Name: induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice
Uploaded: 2019-02-11T13:00:00
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Este estudo foi suportado pelo Collaborative Research centros CRC () 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; projeto B03) (para KH) e CRC 1181 (CRC-DFG, projeto B05) (para KH), ambos financiados pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, alemão Research Foundation).

Os métodos experimentais descritos aqui foram aprovados pelo governo de Mittelfranken, estado de Baviera, Alemanha.
1. DECH indução
<ol><li>Dia 0: Irradiação de corpo Total dos ratos destinatários
	<ol>
<li>Usar o feminino CD45.2+ H2kd+ BALB/c ratos que são pelo menos 10 semanas de idade como destinatários.</li>
		<li>Pesar e registar o peso dos ratos destinatários antes da indução da DECH. Nota: Certifique-se de que o des...

<ol>
	<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+pathogenesis+of+graft-versus-host+disease.">Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease.</a> British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).</li><li>Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+GvHD:+pathogenesis+and+classification.">Acute GvHD: pathogenesis and classification.</a> Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).</li><li>Naymagon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+graft-versus-host+disease+of+the+gut:+considerations+for+the+gastroenterologist.">Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14, 711-726 (2017).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation.</a> Blood. 127, 3117-3126 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Anthony, B. A., Hadley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+graft-versus-host+disease+and+in+vivo+T+cell+monitoring+using+an+MHC-matched+murine+model.">Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).</li><li>Beilhack, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+acute+graft-versus-host+disease+by+blocking+T-cell+entry+to+secondary+lymphoid+organs.">Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs.</a> Blood. 111, 2919-2928 (2008).</li><li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+colonoscopy+in+live+mice.">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).</li><li>Buchele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Inflammatory+T+Helper+Cells+via+Retinoic+Acid-Related+Orphan+Receptor+Gamma+t+Is+Ineffective+to+Prevent+Allo-Response-Driven+Colitis.">Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).</li><li>Ullrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BATF-dependent+IL-7RhiGM-CSF++T+cells+control+intestinal+graft-versus-host+disease.">BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).</li><li>Kaplan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+antigens+determine+graft-versus-host+disease+phenotype.">Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype.</a> Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).</li></ol>

O protocolo descreve a metodologia de indução e miniendoscópica avaliação do fenótipo do cólon observada no decurso de GvHD intestinal. Serve o propósito maior de permitir aos cientistas estudar GvHD intestinal longitudinalmente e de forma não invasiva, ao longo de toda doença (ou seja, desde o início da manifestação do cólon e progressão até a atividade da doença máxima).
No entanto, existem alguns passos críticos e importantes limitações inerentes aos métodos de apresen...

Malignidades hematopoiéticas directamente decorrentes do compartimento de células-tronco hematopoiéticas e descontrolada, progredindo rapidamente e distúrbios graves de imune-mediada são frequentemente indicações para executar allo-HCT1,2. No entanto, apesar de contabilidade para a ocorrência da resposta enxerto-versus-tumor prognóstica benéfica, linfócitos do doador são frequentemente induzindo e promovendo um ataque imune-mediada indesejado de componentes de tecido saudável dentro do destinatário allo-HCT , um processo que é chamado de doença do enxerto - versus - hospedeiro3. Manifestações no intestino, o so-called GvHD intestinal, representam a mais temida complicação da DECH aguda, formas graves de que são rotineiramente associadas com uma elevada taxa de mortalidade1,2,4.
Modelos globais, murino de allo-HCT têm emergido como inestimáveis ferramentas para identificar e estudar mecanismos imune-mediada subjacentes a patogênese da GvHD5. No entanto, avaliação cinética de, por exemplo, efeitos benéficos do romance intervenções terapêuticas ao longo do tempo em ratos vivos rotineiramente baseia a determinação da GvHD clínico pontuações6. Enquanto essas pontuações são adequadas para refletir, por exemplo, a carga doença global (ou seja, a DECH sistêmica), clínica marca falta a sensibilidade para espelhar confiantemente manifestações específicas do órgão (por exemplo,, no intestino). Portanto, as conclusões, por exemplo no que diz respeito a efeitos de intestino-protetor de uma determinada intervenção terapêutica, que se baseiam estes sistemas de pontuação, geralmente deixam a desejar.
Apesar dos grandes avanços através da invenção de novela todo o corpo de imagem modalidades em combinação com o uso de qualquer rato genética bioluminescentes ou fluorescente modelos7,8, metodologias para diretamente e especificamente avaliar o intestinal manifestação da DECH em ratos vivos estão faltando. Portanto, a lógica por trás do protocolo da avaliação endoscópica do fenótipo intestinal GvHD descrito na próxima seção é para ultrapassar este obstáculo. Além disso, a motivação também é reduzir o número de ratos experimentais desde que, até agora, uma avaliação detalhada das características morfológicas, celulares e moleculares (por exemplo,, por histopatologia ou biologia molecular) de GvHD intestinal manifestação em última análise, é exigido o sacrifício do mouse experimental.
Nossa instituição tem relatado anteriormente na metodologia de uma miniendoscópica avaliação das manifestações do cólon, no curso de modelos de colite syngeneic9. No protocolo apresentado aqui, nós temos refinado e adaptado a polictomia matriz de Pontuação para colite alloresponse-conduzido em camundongos ao vivo com GvHD intestinal após transplante de alloreactive linfócitos HCT e doador em uma classe de MHC eu totalmente incompatíveis configuração . Identificamos quatro parâmetros adequados para refletir intestinais lesões do cólon DECH-relacionados. Além disso, nós estabelecemos um sistema que permite uma classificação aperfeiçoá-lo de qualquer determinante único, resultando em uma nova partitura que prontamente informa o leitor sobre a gravidade da GvHD intestinal presente em um determinado do mouse em um ponto determinado do tempo. Análises histopatológicas confirmaram que um escore endoscópico acima de um determinado limiar confiantemente está prevendo a inflamação do tecido de grau moderado a alto. Portanto, avaliação endoscópica-mini parece representar um substituto do trabalho para a Histopatologia do padrão-ouro que rotineiramente exige o sacrifício dos ratos experimentais. Importante, este protocolo pode ser aplicado em praticamente qualquer ponto de tempo determinado e pode ser usado várias vezes durante o curso da doença10,11. Além disso, em contraste com o uso de abordagens de bioluminescência-dependente, não do trabalho intenso e demoradas como intercrossing geneticamente modificados ratos são necessárias medidas e, portanto, a metodologia pode ser aplicada em praticamente qualquer linha de rato de interesse.
Tomados em conjunto, do ponto de vista clínico prejudicial de allo-HCT os pacientes com DECH intestinal grave, rápidos progressos científicos e mais insight sobre os mecanismos moleculares subjacentes a patogênese imunológica são urgentemente necessários. Da mesma forma, considerações importantes, éticas exigem que o ganho de conhecimento deve ser alcançado com o uso do número mínimo de ratos experimentais. Portanto, ambos reconhecidos créditos sobre a comunidade de pesquisa explorando GvHD intestinal podem ser avançados implementando seriais avaliações miniendoscópica do cólon na cadeia de trabalho experimental para monitorar e grau GvHD intestinal no rato experimental ao vivo modelos, como descrito e validados no protocolo aqui apresentado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1249px;" width="1249">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator</td>
			<td style="width:216px;">Gamma-Service Meical GmbH</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:479px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Phosphate-buffered saline (PBS )</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>D8662-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>R8758-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Hypodermic needle (26G)</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">1 mL syring</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:152px;">9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">50 mL tube</td>
			<td style="width:216px;">Sarstedt Ag &#38; Co.KG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Cell strainer with a 40 &#181;m mesh screen</td>
			<td style="width:216px;">BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td style="width:152px;">11209</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">8043.2</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td style="width:152px;">1,048,540,500</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pan T Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-095-130</td>
			<td>magnet cell separation to isolate splenic T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>109822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>110730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Filtrated bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Pan Biotec</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>ingredient of FACS buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well polystyrene V-bottom plates</td>
			<td style="width:216px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">651201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:152px;">352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSRFortessa II flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Insulin syringe with sterile interior (30G)</td>
			<td style="width:216px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:152px;">324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Oxy Vet Oxymat 3</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>oxygen concentrator&#160; for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">NarkoVet&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">213062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Plexiglass chamber&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">214620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Straight Forward Telescope</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>64301 AA</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protection and Examination Sheath</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 C</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Examination Sheath with working channel</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 D</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Biopsy Forceps</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">61071 ZJ&#160;</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;175 Watt SCB XenonLight Source</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">20132120</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber Optic Light Cable</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">495 NL</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 S3 Camera Head</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22220030</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 SCB Camera Control Unit</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22200020</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">LCD monitor</td>
			<td style="width:216px;">Olympus</td>
			<td>OEV181H</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forane / Isofluran</td>
			<td>AbbVie Inc.&#160;</td>
			<td>B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution 37 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">7398.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5,0 mL Dispenser tip&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eppendorf AG</td>
			<td align="right">30089456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice

Aguda enxerto doença contra o hospedeiro (GvHD) representa a complicação mais grave que pacientes submetidos anteriormente a cara (allo-HCT) de transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico e frequentemente está associada com um resultado clínico ruim. Quando, por exemplo, GvHD manifestações da pele são geralmente responsivos às terapias imune-supressora estabelecidas e, portanto, não vai levar um curso fatal, a presença e a intensidade da GvHD intestinal, especialmente das partes meados-de-inferior do intestino, influenciar fortemente o resultado e geral sobrevida de pacientes com aguda DECH. opções terapêuticas são essencialmente limitados aos agentes imune-supressora clássicos rendendo apenas moderados efeitos atenuantes a doença. Portanto, conhecimento detalhado sobre a cascata imune do tecido-residente, alterações na microbiota intestinal, e a resposta do estroma anterior, em cima e depois do aparecimento de GvHD intestinal são urgentemente necessários para compreender os eventos e os mecanismos subjacentes a patogênese e desenvolver opções terapêuticas inovadoras. Modelos murino de GvHD são frequentemente empregados para identificar e avaliar funcionalmente moléculas e vias de condução presumidamente GvHD intestinal. No entanto, meios especificamente monitorar e avaliar a inflamação intestinal ao longo do tempo são essencialmente falta desde que escores estabelecidos para avaliar e corrigir GvHD aguda rotineiramente são compostos de vários parâmetros que melhor reflectem GvHD sistêmica manifestações. A avaliação detalhada da GvHD intestinal foi restringida aos estudos usando ratos sacrificados, excluindo, assim, essencialmente longitudinal (i.e., cinética) análises do compartimento do cólon sob uma determinada condição experimental (por exemplo, anticorpo mediada bloqueio de uma citocina proinflammatory) em camundongos ao vivo (i.e., na vivo). A avaliação in situ miniendoscópica do cólon distal dos ratos allo-HCT-tratada aqui descrito permite um) uma detalhada avaliação macroscópica dos diferentes aspectos da inflamação intestinal e b) a opção para coletar amostras de tecido para análises a jusante no vários pontos de tempo ao longo do período de observação. Em geral, a abordagem endoscópica-mini fornece um grande avanço na monitorização não invasiva pré-clínica e avaliação de GvHD intestinal.

O protocolo atual, descrevendo a avaliação miniendoscópica de lesões intestinais de DECH-associado do cólon distal, foi estabelecido e validado em ratos previamente submetidos a indução sistêmica de um modelo de DECH aguda grave. Neste estudo, usamos uma classe de MHC eu totalmente incompatíveis sistema modelo no qual BALB/c ratos foram letalmente irradiados, seguido pelo transplante de medula óssea alogênico de T-celular-esgotada e pela administração da DECH-induzindo allore...

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Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Indução de Intestinal enxerto versus doença-- host e sua avaliação endoscópica-Mini em ratos ao vivo

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve o transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico e permite repetitivas avaliações miniendoscópica do cólon distal in situ para a presença, as características e gravidade da inflamação do cólon dentro ao vivo ratos sofrem intestinal enxerto versus doença-- host.

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

A avaliação mini-endoscópica do cólon em camundongos vivos fornece suporte experimental fundamental para investigar manifestações intestinais da doença aguda de gráfico versus hospedeiro, GvHD, sobre transplante alergênico e hematopoiético de células-tronco. A avaliação não invasiva da colite aguda relacionada à GvHD pode funcionar como um substituto de trabalho para histopatologia padrão-ouro, tornando assim repetidos sacrifícios animais para obter amostras de tecido desnecessárias. Demonstrando o procedimento será Vera Buchele, uma pós-doutora do meu laboratório.Um dia após a irradiação total do corpo dos camundongos BALB/c receptores, coloque um rato doador CD-45.1 live 5B6 SJL na posição propensa em uma bainha de trabalho limpa, e use uma ponta curva e serrilhada de 13 cm de um fórceps simkin para levantar a pele em um calcanhar de Aquiles. Utilizando uma tesoura fina endurecida de 8,5 cm com pontas retas, inciso a pele entre as fórceps e um calcanhar, alongando a incisão cranialmente para facilitar a remoção da pele e pele dos membros traseiros. Quando a pele tiver sido removida dos membros traseiros, corte cada quadril, tornozelo e articulação do joelho.Armazene a coxa e a haste de cada membro traseiro em uma única placa de Petri de 92 mm cheia de PVS no gelo e remova cuidadosamente o máximo de músculo possível de cada osso, transferindo cada fêmur limpo e tíbia em um tubo de 50 mL de meio RPMI 1640 estéril em gelo molhado. Para isolar a medula óssea, transfira um osso de cada vez em uma nova placa de Petri de 92 mL cheia de meio RPMI 1640 fresco, e use um bisturi para cortar as extremidades de cada osso. Em seguida, use uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de calibre 26 para lavar os ossos com 1 mL de meio fresco de cada vez em um tubo de coleta de 50 mL contendo 5 mL de média.Quando todos os ossos foram lavados, pipeta suavemente as peças de medula óssea desintegradas várias vezes para gerar uma suspensão de célula única antes de filtrar as células através de um filtro de células de tela de malha de 40 micrômetros em um novo tubo de coleta de 50 mL. Pelotar as células por centrifugação e suspender as células em 5 mL de tampão de potássio de cloreto de amônio para uma incubação de três minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, pare a reação com 10 mL de PVS, e centrifugar as células novamente.Suspenda a pelota em 2 mL de PVS fresco para contagem, e reserve uma alíquota de seis vezes 10 para a sexta célula para análise citométrica de fluxo a jusante. Em seguida, use um kit de purificação celular comercialmente disponível para esgotar magneticamente as células T CD90.2 positivas da suspensão unicelular da medula óssea, de acordo com as instruções do fabricante, e reserve uma vezes 10 para a sexta alíquota celular do eluato empobrecido de células T para análise citométrica de fluxo a jusante da pureza e composição celular antes e depois da separação. Em seguida, use uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de calibre 30 para injetar cinco vezes 10 para o quinto T-células esgotadas células de medula óssea em 100 microliters de PVS intravenosamente no espaço retrobulbar do seio venoso de cada animal receptor irradiado.No dia seguinte, coloque um baço colhido de um animal doador em um filtro de malha de 40 micrômetros em um tubo de coleta de 50 mL, e use um êmbolo de seringa para pressionar o tecido do baço através do coador no tubo. Lave o coador e o êmbolo com PVS para coletar todos os esplenócitos e pelota as células por centrifugação. Após a demonstração da lise dos glóbulos vermelhos, suspenda as células brancas do sangue para contagem e reserve seis vezes 10 para a alíquota da sexta célula para análise citométrica do fluxo a jusante.Para um isolamento total de células T CD3 positivos de esplenócitos totais, use um kit de purificação celular comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante, e reserve uma vezes 10 para o sexto cd3-positivo aliquot de células T da fração celular positiva para análise citométrica de fluxo a jusante da pureza e composição celular antes e depois da separação. Em seguida, injete sete vezes 10 para as quintas células T altorativas CD3-positivas em 100 microliters de PVS intravenosamente no espaço retrobulbar de cada rato receptor para induzir GvHD. Para escorar lesões relacionadas à GvHD por mini-endoscopia da região colorretal distal, levante a cauda de um animal receptor logo acima da raiz da cauda com uma mão, e use a outra mão para inserir cuidadosamente o endoscópio no reto através do ânus.Enquanto a corrente de ar infla o lúmen colorretal, mova lentamente e cuidadosamente o endoscópio para a frente na direção aboral. Para evitar lesões intestinais coloniais, mantenha o endoscópio na área média do lúmen usando a tela de vídeo ao vivo para ajudar neste posicionamento. Comece a gravar o fluxo de vídeo e marcar a inflamação, avaliando a inflamação relacionada à GvHD do cólon, marcando os parâmetros como ilustrado.Quando um ponto de pontuação estiver localizado, mova o endoscópio suavemente e ligeiramente para frente e para trás para avaliar os diferentes parâmetros. Para avaliar a translucência do parâmetro e a consistência das fezes, posicione o endoscópio a uma distância maior em relação à parede colonial. Para avaliar a granularidade e vascularização da lesão, posicione o endoscópio nas proximidades da parede colonial e aplique cuidadosamente tensão bem dosada à parede colonial com a ponta do endoscópio.Após a conclusão do processo de pontuação, pare a gravação. Em comparação com os controles, o transplante de células-tronco hematopoiísicos alergênicos como demonstrado produz uma indução reprodutivelmente robusta de um fenótipo sistêmico de GvHD, com aumento progressivo dos escores clínicos de GvHD em animais receptores. Esses critérios mini-endoscopicamente avaliados foram especificamente adaptados da colite síngênica relatada anteriormente no contexto de parâmetros de pontuação de colite orientadas por ao-resposta para a descrição precisa, pontuação e classificação de lesões associadas à doença de GvHD intestinal no cólon distal.De fato, o sistema de classificação mini-endoscopicamente baseado permite uma fácil discriminação de camundongos receptores de linfócitos com sinais graves de inflamação intestinal de camundongos de controle que são essencialmente desprovidos de GvHD. A invalidação do sistema de classificação baseado em mini-endoscopicamente estudos histopatológicos confirmaram que o cólon de camundongos severamente afetados pela inflamação relacionada à GvHD apresenta sinais histopatológicos igualmente fortes de inflamação. Em contraste, os tecidos de cólon dos camundongos de controle apresentaram não para, no máximo, sinais histopatológicos leves de inflamação, de acordo com a ausência virtual de sinais mini-endoscopicamente detectáveis de colite.Além disso, estudos de correlação entre a atividade de colite mini-endoscopicamente e histopatológicamente avaliada e os escores sistêmicos de GvHD demonstram que mini-endoscopicamente determinados alguns escores de menos ou igual a três predizem de forma confiável a ausência de escores de inflamação coloniais associados ao GvHD intestinal de médio a maior grau obtidos a partir da classificação histopatológica. Além disso, a gravidade do GvHD intestinal avaliado endoscopicamente mostra correlação com a atividade sistêmica da doença de GvHD. Para padronizar os resultados da avaliação mini-endoscópica da inflamação colonica e garantir a comparabilidade entre diferentes camundongos e experimentos ao longo do tempo, um local anatômico definido deve ser selecionado para pontuação.Além de marcar inflamação cólon, o canal de trabalho incorporado dentro da configuração mini-endoscópica permite a recuperação de biópsias de tecido guiadas por visão aplicáveis a várias análises a jusante, como histopatologia padrão. Devido à natureza não invasiva da mini-endoscopia, a colite aguda relacionada à GvHD pode ser repetidamente avaliada dentro do mesmo animal em praticamente qualquer momento, produzindo assim insights fascinantes sobre o GvHD intestinal.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Imunologia e Infecção

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

A indução de uma resposta inflamatória em culturas primárias de hepatócitos de ratinhos

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Avaliação do citotóxicos e efeitos imunomoduladores de substâncias no pulmão humano de precisão de corte fatias

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Indução e pontuação da doença do enxerto versus hospedeiro em modelo murino Xenogeneico e quantificação de células T humanas em tecidos de camundongo utilizando PCR digital

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Indução de Hepatite Autoimune Induzida por Drogas em CAMUNDONGOS BALB/c para o Estudo de Seus Mecanismos Patogênicos

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença enxerto-versus-hospedeiro

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...