Name: induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice
Uploaded: 2019-02-11T13:00:00
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Questo studio è stato sostenuto dal Collaborative Research Center (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; progetto B03) (a K.H.) e CRC 1181 (CRC-DFG, progetto B05) (a K.H.), entrambi finanziati dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation).

I metodi sperimentali descritti qui sono stati approvati dal governo di Baviera, Baviera, Germania.
1. GvHD induzione
<ol><li>Giorno 0: Irradiazione dal corpo intero dei topi destinatari
	<ol>
<li>Utilizzare femmina CD45.2+ H2kd+ BALB/c topi che sono almeno 10 settimane di vita come destinatari.</li>
		<li>Pesare e registrare il peso dei topi destinatari prima di induzione di GvHD. Nota: Assicurarsi che il destinatario abbia un peso ...

<ol>
	<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+pathogenesis+of+graft-versus-host+disease.">Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease.</a> British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).</li><li>Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+GvHD:+pathogenesis+and+classification.">Acute GvHD: pathogenesis and classification.</a> Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).</li><li>Naymagon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+graft-versus-host+disease+of+the+gut:+considerations+for+the+gastroenterologist.">Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14, 711-726 (2017).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation.</a> Blood. 127, 3117-3126 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Anthony, B. A., Hadley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+graft-versus-host+disease+and+in+vivo+T+cell+monitoring+using+an+MHC-matched+murine+model.">Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).</li><li>Beilhack, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+acute+graft-versus-host+disease+by+blocking+T-cell+entry+to+secondary+lymphoid+organs.">Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs.</a> Blood. 111, 2919-2928 (2008).</li><li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+colonoscopy+in+live+mice.">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).</li><li>Buchele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Inflammatory+T+Helper+Cells+via+Retinoic+Acid-Related+Orphan+Receptor+Gamma+t+Is+Ineffective+to+Prevent+Allo-Response-Driven+Colitis.">Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).</li><li>Ullrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BATF-dependent+IL-7RhiGM-CSF++T+cells+control+intestinal+graft-versus-host+disease.">BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).</li><li>Kaplan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+antigens+determine+graft-versus-host+disease+phenotype.">Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype.</a> Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).</li></ol>

Il protocollo descrive la metodologia di induzione e mini-endoscopica valutazione del fenotipo Colico osservato nel corso della GvHD intestinale. Serve lo scopo più ampio di consentendo agli scienziati di studiare la GvHD intestinale longitudinalmente e non invadente nel corso intero della malattia (cioè, fin dall'inizio della manifestazione colica e progressione fino alle attività di malattia massima).
Tuttavia, ci sono alcuni passaggi critici e importanti limitazioni inerenti alle metodol...

Malignità ematopoietiche direttamente derivanti dal compartimento di cellule staminali ematopoietiche e incontrollata, rapida progressione e gravi disordini immune-mediati sono spesso indicazioni per eseguire allo-HCT1,2. Tuttavia, anche se la contabilità per l'avvenimento della risposta prognostica favorevole dell'innesto-contro-tumore, linfociti del donatore sono frequentemente inducendo e promuovere un attacco immune-mediata indesiderato delle componenti del tessuto sano all'interno il destinatario allo-HCT , un processo che viene chiamato malattia dell'innesto - contro - ospite3. Manifestazioni nell'intestino, il cosiddetto GvHD intestinale, rappresentano la complicazione più temuta di GvHD acuta, forme gravi di cui sono abitualmente associate con un alto tasso di mortalità1,2,4.
Nel complesso, murini modelli di allo-HCT sono emersi come preziosi strumenti per identificare e studiare il meccanismo immune-mediato la patogenesi di GvHD5. Tuttavia, valutazione cinetico di, per esempio, gli effetti benefici di nuovi interventi terapeutici nel corso del tempo nei topi dal vivo è ordinariamente basato su punteggi la determinazione di GvHD clinico6. Mentre questi punteggi sono adatti per riflettere, per esempio, il carico globale di malattia (cioè, la GvHD sistemica), clinico Spartiti mancanza la sensibilità per rispecchiare in modo affidabile le manifestazioni organo-specifici (ad esempio, nell'intestino). Quindi, conclusioni, per esempio riguardo agli effetti di gut-protettivo di un determinato intervento terapeutico, che si basano su questi sistemi di Punteggio di solito cadono a breve.
Nonostante importanti progressi attraverso l'invenzione del corpo intero romanzo modalità in combinazione con l'utilizzo di entrambi modelli mouse genetico bioluminescenti o fluorescente7,8, metodologie per direttamente e specificamente di formazione immagine valutare l'intestinale manifestazione di GvHD in topi dal vivo sono carenti. Quindi, la spiegazione razionale dietro il protocollo della valutazione endoscopica del fenotipo intestinale GvHD descritto nella sezione successiva è di superare questo ostacolo. Inoltre, la motivazione è anche per ridurre il numero di topi sperimentali dal momento che, finora, una valutazione dettagliata delle caratteristiche cellulari, morfologiche e molecolari (ad es., di istopatologia o biologia molecolare) di GvHD intestinale manifestazione ha infine ha richiesto il sacrificio del mouse sperimentale.
Nostra istituzione ha precedentemente segnalata sulla metodologia di valutazione endoscopica mini di manifestazioni coliche nel corso di colite syngeneic modelli9. Nel protocollo presentato qui, abbiamo perfezionato e adattato il colonoscopic scoring matrix per alloresponse-driven colite in topi dal vivo con GvHD intestinale dopo trapianto di alloreactive linfociti HCT e donatore in un MHC di classe completamente malassortiti impostazione . Abbiamo identificato quattro parametri adatti per riflettere lesioni coliche correlate a GvHD intestinale. Inoltre, abbiamo istituito un sistema che permette una classificazione messa a punto di qualsiasi singolo determinante, risultante in un nuovo punteggio che prontamente informa il lettore circa la gravità della GvHD intestinale presente in una specificata del mouse in un punto determinato momento. Analisi istopatologiche hanno confermato che un punteggio endoscopico sopra una certa soglia è attendibilmente la previsione infiammazione tissutale moderato--alto grado. Quindi, la valutazione endoscopica mini sembra rappresentare un sostituto di lavoro per l'istopatologia di parità aurea che ordinariamente richiede il sacrificio di topi sperimentali. D'importanza, questo protocollo può essere applicato a praticamente qualsiasi punto determinato momento e può essere usato ripetutamente nel corso della malattia10,11. Inoltre, in contrasto con l'utilizzo di approcci di bioluminescenza-dipendente, non richiede molto tempo e lavoro intenso come topi incrociando geneticamente modificati sono necessarie misure e, quindi, la metodologia può essere applicata su qualsiasi linea di mouse di interesse.
Presi insieme, dato il punto di vista clinico dannoso dei pazienti allo-HCT con GvHD intestinale severo, rapidi progressi scientifici e approfondire i meccanismi molecolari alla base della patogenesi immune sono urgentemente necessari. Allo stesso modo, considerazioni importanti, etici richiedono che il guadagno della conoscenza dovrebbe essere realizzato con l'utilizzo di un numero minimo di topi sperimentali. Quindi, entrambi riconosciuti crediti verso la comunità di ricerca esplorando GvHD intestinale può essere avanzata implementando valutazioni serie mini-endoscopica del colon nella catena di lavoro sperimentale per monitorare e grado GvHD intestinale in vivo sperimentale del topo modelli, come descritto e convalidato nel protocollo presentato qui.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1249px;" width="1249">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator</td>
			<td style="width:216px;">Gamma-Service Meical GmbH</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:479px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Phosphate-buffered saline (PBS )</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>D8662-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>R8758-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Hypodermic needle (26G)</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">1 mL syring</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:152px;">9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">50 mL tube</td>
			<td style="width:216px;">Sarstedt Ag &#38; Co.KG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Cell strainer with a 40 &#181;m mesh screen</td>
			<td style="width:216px;">BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td style="width:152px;">11209</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">8043.2</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td style="width:152px;">1,048,540,500</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pan T Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-095-130</td>
			<td>magnet cell separation to isolate splenic T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>109822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>110730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Filtrated bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Pan Biotec</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>ingredient of FACS buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well polystyrene V-bottom plates</td>
			<td style="width:216px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">651201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:152px;">352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSRFortessa II flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Insulin syringe with sterile interior (30G)</td>
			<td style="width:216px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:152px;">324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Oxy Vet Oxymat 3</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>oxygen concentrator&#160; for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">NarkoVet&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">213062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Plexiglass chamber&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">214620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Straight Forward Telescope</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>64301 AA</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protection and Examination Sheath</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 C</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Examination Sheath with working channel</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 D</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Biopsy Forceps</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">61071 ZJ&#160;</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;175 Watt SCB XenonLight Source</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">20132120</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber Optic Light Cable</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">495 NL</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 S3 Camera Head</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22220030</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 SCB Camera Control Unit</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22200020</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">LCD monitor</td>
			<td style="width:216px;">Olympus</td>
			<td>OEV181H</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forane / Isofluran</td>
			<td>AbbVie Inc.&#160;</td>
			<td>B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution 37 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">7398.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5,0 mL Dispenser tip&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eppendorf AG</td>
			<td align="right">30089456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice

Malattia di acuta dell'innesto - contro - ospite (GvHD) rappresenta la complicazione più grave che i pazienti precedentemente sottoposti a faccia (allo-HCT) il trapianto di cellule staminali emopoietiche allogeniche e frequentemente è associata con un risultato clinico difficile. Mentre, per esempio, GvHD manifestazioni della pelle sono solitamente rispondenti alle terapie immune-soppressivi stabilite e sono, quindi, non prendendo un corso mortale, la presenza e l'intensità di GvHD intestinale, soprattutto delle parti metà inferiore dell'intestino, fortemente influenzare il risultato e nel complesso la sopravvivenza dei pazienti con acuta GvHD. opzioni terapeutiche sono essenzialmente limitata agli agenti immune-soppressivi classici cedendo solo moderati malattia-attenuare gli effetti. Quindi, conoscenza dettagliata circa la cascata immune residente in tessuto, cambiamenti del microbiota intestinale, e la risposta stromal prima, al momento e dopo l'inizio di GvHD intestinale sono urgentemente necessarie per comprendere gli eventi e i meccanismi sottostanti la patogenesi e a sviluppare opzioni terapeutiche innovative. Modelli murini di GvHD sono utilizzati spesso per identificare e valutare funzionalmente molecole e vie putativamente guida GvHD intestinale. Tuttavia, mezzi per monitorare e valutare l'infiammazione intestinale nel corso del tempo sono essenzialmente carenti poiché punteggi stabiliti per valutare e GvHD acuta di grado ordinariamente sono costituiti da vari parametri che riflettono piuttosto GvHD sistemica manifestazioni. La valutazione dettagliata di GvHD intestinale è stata limitata agli studi facendo uso dei topi eutanasizzati, escluse quindi essenzialmente longitudinale (cioè, cinetica) analisi del comparto Colico sotto una determinata condizione sperimentale (ad es., anticorpo-mediata blocco di una citochina proinflammatory) in topi dal vivo (cioè, in vivo). La valutazione in situ mini-endoscopica del colon distale dei topi allo-HCT-trattati qui descritto consente un) una dettagliata valutazione macroscopica dei diversi aspetti dell'infiammazione intestinale e b) la possibilità di raccogliere campioni di tessuto per analisi successive alle vari intervalli di tempo nel corso del periodo di osservazione. Nel complesso, l'approccio mini-endoscopico fornisce un avanzamento importante nel monitoraggio non invasivo preclinico e valutazione di GvHD intestinale.

Il protocollo attuale, che descrive la valutazione mini-endoscopica delle lesioni associate a GvHD intestinale del colon distale, è stato stabilito e convalidato in topi precedentemente sottoposti ad induzione sistemica di un modello di GvHD acuto severo. In questo studio, abbiamo usato un MHC di classe mal adattato completamente sistema di modello in cui BALB/c topi sono stati irradiati letalmente, seguita da trapianto di T-cellula-esaurito allogeneic del midollo osseo e dall'amministra...

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Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Induzione di intestinale Graft - versus - host Disease e sua valutazione endoscopica Mini in topi dal vivo

Qui, presentiamo un protocollo che descrive il trapianto di cellule staminali emopoietiche allogeniche e consente valutazioni ripetitivi mini-endoscopica del colon distale in situ per la presenza, caratteristiche e la severità di infiammazione colica all'interno dal vivo topi affetti da malattia intestinale graft - versus - host.

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

La valutazione mini-endoscopica del colon nei topi vivi fornisce un supporto sperimentale chiave per lo studio delle manifestazioni intestinali della malattia acuta grafo-contro-ospite, GvHD, sul trapianto di cellule staminali allogeniche ed ematopoietiche. La valutazione non invasiva della colite acuta correlata al GvHD può funzionare come sostituto funzionante dell'istopatologia gold standard, rendendo così inutili ripetuti sacrifici animali per ottenere campioni di tessuto. A dimostrare la procedura sarà Vera Buchele, un post-doc del mio laboratorio.Un giorno dopo l'irradiazione totale del corpo dei topi BALB/c riceventi, posizionare un topo donatore 5B6 SJL vivo CD-45.1 nella posizione prona su una fodera di lavoro pulita e utilizzare una punta curva e seghettata di 13 cm di una forza simkin per sollevare la pelliccia ad un tallone d'Achille. Utilizzando forbici fini indurite da 8,5 cm con punte dritte, incidere la pelle tra le forcep e un tallone, allungando l'incisione cranicamente per facilitare la rimozione della pelle e della pelliccia dagli arti posteriori. Quando la pelle è stata rimossa dagli arti posteriori, tagliare ogni anca, caviglia e articolazione del ginocchio.Conservare la coscia e il gambo di ogni arto posteriore in un'unica piastra di Petri da 92 mm riempita di PVS sul ghiaccio e rimuovere con cura il maggior numero possibile di muscoli da ogni osso, trasferendo ogni femore e tibia puliti in un tubo da 50 ml di mezzo sterile RPMI 1640 su ghiaccio bagnato. Per isolare il midollo osseo, trasferire un osso alla volta in una nuova piastra di Petri da 92 mL riempita con mezzo RPMI 1640 fresco e utilizzare un bisturi per tagliare le estremità di ogni osso. Successivamente, utilizzare una siringa da 1 ml dotata di un ago calibro 26 per sciacquare le ossa con 1 ml di mezzo fresco alla volta in un tubo di raccolta da 50 ml contenente 5 ml di mezzo.Una volta che tutte le ossa sono state latte, pipettare delicatamente i pezzi di midollo osseo friabile su e giù più volte per generare una sospensione a cella singola prima di filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare a rete da 40 micrometri in un nuovo tubo di raccolta da 50 ml. Pellettare le cellule mediante centrifugazione e sospendere di nuovo le cellule in 5 mL di tampone di lisi del cloruro di ammonio di potassio per un'incubazione di tre minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, interrompere la reazione con 10 mL di PVS e centrifugare nuovamente le cellule.Sospendere di nuovo il pellet in 2 mL di PVS fresco per il conteggio e mettere da parte un'aliquota sei volte 10 alla sesta cella per l'analisi citometrica a flusso a valle. Successivamente, utilizzare un kit di purificazione cellulare disponibile in commercio per esaurire magneticamente le cellule T CD90.2-positive dalla sospensione a cella singola del midollo osseo, secondo le istruzioni del produttore, e mettere da parte un'aliquota di una volta e 10 alla sesta cella dell'eluato impoverito della cellula T per l'analisi citometrica a flusso a valle della purezza e della composizione cellulare prima e dopo la separazione. Quindi, utilizzare una siringa da 1 ml dotata di un ago calibro 30 per iniettare cinque volte 10 alla quinta cellule del midollo osseo impoverite di cellule T in 100 microlitri di PVS per via endovenosa nello spazio retrobulbare del seno venoso di ogni animale ricevente irradiato.Il giorno successivo, posizionare una milza raccolta da un animale donatore su un colino a rete da 40 micrometri in un tubo di raccolta da 50 ml e utilizzare uno stantuffo per siringhe per premere il tessuto di milza attraverso il colino nel tubo. Lavare il colino e lo stantuffo con PVS per raccogliere tutti gli splenociti e pelletare le cellule mediante centrifugazione. Dopo aver dimostrato lalisi dei globuli rossi, sospendere i globuli bianchi per il conteggio e mettere da parte un'aliquota sei volte 10 alla sesta cella per l'analisi citometrica a flusso a valle.Per un isolamento totale delle cellule T CD3-positive dagli splenociti totali, utilizzare un kit di purificazione cellulare disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore e mettere da parte un'aliquota della cella a T positiva uno per 10 al sesto CD3 dalla frazione cellulare positiva per l'analisi citometrica a flusso a valle della purezza e della composizione cellulare prima e dopo la separazione. Quindi, iniettare sette volte 10 alla quinta cella T positiva al CD3 alloreattiva in 100 microlitri di PVS per via endovenosa nello spazio retrobulbar di ogni mouse ricevente per indurre GvHD. Per segnare lesioni correlate al GvHD mediante mini-endoscopia della regione colorettale distatale, sollevare la coda di un animale ricevente appena sopra la radice della coda con una mano e utilizzare l'altra mano per inserire con cura l'endoscopio nel retto attraverso l'ano.Mentre il flusso d'aria gonfia il lume colorettale, spostare lentamente e con attenzione l'endoscopio in avanti nella direzione aborale. Per evitare lesioni intestinali coloniche, mantenere l'endoscopio nella zona centrale del lume utilizzando lo schermo video in diretta per aiutare in questo posizionamento. Inizia a registrare il flusso video e segnare l'infiammazione, valutando l'infiammazione del colon correlata al GvHD segnando i parametri come illustrato.Quando è stato individuato un punto di punteggio, spostare l'endoscopio delicatamente e leggermente avanti e indietro per valutare i diversi parametri. Per valutare la traslucenza del parametro e la consistenza delle feci, posizionare l'endoscopio a una distanza più ampia in relazione alla parete colonica. Per valutare la granularità e la vascolarizzazione della lesione, posizionare l'endoscopio nelle immediate vicinanze della parete colonica e applicare attentamente la tensione ben dosata alla parete colonica con la punta dell'endoscopio.Al termine del processo di punteggio, interrompere la registrazione. Rispetto ai controlli, il trapianto di cellule staminali ematopoieiche allogeniche come dimostrato produce un'induzione riproducibilmente robusta di un fenotipo GvHD sistemico, con un progressivo aumento dei punteggi clinici di GvHD negli animali ricevente. Questi criteri mini-endoscopicamente valutabili sono stati specificamente adattati dalla colite sigeneica precedentemente riportata nel contesto dei parametri di punteggio della colite guidati dalla risposta allo per la descrizione precisa, il punteggio e la classificazione delle lesioni intestinali associate alla malattia di GvHD nel colon distale.Infatti, il sistema di classificazione mini-endoscopicamente basato consente una facile discriminazione dei topi riceventi di linfociti donatori con gravi segni di infiammazione intestinale da parte di topi di controllo che sono essenzialmente privi di GvHD. Invalidazione degli studi istopatologici del sistema di classificazione mini-endoscopicamente basati ha confermato che il colon dei topi gravemente colpito da infiammazione correlata al GvHD mostra segni istopatologici altrettanto forti di infiammazione. Al contrario, i tessuti del colon dei topi di controllo non mostrarono al massimo lievi segni istopatologici di infiammazione, in accordo con l'assenza virtuale di segni mini-endoscopicamente rilevabili di colite.Inoltre, studi di correlazione tra l'attività della colite mini-endoscopicamente e istopatologicamente valutata e i punteggi sistemici di GvHD dimostrano che i punteggi di infiammazione colon-GvHD mini-endoscopicamente determinati da punteggi inferiori o uguali a tre prevedono in modo affidabile l'assenza di punteggi di infiammazione colon-GvHD intestinali di medio-alto grado ottenuti dalla classificazione istopologica. Inoltre, la gravità del GvHD intestinale valutato endoscopicamente mostra una correlazione con l'attività sistemica della malattia GvHD. Per standardizzare i risultati della valutazione mini-endoscopica dell'infiammazione del colon e per garantire la comparabilità tra diversi topi ed esperimenti nel tempo, è necessario selezionare un sito anatomico definito per il punteggio.Oltre a segnare l'infiammazione del colon, il canale di lavoro integrato all'interno della configurazione mini-endoscopica consente il recupero di biopsie tissutali guidate dalla vista applicabili a varie analisi a valle, come l'istopatologia standard. A causa della natura non invasiva della mini-endoscopia, la colite acuta correlata al GvHD può essere ripetutamente valutata all'interno dello stesso animale praticamente in qualsiasi momento, fornendo così affascinanti intuizioni sul GvHD intestinale.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Induzione di ipofisite autoimmune sperimentale nei topi SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induzione di Graft-versus-host disease e<em&gt; In Vivo</em&gt; T monitoraggio cellulare Utilizzando un MHC-abbinato modello murino

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l&#39;induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

L&#39;induzione di una risposta infiammatoria in colture primarie epatociti di topi

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Valutazione dei citotossici e gli effetti immunomodulatori di sostanze in fette di polmone umano di taglio di precisione

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Induzione e punteggio della malattia di Graft-Versus-Host in un modello di Murine Xenogeneico e quantificazione delle cellule T umane nei tessuti del topo utilizzando pcR digitale

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Induzione dell'epatite autoimmune indotta da farmaci in topi BALB / c per lo studio dei suoi meccanismi patogenetici

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia di Graft-versus-Host

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...