולוגיה של תקן זהב, ובכך להפוך קורבנות חוזרים ונשנים של בעלי חיים כדי להשיג דגימות רקמה מיותרות. הדגימה של ההליך תהיה ורה בוצ'ל, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.יום אחד לאחר הקרנת הגוף הכולל של העכברים BALB / c הנמען, למקם CD-45.1 לחיות 5B6 עכבר תורם SJL במצב נוטה על נדן עבודה נקי, ולהשתמש אחד 13 ס"מ מעוקל משונן קצה של מדפים סימקין להרים את הפרווה בעקב אכילס אחד. באמצעות מספריים עדין מוקשה 8.5 ס"מ עם טיפים ישרים, חתוך את העור בין המדחפים ועקב אחד, הארכת החתך בקריאנית כדי להקל על הסרת העור ופרווה מן הגפיים האחוריות. כאשר העור הוסר מהגפיים האחוריות, חתוך דרך כל מפרק ירך, קרסול וברכיים.לאחסן את הירך ואת השוק של כל איבר אחורי בצלחת פטרי אחת 92 מ"מ מלא PVS על קרח בזהירות להסיר כמה שרירים ככל האפשר מכל עצם, העברת כל עצם ירך ניקה שוקה לתוך צינור 50 מ"ל של RPMI סטרילי 1640 בינוני על קרח רטוב. כדי לבודד את מח העצם, מעבירים עצם אחת בכל פעם לתבשיל פטרי חדש של 92 מ"ל מלא במדיום RPMI 1640 טרי, ולהשתמש באזמל כדי לחתוך את הקצוות של כל עצם. לאחר מכן, השתמש מזרק 1 מ"ל מצויד מחט 26-מד לשטוף את העצמות עם 1 מ"ל של מדיום טרי בכל פעם לתוך צינור איסוף 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום.כאשר כל העצמות כבר סמוקות, בעדינות pipette חתיכות מח עצם מתפורר למעלה ולמטה מספר פעמים כדי ליצור השעיה של תא יחיד לפני סינון התאים דרך מסננת תא רשת 40 מיקרומטר לתוך צינור איסוף חדש 50 מ"ל. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את התאים ב 5 מ"ל של אמוניום כלורי אשלגן תמוגה חיץ עבור דגירה של שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לעצור את התגובה עם 10 מ"ל של PVS, צנטריפוגה התאים שוב.להשעות מחדש את גלולה ב 2 מ"ל של PVS טרי לספירה, ולהניח בצד שש פעמים 10 כדי aliquot התא השישי לניתוח ציטומטרי זרימה במורד הזרם. לאחר מכן, השתמש בערכת טיהור תאים זמינה מסחרית כדי לרוקן מגנטית את תאי ה- T החיוביים של CD90.2 מההשעיה החד-תאית של מח העצם, בהתאם להוראות היצרן, והניח בצד את עליקוט התא השישי של האלוט המדולדל של תאי T לניתוח ציטומטרי של זרימת הזרם במורד הזרם של טוהר התא והרכבו לפני ואחרי ההפרדה. לאחר מכן, השתמש מזרק 1-mL מצויד מחט 30-מד להזריק חמש פעמים 10 לתאי מח עצם מדולדל T-cell החמישי ב 100 microliters של PVS דרך הווריד לתוך החלל retrobulbar של הסינוס הוורידי של כל חיה נמען מוקרן.למחרת, מניחים טחול שנקטף מבעל חיים תורם על מסננת רשת 40 מיקרומטר בצינור איסוף 50 מ"ל, ולהשתמש בוכנה מזרק ללחוץ על רקמת הטחול דרך מסננת לתוך הצינור. לשטוף את מסננת ובוכנה עם PVS כדי לאסוף את כל הטחול, ו גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר תותבת תאי הדם האדומים הוא הפגין, להשעות מחדש את תאי הדם הלבנים לספירה, ולהניח בצד שש פעמים 10 כדי aliquot התא השישי לניתוח ציטוטי זרימה במורד הזרם.עבור בידוד תא T3 חיובי הכולל מן הטחול הכולל, להשתמש בערכת טיהור תאים זמינה מסחרית על פי הוראות היצרן, ולהניח בצד פעם אחת 10 כדי aliquot תא T חיובי CD3 השישי מן שבר התא החיובי עבור ניתוח ציטומטרי זרימה במורד הזרם של טוהר התא והרכב לפני ואחרי ההפרדה. לאחר מכן, להזריק שבע פעמים 10 לתאי CD3 חיוביים ALLOREactive החמישי ב 100 microliters של PVS דרך הווריד לתוך שטח רטרובולבר של כל עכבר נמען כדי לגרום GvHD. כדי להבקיע נגעים הקשורים ל- GvHD על ידי מיני אנדוסקופיה של אזור המעי הדיסטלי, הרם את הזנב של בעל חיים נמען ממש מעל שורש הזנב ביד אחת, ולהשתמש ביד השנייה כדי להכניס בזהירות את האנדוסקופ לפי הטבעת דרך פי הטבעת.בעוד זרם האוויר מנפח את לומן המעיים, לאט ובזהירות להזיז את אנדוסקופ קדימה בכיוון aboral. כדי למנוע פציעות מעי המעי הגס, לשמור על אנדוסקופ באזור האמצעי של לומן באמצעות מסך וידאו חי כדי לסייע במיקום זה. התחל להקליט את זרם הווידאו והבקיע את הדלקת, הערכת דלקת הקשורות GvHD של המעי הגס על ידי ניקוד הפרמטרים כפי שמודגם.כאשר נקודת ניקוד אותרה, הזז את האנדוסקופ בעדינות ומעט קדימה ואחורה כדי להעריך את הפרמטרים השונים. כדי להעריך את שקוף הפרמטר ועקביות הצואה, מקם את האנדוסקופ במרחק רחב יותר ביחס לקיר המעי הגס. כדי להעריך את הצפיפות ואת כלי הדם של הנגע, למקם את אנדוסקופ בסמיכות לקיר המעי הגס, בזהירות להחיל מתח מנון היטב על הקיר המעי הגס עם קצה האנדוסקופ.עם השלמת תהליך הניקוד, הפסק את ההקלטה. בהשוואה לפקדים, השתלת תאי גזע hematopoieic allogenic כפי שהוכח מייצרת אינדוקציה חזקה להתרבות של פנוטיפ GvHD מערכתי, עם הגדלת בהדרגה ציוני GvHD קליניים בבעלי חיים הנמען. קריטריונים אלה להערכת מיני אנדוסקופית הותאמו במיוחד קוליטיס סינגנית שדווחו בעבר בהקשר של פרמטרים ניקוד קוליטיס מונחה תגובה allo לתיאור מדויק, ניקוד, ו דירוג של נגעים הקשורים למחלות GvHD במעיים במעי הגס.ואכן, מערכת הדירוג המבוססת על מיני אנדוסקופיה מאפשרת אפליה קלה של עכברים המקבלים תורמים-לימפוציטים עם סימנים חמורים של דלקת מעיים מעכברי בקרה נטולי GvHD. לעומת זאת, רקמות המעי הגס של עכברי שליטה הראו לא, לכל היותר, סימנים היסטופתולוגיים קלים של דלקת, בהסכמה עם היעדר וירטואלי של סימנים מיני אנדוסקופיים לזיהוי של קוליטיס.יתר על כן, מחקרי מתאם בין מיני אנדוסקופיה והיסטופתולוגית העריכו פעילות קוליטיס וציוני GvHD מערכתיים מראים כי מיני אנדוסקופית קבעה כמה ציונים של פחות או שווה לשלושה לחזות באופן אמין את היעדר ציונים דלקת המעי הקשורים GvHD בדרגה בינונית עד גבוהה יותר שהתקבלו דירוג היסטופתולוגי. בנוסף, חומרת GvHD מעיים אנדוסקופי מוערך מראה מתאם עם פעילות מחלת GvHD מערכתית. כדי לתקנן את התוצאות של הערכה מיני אנדוסקופית של דלקת קולונית ולהבטיח השוואה בין עכברים וניסויים שונים לאורך זמן, יש לבחור אתר אנטומי מוגדר לניקוד.בנוסף לדלקת המעי הגס ניקוד, ערוץ העבודה המובנה בתוך ההתקנה האנדוסקופית מיני מאפשר אחזור של ביופסיות רקמות מונחות תצוגה החלות על ניתוחים שונים במורד הזרם, כגון היסטופתולוגיה סטנדרטית. בשל האופי הלא פולשני של המיני אנדוסקופיה, קוליטיס חריפה הקשורה GvHD ניתן להעריך שוב ושוב בתוך אותה חיה כמעט בכל עת, ובכך להניב תובנות מרתקות לתוך GvHD מעיים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימוניות הניסויי עכברים SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

אינדוקציה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis עכברים וההערכה של הפצת מחלות התלויה של תאים חיסוניים ברקמות שונות

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

שיטה לא פולשנית הטכנית ללא עתירי עבור אינדוקצית phenotyping של דלקת ריאות חיידקית הניסויית עכברים

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

הערכת ציטוטוקסיות ואפקטים Immunomodulatory של חומרים אמבריולוגיה דיוק-לחתוך פרוסות

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

אינדוקציה והבקיע של מחלת השתל מול מארחים ב מודל Murine מורה Xenoic ו כימות האדם תאים T ברקמות העכבר באמצעות PCR דיגיטלי

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

אינדוקציה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות בעכברי BALB/c לחקר המנגנונים הפתוגניים שלה

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

עצם השתלת מח פלטפורמת לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים במחלה שתל-מול מארח

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...