Name: induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice
Uploaded: 2019-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

Denne studien ble støttet av samarbeidende forskning sentre (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634, prosjektet B03) (å grunnlegge Vennskapelighetsstiftelsen) og CRC 1181 (CRC-DFG, prosjektet B05) (å grunnlegge Vennskapelighetsstiftelsen), begge finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tysk Research Foundation).

Eksperimentell metodene som er beskrevet her er godkjent av myndighetene i Mittelfranken, Bayern, Tyskland.
1. GvHD induksjon
<ol><li>Dag 0: Hele kroppen bestråling av mottakeren mus
	<ol>
<li>Bruke kvinnelige CD45.2+ H2kd+ BALB/c mus som er minst 10 uker gammel som mottakere.</li>
		<li>Veie og ta vekten av mottakeren musene før GvHD induksjon. Merk: Kontroller at mottakeren har en minimal kroppsvekt 20 g. Start kroppsvekten vil t...

<ol>
	<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+pathogenesis+of+graft-versus-host+disease.">Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease.</a> British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).</li><li>Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+GvHD:+pathogenesis+and+classification.">Acute GvHD: pathogenesis and classification.</a> Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).</li><li>Naymagon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+graft-versus-host+disease+of+the+gut:+considerations+for+the+gastroenterologist.">Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14, 711-726 (2017).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation.</a> Blood. 127, 3117-3126 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Anthony, B. A., Hadley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+graft-versus-host+disease+and+in+vivo+T+cell+monitoring+using+an+MHC-matched+murine+model.">Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).</li><li>Beilhack, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+acute+graft-versus-host+disease+by+blocking+T-cell+entry+to+secondary+lymphoid+organs.">Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs.</a> Blood. 111, 2919-2928 (2008).</li><li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+colonoscopy+in+live+mice.">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).</li><li>Buchele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Inflammatory+T+Helper+Cells+via+Retinoic+Acid-Related+Orphan+Receptor+Gamma+t+Is+Ineffective+to+Prevent+Allo-Response-Driven+Colitis.">Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).</li><li>Ullrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BATF-dependent+IL-7RhiGM-CSF++T+cells+control+intestinal+graft-versus-host+disease.">BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).</li><li>Kaplan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+antigens+determine+graft-versus-host+disease+phenotype.">Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype.</a> Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).</li></ol>

Protokollen beskriver metoder for induksjon og mini-endoskopisk vurdering av colonic fenotypen observert i løpet av intestinal GvHD. Det serverer bredere hensikten slik at forskerne kan studere intestinal GvHD langs- og noninvasively gjennom hele sykdom (dvs. fra utbruddet av colonic manifestasjon og progresjon til maksimal sykdomsaktivitet).
Det er imidlertid noen viktige trinn og viktige begrensninger iboende til presentert metodikkene eksperimentator må være klar over før du installerer...

Blodkreft malignitet direkte som oppstår fra blodkreft stamcelletransplantasjon rommet og ukontrollert, er raskt utvikler seg, og alvorlige immun-mediert lidelser ofte indikasjoner for å utføre allo-HCT1,2. Selv regnskap for forekomsten av prognostiske gunstig graft-versus-tumor respons, er donor lymfocytter imidlertid ofte inducing og fremme et uønsket immun-mediert angrep sunt vev komponenter i Tillat-HCT mottakeren , en prosess som kalles graft - versus - host sykdom3. Manifestasjoner i tarmen, den såkalte intestinal GvHD, representerer den mest fryktede komplikasjonen av akutt GvHD, alvorlige former som er rutinemessig forbundet med en høy dødelighet1,2,4.
Samlet, murine modeller av allo-HCT har dukket opp som uvurderlig verktøy for å identifisere og studere immun-mediert mekanismene bak patogenesen av GvHD5. Men kinetic vurdering av, for eksempel gunstige effekter av romanen terapeutisk intervensjon over tid i levende mus er rutinemessig basert på fastsettelse av klinisk GvHD score6. Mens disse resultatene er egnet til å reflektere, for eksempel generelle sykdom byrden (dvs. systemisk GvHD), klinisk score mangel følsomheten til pålitelig speile organ-spesifikke manifestasjoner (f.eks, i tarmen). Derfor bommer konklusjoner, for eksempel med hensyn til gut-beskyttende effekten av en gitt terapeutisk intervensjon, som er basert på disse scoring systemer vanligvis.
Til tross for store fremskritt gjennom oppfinnelsen av romanen hele kroppen imaging modaliteter i kombinasjon med bruk av enten bioluminescent eller fluorescerende genetisk musen modeller7,8, metoder til direkte og spesielt vurdere den intestinal manifestasjon av GvHD i levende mus mangler. Derfor er begrunnelsen bak protokollen for endoskopisk vurdering av intestinal GvHD fenotypen beskrevet i neste del å overvinne denne hindringen. Videre motivasjon er også redusere eksperimentelle mus numbers siden, så langt, en detaljert vurdering av mobilnettet morfologiske og molekylære egenskaper (f.eks, av histopatologi eller molekylærbiologi) av intestinal GvHD manifestasjon slutt kreves ofringen av eksperimentelle musen.
Våre institusjon har tidligere rapportert på metoder for en mini-endoskopisk vurdering av colonic manifestasjoner i syngeneic kolitt modeller9. I protokollen presenteres her, vi har raffinert og tilpasset den colonoscopic scoret matrise for alloresponse-drevet kolitt i levende mus med intestinal GvHD på transplantasjon av alloreactive HCT og donor lymfocytter i en MHC, klasse jeg fullt feil innstilling . Vi identifisert fire parameterne egnet gjenspeiler tarm GvHD-relaterte colonic lesjoner. Videre etablerte vi en system det innrømmer en finjustert gradering av enhver enkelt determinant, noe som resulterer i en ny poengsum som lett informerer leseren om alvorlighetsgraden av intestinal GvHD i en gitt mus på et gitt tidspunkt. Histopathological analyser bekreftet at en endoskopisk score over en bestemt dørterskel er pålitelig forutsi moderat til høy klasse vev betennelse. Derfor synes mini-endoskopisk evaluering å representere arbeider erstatning for gullstandarden histopatologi som rutinemessig krever ofringen av eksperimentelle musene. Viktigst, denne protokollen kan brukes til nesten enhver tid og kan brukes flere ganger i løpet av sykdommen10,11. Videre, i motsetning til bruk av bioluminescens-avhengige, ingen arbeid-intens og tidkrevende tiltak som intercrossing genetisk endret mus er nødvendig, og derfor metodikken kan brukes på nesten alle mus-linje interesse.
Til sammen har gitt skadelig klinisk perspektiv allo-HCT pasienter med alvorlig intestinal GvHD, er rask vitenskapelig fremgang og mer innsikt i molekylære mekanismer bak immun patogenesen sterkt behov. Tilsvarende krever viktig, etiske betraktninger at gevinsten av kunnskap skal oppnås med bruk av minimal antall eksperimentelle mus. Derfor anerkjent både krav på forskningen fellesskapet å utforske intestinal GvHD kan være avansert ved å implementere serielle mini-endoskopisk evalueringer av kolon i eksperimentelt arbeid kjeden å overvåke og Vurder intestinal GvHD i live eksperimentelle mus modeller, som beskrevet og validert i protokollen presenteres her.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1249px;" width="1249">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator</td>
			<td style="width:216px;">Gamma-Service Meical GmbH</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:479px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Phosphate-buffered saline (PBS )</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>D8662-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>R8758-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Hypodermic needle (26G)</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">1 mL syring</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:152px;">9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">50 mL tube</td>
			<td style="width:216px;">Sarstedt Ag &#38; Co.KG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Cell strainer with a 40 &#181;m mesh screen</td>
			<td style="width:216px;">BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td style="width:152px;">11209</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">8043.2</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td style="width:152px;">1,048,540,500</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pan T Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-095-130</td>
			<td>magnet cell separation to isolate splenic T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>109822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>110730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Filtrated bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Pan Biotec</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>ingredient of FACS buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well polystyrene V-bottom plates</td>
			<td style="width:216px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">651201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:152px;">352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSRFortessa II flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Insulin syringe with sterile interior (30G)</td>
			<td style="width:216px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:152px;">324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Oxy Vet Oxymat 3</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>oxygen concentrator&#160; for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">NarkoVet&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">213062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Plexiglass chamber&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">214620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Straight Forward Telescope</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>64301 AA</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protection and Examination Sheath</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 C</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Examination Sheath with working channel</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 D</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Biopsy Forceps</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">61071 ZJ&#160;</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;175 Watt SCB XenonLight Source</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">20132120</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber Optic Light Cable</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">495 NL</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 S3 Camera Head</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22220030</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 SCB Camera Control Unit</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22200020</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">LCD monitor</td>
			<td style="width:216px;">Olympus</td>
			<td>OEV181H</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forane / Isofluran</td>
			<td>AbbVie Inc.&#160;</td>
			<td>B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution 37 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">7398.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5,0 mL Dispenser tip&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eppendorf AG</td>
			<td align="right">30089456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice

Akutt graft - versus - host sykdom (GvHD) representerer de mest alvorlige komplikasjon at pasienter som gjennomgår tidligere allogene blodkreft stilk cellen transplantasjon (allo-HCT) ansikt og er ofte assosiert med en dårlig kliniske utfall. Stund, for eksempel GvHD manifestasjoner av huden er vanligvis lydhør overfor etablerte immun-undertrykkende terapier og er derfor ikke tar en dødelig kurs, tilstedeværelse og intensiteten av intestinal GvHD, spesielt av midt-til-nedre deler av tarmen, påvirke sterkt utfallet total overlevelse av pasienter med akutt GvHD. behandlingsalternativer er i hovedsak begrenset til klassiske immun-undertrykkende agenter gir bare moderat sykdom-begrensende effekter. Derfor detaljert kunnskap om vev-resident immun cascade, endringer i tarmen bakterieflora og stromal svaret før, på, og etter intestinal GvHD utbruddet er presserende nødvendig å forstå hendelser og mekanismene bak sin patogenesen og å utvikle nyskapende behandlingsalternativer. Murine modeller av GvHD brukes ofte til å identifisere og funksjonelt vurdere molekyler og trasé åpenbart kjører intestinal GvHD. Men er betyr å spesielt overvåke og evaluere intestinale betennelsen over tid egentlig mangler siden etablerte score å vurdere og Vurder akutt GvHD rutinemessig består av ulike parametere som heller gjenspeile systemisk GvHD manifestasjoner. Detaljert evaluering av intestinal GvHD er begrenset til studier med euthanized mus, og dermed egentlig unntatt langsgående (dvs. kinetic) analyser av colonic kupé under en gitt eksperimentelle tilstand (f.eks antistoff-mediert blokade av en proinflammatory cytokin) i levende mus (dvs. i vivo). Mini-endoskopisk i situ vurdering av distale kolon allo HCT-behandlet mus beskrevet her kan a) en detaljert makroskopisk evaluering av ulike aspekter av intestinal betennelser og b) muligheten til å samle vevsprøver for nedstrøms analyser på ulike tidspunkt i løpet av perioden som observasjon. Total, mini-endoskopisk tilnærmingen gir et stort fremskritt i preklinisk noninvasive kartlegging og vurdering av intestinal GvHD.

Gjeldende protokollen, beskriver mini-endoskopisk evalueringen av intestinal GvHD-assosiert lesjoner i distale kolon, er opprettet og godkjent i mus tidligere utsatt for systemisk induksjon av en alvorlig akutt GvHD modell. I denne studien vi brukte en MHC, klasse jeg fullt Feilkoblede modellsystem i som BALB/c mus var drepende bestrålt, etterfulgt av transplantasjon av T-celle-utarmet allogene benmargen og av administrasjonen av GvHD-inducing alloreactive C57BL/6 CD3+ T-lymfo...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Induksjon av Intestinal Graft - versus - host sykdom og sin Mini-endoskopisk vurdering i levende mus

Her presenterer vi en protokoll som beskriver allogene blodkreft stilk cellen transplantasjon, og lar repeterende mini-endoskopisk evalueringer av distale kolon i stedet for tilstedeværelse, egenskaper og alvorlighetsgraden av colonic betennelser i live mus lider av intestinal graft - versus - host sykdom.

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Mini-endoskopisk evaluering av tykktarmen i levende mus gir viktig eksperimentell støtte for å undersøke tarmmanife manifestasjoner av akutt graf-versus-vertssykdom, GvHD, ved allogen, hematopoetisk stamcelletransplantasjon. Den ikke-invasive vurderingen av akutt GvHD-relatert kolitt kan fungere som en fungerende erstatning for gullstandard histopatologi, og dermed gjøre gjentatte dyreofre for å få vevsprøver unødvendige. Å demonstrere prosedyren vil være Vera Buchele, en post-doc fra laboratoriet mitt.En dag etter total kroppsbestråling av mottakeren BALB / c mus, plasser en CD-45.1 live 5B6 SJL donor mus i utsatt posisjon på en ren arbeidshylse, og bruk en 13 cm buet og taggete tupp av en simkin tang for å løfte pelsen på en akilleshæl. Ved hjelp av herdet 8,5 cm fin saks med rette spisser, øk huden mellom tang og en hæl, forlenge snittet kranielt for å lette fjerning av hud og pels fra baklemmer. Når huden er fjernet fra baklemmer, kutt gjennom hver hofte, ankel og kneledd.Oppbevar låret og skaftet på hvert bakben i en enkelt 92 mm petriskål fylt med PVS på is og fjern forsiktig så mye muskler som mulig fra hvert bein, og overfør hver renset lårben og tibia til et 50 ml rør med steril RPMI 1640 medium på våt is. For å isolere benmargen, overfør ett bein om gangen til en ny 92 ml petriskål fylt med friskt RPMI 1640-medium, og bruk en skalpell til å kutte endene av hvert bein. Deretter bruker du en 1 ml sprøyte utstyrt med en 26-gauge nål for å skylle beinene med 1 ml friskt medium om gangen inn i et 50 ml oppsamlingsrør som inneholder 5 ml medium.Når alle beinene er spylt, pipette forsiktig de smuldrete benmargsbitene opp og ned flere ganger for å generere en encellede suspensjon før du filtrerer cellene gjennom en 40-mikrometer mesh-skjerm celle sil inn i en ny 50-ml oppsamlingsrør. Pellet cellene ved sentrifugering og re-suspendere cellene i 5 ml ammoniumklorid kalium lysis buffer for en tre minutters inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, stopp reaksjonen med 10 ml PVS, og sentrifuger cellene igjen.Re-suspendere pellet i 2 ml av ferske PVS for telling, og sette av en seks ganger 10 til sjette celle aliquot for nedstrøms flyt cytometrisk analyse. Deretter bruker du et kommersielt tilgjengelig cellerensesett for å magnetisk tømme CD90.2-positive T-celler fra benmargens encellede suspensjon, i henhold til produsentens instruksjoner, og sett til side en gang 10 til sjette celle aliquot av T-celle-utarmet eluate for nedstrøms flyt cytometrisk analyse av celle renhet og sammensetning før og etter separasjon. Deretter bruker du en 1 ml sprøyte utstyrt med en 30-gauge nål for å injisere fem ganger 10 til den femte T-celle-utarmet benmargsceller i 100 mikroliter PVS intravenøst inn i retrobulbarrommet til den venøse sinus av hvert bestrålte mottakerdyr.Neste dag, plasser en milt høstet fra et donordyr på en 40-mikrometer mesh sil i en 50-ml oppsamlingsrør, og bruk en sprøyte stempel for å presse miltvevet gjennom silen inn i røret. Vask silen og stempelet med PVS for å samle alle miltytter, og pellet cellene ved sentrifugering. Etter røde blodlegemer lysis er demonstrert, re-suspendere de hvite blodlegemer for telling, og sette av en seks ganger 10 til sjette celle aliquot for nedstrøms flyt cytometrisk analyse.For en total CD3-positiv T-celleisolasjon fra totale miltytter, bruk et kommersielt tilgjengelig cellerensingssett i henhold til produsentens instruksjoner, og sett til side en gang 10 til den sjette CD3-positive T-celle aliquot fra den positive cellefraksjonen for nedstrøms strømningscytometrisk analyse av cellerenshet og sammensetning før og etter separasjon. Deretter injiserer du syv ganger 10 til den femte alloreaktive CD3-positive T-cellene i 100 mikroliter PVS intravenøst inn i retrobulbarrommet til hver mottakermus for å indusere GvHD. For å score GvHD-relaterte lesjoner ved mini-endoskopi av det distale kolorektale området, løft halen til et mottakerdyr like over haleroten med den ene hånden, og bruk den andre hånden til å sette endoskopet forsiktig inn i endetarmen via anus.Mens luftstrømmen blåser opp kolorektal lumen, sakte og forsiktig flytte endoskopet fremover i aboral retning. For å unngå kolon tarmskader, hold endoskopet i det midterste området av lumen ved hjelp av live videoskjermen for å hjelpe til med denne posisjoneringen. Begynn å ta opp videostrømmen og score betennelsen, evaluere GvHD-relatert betennelse i tykktarmen ved å score parametrene som illustrert.Når et poengpunkt er plassert, flytter du endoskopet forsiktig og litt frem og tilbake for å vurdere de ulike parametrene. For å vurdere parametertranslucency og avføring konsistens, plassere endoskopet på en bredere avstand i forhold til den kolonveggen. For å vurdere detaljnivået og vaskulæriteten til lesjonen, plasser endoskopet i nærheten av kolonveggen, og bruk forsiktig godt dosed spenning på kolonveggen med spissen av endoskopet.Når du er ferdig med poengberegningsprosessen, stopper du opptaket. Sammenlignet med kontroller, allogen hematopoeisk stamcelletransplantasjon som demonstrert produserer en reproduserbar robust induksjon av en systemisk GvHD fenotype, med gradvis økende klinisk GvHD score hos mottaker dyr. Disse mini-endoskopisk vurderelige kriteriene ble spesielt tilpasset fra tidligere rapportert syngeneisk kolitt i sammenheng med allo-responsdrevne kolittscoringsparametere for nøyaktig beskrivelse, scoring og gradering av intestinale GvHD-sykdomsrelaterte lesjoner i det distale tykktarmen.Faktisk muliggjør det mini-endoskopisk baserte graderingssystemet en enkel diskriminering av donor-lymfocytt-mottakende mus med alvorlige tegn på tarmbetennelse fra kontrollmus som i hovedsak er blottet for GvHD. Ugyldiggjøring av det mini-endoskopisk baserte graderingssystemet histopatologiske studier bekreftet at tykktarmen av mus som er sterkt påvirket av GvHD-relatert betennelse, viser tilsvarende sterke histopatologiske tegn på betennelse. I motsetning viste kolonvev av kontrollmus nei til, på det meste, milde histopatologiske tegn på betennelse, i samsvar med det virtuelle fraværet av mini-endoskopisk påvisbare tegn på kolitt.Videre viser korrelasjonsstudier mellom mini-endoskopisk og histopatologisk vurdert kolittaktivitet og systemiske GvHD-skår at mini-endoskopisk bestemt noen score på mindre enn eller lik tre pålitelig forutsi fraværet av mid-til høyere-grade intestinal GvHD-assosiertkolonisk betennelse score hentet fra histopatologisk gradering. I tillegg viser alvorlighetsgraden av den endoskopisk vurderte intestinale GvHD en sammenheng med systemisk GvHD-sykdomsaktivitet. For å standardisere resultatene av mini-endoskopisk evaluering av kolonbetennelse og for å sikre sammenlignbarhet på tvers av forskjellige mus og eksperimenter over tid, bør et definert anatomisk nettsted velges for scoring.I tillegg til å scorekolonisk betennelse, tillater den innebygde arbeidskanalen i mini-endoskopisk oppsett henting av visningsstyrte vevsbiopsier som gjelder for ulike nedstrøms analyser, for eksempel standard histopatologi. På grunn av mini-endoskopiens ikke-invasive natur kan akutt GvHD-relatert kolitt vurderes gjentatte ganger i samme dyr til nesten når som helst, og dermed gi fascinerende innsikt i intestinal GvHD.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induksjon av transplantat-mot-vert-sykdom og<em&gt; In Vivo</em&gt; T Cell overvåking ved hjelp av en MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induksjon av murine tarmbetennelse etter adoptiv overføring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høy</sup&gt; T-celler i immundefekte mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induksjon av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt hos mus og evaluering av sykdom avhengige Fordeling av immunceller i ulike vev

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

En ikke-invasiv og Teknisk Non-intensiv metode for induksjon og fenotyping of Experimental bakteriell lungebetennelse hos mus

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

Induksjon av en betennelsesreaksjon i Primær hepatocytter kulturer fra Mus

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Vurdering av den cytotoksiske og immunmodulerende effekter av stoffer i menneskelig presisjonsstyrte kutte lunge skiver

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Induksjon og scoring av pode-versus-host sykdom i en Xenogeneic murine modell og kvantifisering av menneskelige T celler i mus vev ved hjelp av digital PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Induksjon av legemiddelindusert, autoimmun hepatitt hos BALB/c mus for studier av dets patogene mekanismer

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Benmargstransplantasjonsplattform for å undersøke rollen til dendrittiske celler i graft-versus vertssykdom

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...