Name: induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice
Uploaded: 2019-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

本研究は、共同研究センター (CRC) 221 (CRC/TR221 (dfg)、#324392634; プロジェクト B03) (コンゴ) や CRC 1181 (CRC (dfg)、プロジェクト B05) (コンゴ) に支えられた、ドイツ研究振興協会 (DFG、ドイツ研究振興協会) によって資金を供給される両方。

ここで説明する実験方法は、Mittelfranken, ババリア, ドイツの政府によって承認されています。
1. GvHD 誘導
<ol><li>0 日目: 受信者のマウス全身照射
	<ol>
<li>女性 CD45.2+ H2kd を使用して+ BALB/c マウス 10 週間、少なくとも受信者として古い。</li>
		<li>計量し、GvHD 誘導前に受信者のマウスの体重を記録します。 注:受信者が最小の本体?...

<ol>
	<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+pathogenesis+of+graft-versus-host+disease.">Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease.</a> British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).</li><li>Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+GvHD:+pathogenesis+and+classification.">Acute GvHD: pathogenesis and classification.</a> Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).</li><li>Naymagon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+graft-versus-host+disease+of+the+gut:+considerations+for+the+gastroenterologist.">Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14, 711-726 (2017).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation.</a> Blood. 127, 3117-3126 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Anthony, B. A., Hadley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+graft-versus-host+disease+and+in+vivo+T+cell+monitoring+using+an+MHC-matched+murine+model.">Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).</li><li>Beilhack, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+acute+graft-versus-host+disease+by+blocking+T-cell+entry+to+secondary+lymphoid+organs.">Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs.</a> Blood. 111, 2919-2928 (2008).</li><li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+colonoscopy+in+live+mice.">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).</li><li>Buchele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Inflammatory+T+Helper+Cells+via+Retinoic+Acid-Related+Orphan+Receptor+Gamma+t+Is+Ineffective+to+Prevent+Allo-Response-Driven+Colitis.">Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).</li><li>Ullrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BATF-dependent+IL-7RhiGM-CSF++T+cells+control+intestinal+graft-versus-host+disease.">BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).</li><li>Kaplan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+antigens+determine+graft-versus-host+disease+phenotype.">Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype.</a> Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).</li></ol>

プロトコルでは、誘導の方法論と腸管 GvHD 間観測された大腸の表現型のミニ内視鏡評価について説明します。科学者 (すなわちから大腸の症状と最大の疾患活動性までの進行の発症) 全体の病気にわたって縦方向と非侵襲的腸管 GvHD を調査するを有効にするのより広い目的を提供しています。
ただし、本質がありますいくつかの重要なステップと重要な制限事項提示の方?...

直接造血幹細胞コンパートメントからと制御不能を生じた造血器腫瘍、急速に進んでいると重篤な免疫介在性疾患は、しばしば兆候同種 HCT1,2を実行します。しかし、予後の有益な移植片対腫瘍反応の発生の会計処理がドナーのリンパ球がよく誘発・助長する同種 HCT 受信者内の健康な組織のコンポーネントの不要な免疫介在性攻撃、移植片対宿主病3を呼び出されるプロセス。腸、いわゆる腸管 GvHD の症状は、急性 GvHD、重度のフォームは、関連付けられ、高い死亡率1,2,4の最も恐ろしい合併症を表しています。
同種 HCT の全体的なマウスのモデルは、識別や GvHD5病態免疫メカニズムを調査する貴重なツールとして浮上しています。ただし、運動評価の例えば、生きたマウスに時間をかけて新規治療の有益な効果は日常的に基づいて臨床 GvHD によるスコア6。これらのスコアが反映するように適切な例えば、全体的な疾病負担 (すなわち、全身の GvHD) 臨床スコア不足臓器特異症状を確実にミラーへの感受性 (例,腸内で)。したがって、結論は、スコアリング システム通常これらに基づく特定の治療的介入の腸保護効果に関して、例えば短い落ちる。
新規全身の発明によって主要な進歩にもかかわらず画像診断法、発光や蛍光遺伝子マウス モデル7,8の使用法との組み合わせで直接、具体的は方法論腸内を評価する生きているマウスで GvHD の症状が欠けています。したがって、次のセクションで説明されている腸管 GvHD 表現型の内視鏡的評価のプロトコルの後ろの理論的根拠は、この障害を克服するためにです。さらに、モチベーションは以来、これまでのところ、細胞、形態学的、および分子特性の詳細な評価実験マウスの数を減らすにも (例えば,病理組織学的、分子生物学) 腸管 gvhd症状は、実験マウスの犠牲を最終的に必要があります。
当院は大腸の症状同系大腸炎モデル9間のミニ内視鏡的評価の方法論上以前報告しています。ここで提示されたプロトコル、洗練され、内視鏡を適応して私は完全に設定を一致しない alloresponse 駆動 alloreactive の移植時に腸管 GvHD と生きたマウス大腸炎 MHC クラスで HCT およびドナーのリンパ球のためのスコアリング マトリックス.腸管 GvHD 関連大腸病変を反映するように適した 4 つのパラメーターを同定しました。さらに、我々 は容易に腸管 GvHD 時点時点で与えられたマウスでの重症度について読者に知らせる新しいスコアの結果により、任意の 1 つの決定要因の微調整グレーディング システムを設立しました。病理組織学的分析は、特定のしきい値以上の内視鏡スコアは中程度の高級組織の炎症を予測して確実に確認しました。したがって、ミニ内視鏡的評価は、日常的に実験的マウスの犠牲を必要とする金本位制の病理組織学的に動作している代替を示す表示されます。重要なは、このプロトコルは、実質的に任意の特定の時点に適用できるし、病気10,11のコースの間に繰り返し使用できます。さらに、発光依存アプローチの使用と対照をなして交配遺伝子改変マウスのような激しい労働や時間がかかる対策も不要と、あらゆるマウスの線上の方法論を適用できるそれ故に、関心します。
まとめると、重症の消化管 GvHD 同種 HCT 患者の有害な臨床的視点を与えて急速な科学の進歩と免疫病態分子メカニズムに洞察力が急務します。同様に、重要な倫理的な考慮事項を要求する知識のゲインが実験的マウスの最小限の使用と達成されるべき。したがって、両方の実験的な作品チェーンを監視し、ライブの実験的マウス腸管 GvHD をグレードでコロンのシリアル ミニ内視鏡評価を実装して腸管 GvHD を探索研究コミュニティの要求を進めることができる認識モデルとして説明し、ここで提示されたプロトコルで検証。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1249px;" width="1249">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator</td>
			<td style="width:216px;">Gamma-Service Meical GmbH</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:479px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Phosphate-buffered saline (PBS )</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>D8662-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>R8758-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Hypodermic needle (26G)</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">1 mL syring</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:152px;">9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">50 mL tube</td>
			<td style="width:216px;">Sarstedt Ag &#38; Co.KG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Cell strainer with a 40 &#181;m mesh screen</td>
			<td style="width:216px;">BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td style="width:152px;">11209</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">8043.2</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td style="width:152px;">1,048,540,500</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pan T Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-095-130</td>
			<td>magnet cell separation to isolate splenic T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>109822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>110730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Filtrated bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Pan Biotec</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>ingredient of FACS buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well polystyrene V-bottom plates</td>
			<td style="width:216px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">651201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:152px;">352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSRFortessa II flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Insulin syringe with sterile interior (30G)</td>
			<td style="width:216px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:152px;">324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Oxy Vet Oxymat 3</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>oxygen concentrator&#160; for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">NarkoVet&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">213062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Plexiglass chamber&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">214620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Straight Forward Telescope</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>64301 AA</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protection and Examination Sheath</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 C</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Examination Sheath with working channel</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 D</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Biopsy Forceps</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">61071 ZJ&#160;</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;175 Watt SCB XenonLight Source</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">20132120</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber Optic Light Cable</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">495 NL</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 S3 Camera Head</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22220030</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 SCB Camera Control Unit</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22200020</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">LCD monitor</td>
			<td style="width:216px;">Olympus</td>
			<td>OEV181H</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forane / Isofluran</td>
			<td>AbbVie Inc.&#160;</td>
			<td>B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution 37 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">7398.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5,0 mL Dispenser tip&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eppendorf AG</td>
			<td align="right">30089456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice

急性移植片対宿主病 (GvHD) は最も重篤な合併症が患者以前同種造血幹細胞移植 (同種 HCT) 顔を表します、頻繁に悪い臨床結果と関連付けられる。しばらくの間、例えば、皮膚 GvHD 症状は通常確立された免疫抑制療法に反応と致命的なコース、存在および腸の半ば-に-低部分の特に、腸管 GvHD の強度、したがってを取っていません。結果に強く影響、全体的な急性 GvHD。 治療選択肢を患者の生存率は中等度疾患を緩和する効果のみをもたらす古典的な免疫抑制剤に本質的に限られています。したがって、腸内細菌叢の変化組織住民免疫カスケードについての詳細な知識とイベントの基になるメカニズムを理解する前、及び腸管 GvHD 発症後に、間質反応が急務、病因と革新的な治療方法を開発します。GvHD のマウスモデルが頻繁に識別し、分子および推定腸管 GvHD を運転経路を機能的評価に採用します。評価し、グレードの急性 GvHD に確立されたスコアは日常的にむしろ全身 GvHD を反映するさまざまなパラメーターで構成されていますので具体的に監視し、時間をかけて腸内の炎症を評価する手段はない本質的に症状です。消化管 GvHD の詳細な評価は、それによって本質的に縦を除く、安楽死のマウスを用いた研究に制限されている (すなわち、キネティック) 与えられた実験条件下で結腸のコンパートメントの分析 (例えば、抗体炎症性サイトカインの封鎖) (すなわち、生体内) 生きているマウスで。ここで説明した同種 HCT 投与マウスの遠位結腸のミニ内視鏡その場で評価できます) 腸の炎症や b) 下流解析のための組織サンプルを収集するオプションのさまざまな側面の詳細な巨視的評価観察期間のコースを介して様々 な時間ポイント。全体的に、ミニ-内視鏡的アプローチは、臨床非侵襲的モニタリングおよび腸管 GvHD の影響評価の主要な進歩を提供します。

ミニ内視鏡遠位結腸の腸管 GvHD 関連病変評価を記述する、現在のプロトコルの確立し、以前深刻な急性 GvHD モデルの全身誘導を受けるマウスで検証されています。この研究で使用して私は完全に一致しない BALB/c マウスが致死的照射、続いて T 細胞除去同種骨髄移植と GvHD を誘発する alloreactive C57BL/6 CD3の投与によるモデル システム MHC クラス +T リンパ球。T ?...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

腸管移植片対宿主病と生きたマウスのミニ内視鏡評価の誘導

ここでは、同種造血幹細胞移植を説明し遠位結腸の反復的なミニ内視鏡評価、存在、特性、およびライブ内で大腸の炎症の重症度をその場でプロトコルを提案します。マウス腸管移植片対宿主病に苦しんでいます。

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

生きたマウスにおける結腸のミニ内視鏡的評価は、同種の造血幹細胞移植時に急性グラフ対宿主病GvHDの腸管症状を調査するための重要な実験的支援を提供する。急性GvHD関連大腸炎の非侵襲的評価は、金標準組織病理学の働く代替として機能し、それによって繰り返し動物の犠牲をレンダリングして不必要な組織標本を得ることができる。手順を実証すると、私の研究室のポストドクターであるベラ・ブッチェレです。受け手BALB/cマウスの全身照射の翌日、CD-45.1ライブ5B6 SJLドナーマウスを清潔な働く鞘の上の起こりやすい位置に置き、1つの13cmの湾曲した鋸歯状の先端を使用して1つのアキレス腱で毛皮を持ち上げます。硬化した8.5cmの細かいはさみをストレートチップで使用し、鉗子と1つのかかとの間の皮膚を切開し、切開を角質的に伸ばし、後肢からの皮膚および毛皮の除去を容易にする。後肢から皮膚を取り除いた場合は、各股関節、足首、膝関節を切り取ります。すべての後肢の太ももとシャンクを氷の上にPVSで満たされた単一の92mmペトリ皿に保管し、各骨からできるだけ多くの筋肉を慎重に取り除き、洗浄された大腿骨と脛骨を湿った氷の上の無菌RPMI 1640培地の50mLチューブに移します。骨髄を分離するには、新鮮なRPMI 1640培地で満たされた新しい92-mLペトリ皿に一度に1つの骨を移し、メスを使用して各骨の端を切断します。次に、26ゲージの針を装備した1mLシリンジを使用して、1mLの新鮮な培地で骨を一度に5mLの培地を含む50mLの回収チューブに洗い流します。すべての骨が洗い流されたら、崩れた骨髄片を数回上下にそっとピペットして単一細胞懸濁液を生成し、40マイクロメートルのメッシュスクリーンセルストレーナーを通して新しい50mLコレクションチューブに濾過します。ペレットは、遠心分離により細胞を5 mLの塩化アンモニウムカリウムライシスバッファーに再懸濁し、室温で3分間のインキュベーションを行った。インキュベーションの終わりに、PVSの10mLで反応を停止し、再度遠心分離した細胞を。ペレットをカウント用の新鮮なPVSの2mLに再懸濁し、下流のフローサイトメトリック分析のために6倍の10を6倍の6倍の6番目のセルアリコートに置いた。次に、市販の細胞精製キットを使用して、骨髄単細胞懸濁液からCD90.2陽性T細胞を磁気的に枯渇させ、分離前後および分離後の下流流細胞量分析のためにT細胞枯渇溶出液の6番目の細胞アリコートに1回10回を確保した。次に、30ゲージの針を備えた1mLシリンジを使用して、100マイクロリットルのPVSで5倍のT細胞枯渇骨髄細胞を静脈内に5倍10回注入し、各照射されたレシピエント動物の静脈のレトロブルバー空間に静脈内に注入する。翌日、ドナー動物から採取した脾臓を50mLのコレクションチューブの40マイクロメートルメッシュストレーナーに置き、注射器プランジャーを使用してストレーナーを通して脾臓組織をチューブに押し込みます。PVSでストレーナーとプランジャーを洗浄し、すべての脾細胞を収集し、遠心分離によって細胞をペレットにします。赤血球のリシスが実証された後、カウントのために白血球を再中断し、下流の細胞測定分析のために6回10を6回60回60回6番目の細胞アリコートに置いた。全細胞細胞からCD3陽性T細胞を全分分離する場合は、製造者の指示に従って市販の細胞精製キットを使用し、細胞の純度および分離後の細胞量測定前後の下流フローサイトメトリック分析のために、陽性細胞分から6番目のCD3陽性T細胞アリコートから10回10回を確保した。次いで、PVSの100マイクロリットルの5回目のアロ反応性CD3陽性T細胞を静脈内に7回10回注入し、各レシピエントマウスのレトロブルバー空間に静脈内にGvHDを誘導する。遠位大腸部のミニ内視鏡検査によりGvHD関連病変をスコア化するには、片方の手で尾根のすぐ上にあるレシピエント動物の尾を持ち上げ、もう一方の手で肛門を介して内視鏡を直腸に慎重に挿入する。気流が大腸腔を膨らませる間、ゆっくりと慎重に内視鏡を腹腔方向に前方に動かします。大腸腸損傷を避けるために、この位置を助けるためにライブビデオスクリーンを使用して、内腔の中央部に内視鏡を保ちます。ビデオストリームを記録し、炎症をスコア付け開始し、図示したようにパラメータを採点することによって結腸のGvHD関連の炎症を評価する。スコアリングスポットが見つかったら、内視鏡を穏やかに、わずかに前後に動かして、異なるパラメータを評価します。パラメーターの半透明性と便の一貫性を評価するには、大腸壁に関連して広い距離に内視鏡を配置します。病変の粒度および血管を評価するために、内視鏡を大腸壁に近い位置に置き、内視鏡の先端を有する大腸壁に十分に加量の張力を慎重に適用する。スコアリングプロセスが完了したら、記録を停止します。対照と比較して、実証された同種造形幹細胞移植は、レシピエント動物における臨床GvHDスコアを徐々に増加させる全身GvHD表現型の再現的に堅牢な誘導を生み出す。これらのミニ内視鏡的評価可能な基準は、遠位結腸における腸GvHD疾患関連病変の正確な説明、スコアリング、およびグレーディングのためのアロ応答駆動性大腸炎スコアリングパラメータのコンテキストで、以前に報告された同質性大腸炎から特異的に適応された。実際、ミニエンドスコスベースの採点システムは、GvHDを本質的に欠いているコントロールマウスから腸炎症の重篤な徴候を有するドナーリンパ球受け取りマウスの容易な差別を可能にする。対照対照マウスの大腸組織は、多くの場合、軽度の組織病理学的炎症徴候に対して、小エンドスコピカルに検出可能な大腸炎の仮想欠如と一致して示さなかった。さらに、小エンドスコス的に評価された大腸炎活性と全身GvHDスコアとの間の相関研究は、ミニ内視鏡的に3つ以下のいくつかのスコアを確実に決定し、組織病理学的グレーディングから得られた中級から高等級の腸GvHD関連大腸炎症スコアの欠如を確実に予測することを示している。また、内視鏡的に評価された腸GvHDの重症度は、全身GvHD疾患活性との相関を示す。大腸炎症のミニ内視鏡評価の結果を標準化し、時間の経過とともに異なるマウスおよび実験間で比較可能性を確保するために、定義された解剖学的部位をスコアリング用に選択する必要があります。大腸炎症のスコアリングに加えて、ミニ内視鏡的セットアップ内の組み込みの作業チャネルは、標準的な組織病理学などの様々な下流解析に適用可能なビュー誘導組織生検の検索を可能にする。ミニ内視鏡検査の非侵襲的な性質のために、急性GvHD関連大腸炎は、事実上いつでも同じ動物内で繰り返し評価することができ、それによって腸GvHDに魅力的な洞察をもたらす。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

SJLマウスにおける実験的自己免疫性下垂体炎の誘導

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

細胞毒性の評価と肺癌精密カット スライスで物質の免疫調節効果

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

デジタルPCRを用いたマウス組織における異種マウスモデルにおける移植片対宿主病の誘導とスコア付け

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

BALB/cマウスにおける薬物誘発性自己免疫性肝炎の誘導による発症機序の研究

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

移植片対宿主病における樹状細胞の役割を調べる骨髄移植プラットフォーム

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...