Name: induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice
Uploaded: 2019-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

Это исследование было поддержано совместных научно-исследовательских центров (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; проект B03) (для К.Х.) и CRC 1181 (CRC-DFG, проект B05) (для К.Х.), оба финансируемый Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд).

Экспериментальные методы, описанные здесь были одобрены правительством Mittelfranken, Бавария, Германия.
1. GvHD индукции
<ol><li>День 0: Тотальное облучение тела получателя мышей
	<ol>
<li>Использование женского CD45.2+ H2kd+ BALB/c мышей, которые по крайней мере 10 недель к?...

<ol>
	<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+pathogenesis+of+graft-versus-host+disease.">Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease.</a> British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).</li><li>Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+GvHD:+pathogenesis+and+classification.">Acute GvHD: pathogenesis and classification.</a> Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).</li><li>Naymagon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+graft-versus-host+disease+of+the+gut:+considerations+for+the+gastroenterologist.">Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14, 711-726 (2017).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation.</a> Blood. 127, 3117-3126 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Anthony, B. A., Hadley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+graft-versus-host+disease+and+in+vivo+T+cell+monitoring+using+an+MHC-matched+murine+model.">Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).</li><li>Beilhack, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+acute+graft-versus-host+disease+by+blocking+T-cell+entry+to+secondary+lymphoid+organs.">Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs.</a> Blood. 111, 2919-2928 (2008).</li><li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+colonoscopy+in+live+mice.">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).</li><li>Buchele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Inflammatory+T+Helper+Cells+via+Retinoic+Acid-Related+Orphan+Receptor+Gamma+t+Is+Ineffective+to+Prevent+Allo-Response-Driven+Colitis.">Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).</li><li>Ullrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BATF-dependent+IL-7RhiGM-CSF++T+cells+control+intestinal+graft-versus-host+disease.">BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).</li><li>Kaplan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+antigens+determine+graft-versus-host+disease+phenotype.">Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype.</a> Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).</li></ol>

Протокол описывает методику индукции и мини эндоскопическая оценки толстой фенотипа, наблюдается в ходе кишечных GvHD. Он служит более широкое включение ученых для изучения кишечных GvHD продольно и неинвазивно (то есть, с самого начала толстой проявления и прогрессирования до максимальн...

Кроветворная злокачественных опухолей, непосредственно вытекающие из отсека гемопоэтических стволовых клеток и неконтролируемым, быстро прогрессирует и серьезные расстройства иммунной системы зачастую указания для выполнения Алло HCT1,2. Однако хотя приходится появление прогностические выгодно реакции трансплантат против опухоли, лимфоцитов доноров часто вызывая и содействие нежелательные иммунной системы нападения здоровых тканей компонентов в рамках Алло HCT получателя , процесс, который называется трансплантат – versus – хост болезни3. Проявления в кишечнике, так называемой кишечной GvHD, представляют собой наиболее ужасной осложнением острого GvHD, тяжелые формы, которые обычно связаны с высокой смертности1,2,4.
В целом, мышиных моделях Алло HCT появились как неоценимое значение для выявления и изучения иммунной опосредованного механизмов, лежащих в основе патогенеза GvHD5. Однако, кинетической оценки, например, благотворное влияние роман терапевтических вмешательств в живых мышей со временем обычно основывается на определение клинической GvHD счеты6. Хотя эти оценки подходят для отражения, например, общего бремени болезней (например, системного GvHD), клинической оценки отсутствие чувствительность к надежно зеркало органоспецифические проявления (например, в кишечнике). Следовательно выводы, например в том, что касается кишки защитные эффекты данной терапевтического вмешательства, которые основаны на этих скоринговых систем обычно не отвечают.
Несмотря на крупные достижения через изобретение Роман всего тела imaging условия в сочетании с использованием либо мыши генетических биолюминесцентных или флуоресцентные модели7,8, методологии непосредственно и конкретно оценить кишечные проявления GvHD в живых мышей хватает. Таким образом протокол эндоскопических оценки кишечных GvHD фенотип, описанные в следующем разделе объясняется преодолеть это препятствие. Кроме того, для уменьшения числа экспериментальных мышей с, пока что, подробную оценку сотовой, морфологические и молекулярные характеристики является мотивация (например, , гистопатология или молекулярной биологии) из кишечника GvHD проявление в конечном итоге требуется жертву экспериментально мыши.
Наше учреждение ранее сообщал о методологии мини эндоскопическая оценки кишечных проявлений в ходе сингенных колит модели9. В протоколе, представленные здесь, мы уточнить и скорректировать Колоноскопическая скоринга матрицы для ориентированных на alloresponse колит в живых мышей с кишечной GvHD после трансплантации аллореактивных HCT и доноров лимфоцитов в MHC класса я полностью несоответствующие установка . Мы определили четыре параметры, подходящие для отражения кишечника связанных с GvHD толстой поражений. Кроме того мы создали систему, которая позволяет доработать классификации любой один детерминант, что приводит к новым оценка, которая легко информирует читателя о тяжести кишечных GvHD присутствует в данной мыши на данный момент. Гистопатологические анализ подтвердил, что эндоскопическая оценка выше определенного порога надежно предсказывает умеренно высокий класс воспаление тканей. Следовательно мини эндоскопическая оценки, по-видимому, представляют рабочие заменой гистопатология золотой стандарт, который постоянно требует жертву экспериментальной мышей. Важно отметить, что этот протокол могут быть применены практически в любой точке данного времени и может использоваться многократно в течение болезни10,11. Кроме того, в отличие от использования биолюминесценции-зависит от подходов, требуются без труда интенсивных и длительных меры как основанные генетически изменены мышей и, следовательно, методология может применяться на практически любой мыши линии интерес.
Вместе взятые, учитывая пагубные клинические перспективы Алло HCT больных с тяжелой кишечных GvHD, быстрого научно-технического прогресса и более понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза иммунной срочно. Аналогичным образом важно, этические соображения требуют, что получение знаний должно быть достигнуто с использованием минимального числа экспериментальных мышей. Следовательно оба признали претензии на научно-исследовательское сообщество знакомства GvHD кишечника может быть достигнуто путем осуществления последовательных мини эндоскопическая оценок толстой кишки в цепочке экспериментальная работа для мониторинга и класс кишечных GvHD в живой экспериментального mouse модели, как описано и проверены в протоколе, представленные здесь.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1249px;" width="1249">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator</td>
			<td style="width:216px;">Gamma-Service Meical GmbH</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:479px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Phosphate-buffered saline (PBS )</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>D8662-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>R8758-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Hypodermic needle (26G)</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">1 mL syring</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:152px;">9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">50 mL tube</td>
			<td style="width:216px;">Sarstedt Ag &#38; Co.KG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Cell strainer with a 40 &#181;m mesh screen</td>
			<td style="width:216px;">BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td style="width:152px;">11209</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">8043.2</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td style="width:152px;">1,048,540,500</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pan T Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-095-130</td>
			<td>magnet cell separation to isolate splenic T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>109822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>110730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Filtrated bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Pan Biotec</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>ingredient of FACS buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well polystyrene V-bottom plates</td>
			<td style="width:216px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">651201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:152px;">352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSRFortessa II flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Insulin syringe with sterile interior (30G)</td>
			<td style="width:216px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:152px;">324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Oxy Vet Oxymat 3</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>oxygen concentrator&#160; for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">NarkoVet&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">213062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Plexiglass chamber&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">214620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Straight Forward Telescope</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>64301 AA</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protection and Examination Sheath</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 C</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Examination Sheath with working channel</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 D</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Biopsy Forceps</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">61071 ZJ&#160;</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;175 Watt SCB XenonLight Source</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">20132120</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber Optic Light Cable</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">495 NL</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 S3 Camera Head</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22220030</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 SCB Camera Control Unit</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22200020</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">LCD monitor</td>
			<td style="width:216px;">Olympus</td>
			<td>OEV181H</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forane / Isofluran</td>
			<td>AbbVie Inc.&#160;</td>
			<td>B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution 37 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">7398.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5,0 mL Dispenser tip&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eppendorf AG</td>
			<td align="right">30089456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice

Острый трансплантат – versus – хост болезни (GvHD) представляет самое тяжелое осложнение что пациентов, перенесших ранее аллогенной гемопоэтических стволовых клеток трансплантации (Алло HCT) лица и часто ассоциируется с плохой клинических исходов. Хотя, например, проявления GvHD кожи обычно отвечают установленным иммунной супрессивной терапии и следовательно, не принимают роковой конечно, присутствие и интенсивность кишечных GvHD, особенно из середины к нижней части кишки, сильно влияют на результаты и общей выживаемости больных с острой GvHD. терапевтические возможности ограничиваются по существу классический подавляющих иммунную агентов, уступая только умеренной болезни смягчения эффектов. Следовательно, детальное знание о ткани резидентов иммунной Каскад, изменения в кишечную микрофлору, и стромальных ответ до, после и после кишечные заболевания GvHD срочно необходимы для понимания событий и лежащих в основе механизмов ее Патогенез и разрабатывать инновационные терапевтические возможности. Мышиных моделях GvHD часто используются для выявления и функционально оценки молекул и путей, предположительно вождения кишечных GvHD. Однако по существу отсутствуют средства специально контролировать и оценивать кишечного воспаления с течением времени с установленным баллов для оценки и класс острой GvHD обычно состоят из различных параметров, которые скорее отражают системного GvHD проявления. Подробной оценки кишечных GvHD был ограничен для исследования с использованием Усыпленных мышей, тем самым по существу за исключением продольной (т.е. кинетические) анализ толстой отсека под условие данного экспериментального (например, антитела опосредованной блокада провоспалительного цитокина) в живых мышей (то есть, в естественных условиях). Мини эндоскопическая на месте оценки дистальной части толстой кишки Лечение Алло HCT мышей, описанные здесь позволяет) подробную макроскопических оценку различных аспектов кишечного воспаления и b) параметр для сбора образцов ткани для вниз по течению анализов на различные моменты времени в течение периода наблюдения. В целом мини эндоскопическая подход обеспечивает крупный шаг вперед в доклинической неинвазивного мониторинга и оценки кишечных GvHD.

Текущий протокол, описывая мини эндоскопическая оценки поражения кишечника связанных GvHD дистальной части толстой кишки, установлены и проверены в ранее подвергался системных индукции тяжелой острой GvHD модели мышей. В этом исследовании, мы использовали MHC класса, я по...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Индукция кишечного трансплантата – versus – хост заболевания и его мини эндоскопическая оценки в живых мышей

Здесь мы представляем протокол, который описывает трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток и позволяет повторяющихся мини эндоскопическая оценок дистальной части толстой кишки на месте для присутствия, характеристики и тяжесть воспаления кишечника в живой мышей, страдающих болезнью кишечного трансплантата – versus – хост.

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Мини-эндоскопическая оценка толстой кишки у живых мышей обеспечивает ключевую экспериментальную поддержку для исследования кишечных проявлений острого графа против хозяина болезни, GvHD, на алогенных, гематопоэтических трансплантации стволовых клеток. Неинвазивная оценка острого Колита, связанного с GvHD, может функционировать как рабочая замена гистопатологии золотого стандарта, тем самым делая неоднократные жертвы животных для получения образцов тканей ненужными. Демонстрацией процедуры будет Вера Бучеле, пост-док из моей лаборатории.На следующий день после облучения всего тела реципиента BALB/c мышей, поместите CD-45.1 жить 5B6 SJL донорской мыши в склонном положении на чистой рабочей оболочке, и использовать один 13-сантиметровый изогнутый и зубчатый кончик simkin типсов поднять мех на одной ахиллесовой пятой. Используя затвердевшие 8,5-сантиметровые тонкие ножницы с прямыми кончиками, наклоняйте кожу между типсами и одной пяткой, удлиняя разрез черепно, чтобы облегчить удаление кожи и меха из задних конечностей. Когда кожа была удалена из задних конечностей, прорезать каждый бедра, лодыжки и коленного сустава.Храните бедро и хвостовик каждой задней конечности в одной 92-мм чашке Петри, наполненной ПВЗ на льду, и тщательно удалите как можно больше мышц из каждой кости, передавая каждую очищенную бедренную кость и голень в 50-млную трубку стерильной RPMI 1640 среды на мокром льду. Чтобы изолировать костный мозг, перенесите одну кость одновременно в новую чашку Петри 92 мл, наполненную свежей средой RPMI 1640, и используйте скальпель, чтобы отрезать концы каждой кости. Затем используйте шприц 1 мл, оснащенный иглой 26-го калибра, чтобы промыть кости 1 мл свежей среды одновременно в трубку для сбора 50 мл, содержащую 5 мл среды.Когда все кости были покраснели, осторожно пипетки рассыпчатый костного мозга штук вверх и вниз несколько раз, чтобы генерировать одноклеточную подвеску перед фильтрацией клеток через 40-микрометровый сетки экрана клетки ситечко в новую трубку сбора 50 мл. Пеллет клетки центрифугации и повторно приостановить клетки в 5 мл хлорида аммония хлорид калия лиза буфера для трехминутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации, остановить реакцию с 10 мл ПВХ, и центрифуга клеток снова.Повторно приостановить гранулы в 2 мл свежих ПВХ для подсчета, и выделить шесть раз 10 до шестой ячейки aliquot для вниз по течению потока цитометрического анализа. Далее, используйте коммерчески доступный комплект очистки клеток для магнитного истощения CD90.2-положительных Т-клеток из одноклеточной подвески костного мозга, в соответствии с инструкциями производителя, и отложите один раз от 10 до шестой клеточной алициты Т-клеток, истощенных элуат для вниз по течению потока цитометрического анализа чистоты клеток и состава до и после разделения. Затем используйте шприц 1 мл, оснащенный иглой 30-го калибра, чтобы вводить пять раз от 10 до пятого Т-клеточного истощенных клеток костного мозга в 100 микролитров ПВЗ внутривенно в ретробулбарное пространство венозной пазухи каждого облученого животного-реципиента.На следующий день поместите селезенку, собранную у животного-донора, на 40-микрометровый сетчатый ситечко в трубке для сбора 50 мл и используйте поршень шприца, чтобы нажать на селезенку через ситечко в трубку. Вымойте ситечко и поршень с ПВХ, чтобы собрать все спеноциты, и гранулы клеток центрифугации. После того, как красные кровяные клетки лиза продемонстрирована, повторно приостановить белые кровяные тельца для подсчета, и выделить шесть раз 10 до шестой клеточной aliquot для вниз по течению потока цитометрического анализа.Для общей CD3-положительной изоляции Т-клеток от общего количества спланоцитов используйте коммерчески доступный комплект для очистки клеток в соответствии с инструкциями производителя и отложите один раз от 10 до шестого CD3-положительного T-клеточного алицита из положительной фракции клеток для цитометрического анализа цитометрического анализа чистоты и состава клеток до и после разделения. Затем ввимите семь раз от 10 до пятого алорактивного CD3-положительного Т-клеток в 100 микролитров ПВХ внутривенно в ретробульбарное пространство каждой мыши-получателя, чтобы вызвать GvHD. Чтобы забить GvHD связанных поражений с помощью мини-эндоскопии дистальной колоректальной области, поднимите хвост животного-реципиента чуть выше хвоста корня с одной стороны, и использовать другую руку, чтобы тщательно вставить эндоскоп в прямую кишку через анус.В то время как поток воздуха раздувает колоректальный люмен, медленно и осторожно двигайте эндоскоп вперед в аборигенное направление. Чтобы избежать травм толстой кишки кишечника, держать эндоскоп в средней области люмена с помощью живого видеоэкрана, чтобы помочь в этом позиционировании. Начните записывать видео поток и забил воспаление, оценивая GvHD связанных воспаление толстой кишки, забив параметры, как показано на примере.Когда скоринг пятно было расположено, переместить эндоскоп мягко и немного вперед и назад, чтобы оценить различные параметры. Для оценки параметра прозрачность и консистенция стула, положение эндоскоп на более широком расстоянии по отношению к толстой стенке. Для оценки детализации и сосудистости поражения, положение эндоскопа в непосредственной близости от толстой стенки, и тщательно применять хорошо досированное напряжение толстой стенки с кончиком эндоскопа.По завершении процесса подсчета очков, остановить запись. По сравнению с контролем, алогенная гематопоиевтная трансплантация стволовых клеток, как было продемонстрировано, производит воспроизводимо надежную индукцию системного фенотипа GvHD, с постепенно увеличивающейся клинической оценкой GvHD у животных-реципиентов. Эти мини-эндоскопически оцениваемые критерии были специально адаптированы из ранее зарегистрированного сингенеического колита в контексте ало-ответ-управляемых параметров скоринга колита для точного описания, скоринга и классификации кишечных GvHD-заболеваний, связанных с поражениями в дистальной толстой кишке.Действительно, мини-эндоскопически основанная система классификации позволяет легкой дискриминации доноров-лимфоцитов, принимающих мышей с тяжелыми признаками воспаления кишечника от контрольных мышей, которые по существу лишены GvHD. Инвалидизация мини-эндоскопически основанной системы классификации гистопатологических исследований подтвердила, что толстая кишка мышей, серьезно пострадавших от воспаления, связанного с GvHD, проявляет столь же сильные гистопатологические признаки воспаления. В отличие от этого, ткани толстой кишки контрольных мышей не проявляли, в крайнем случае, легких гистопатологических признаков воспаления, в согласии с фактическим отсутствием мини-эндоскопически обнаруживаемых признаков колита.Кроме того, корреляционные исследования между мини-эндоскопически и гистопатологически оцененной активностью колита и системными показателями GvHD показывают, что мини-эндоскопически определенные некоторые оценки менее или равны трем надежно предсказывают отсутствие среднего и более высокого класса кишечного GvHD-ассоциированного воспаления толстой кишки, полученных от гистопатологической классификации. Кроме того, тяжесть эндоскопически оцененной кишечной GvHD показывает корреляцию с системной активностью GvHD болезни. Для стандартизации результатов мини-эндоскопической оценки воспаления толстой кишки и обеспечения сопоставимости различных мышей и экспериментов с течением времени, определенный анатомичный сайт должен быть выбран для скоринга.В дополнение к скоринга воспаления толстой кишки, встроенный рабочий канал в мини-эндоскопической установки позволяет извлечения зрения управляемых биопсий тканей, применимых к различным анализам вниз по течению, таких как стандартная гистопатология. Из-за неинвазивного характера мини-эндоскопии, острый Колит, связанный с GvHD, может быть неоднократно оценен в пределах одного и того же животного практически в любое время, тем самым позволяя увлекательное понимание кишечного GvHD.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Индукция экспериментального аутоиммунного гипофизит в SJL Мыши

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Индукционная трансплантат против хозяина и<em&gt; В Vivo</em&gt; Т-клеток Мониторинг Использование MHC соответствием мышиной модели

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Индукционная мышиных воспаление кишечника с помощью приемных передачи эффекторных CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Высокая</sup&gt; Т-клеток в иммунодефицитных мышей

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей и оценка болезни зависимого распределения иммунных клеток в различных тканях

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Неинвазивным и технически неинтенсивное метод индукции и Фенотипирование экспериментальной бактериальной пневмонии у мышей

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

Стимуляция воспалительной реакции в первичной культурах гепатоцитов мышей

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Оценка цитотоксических и иммуномодулирующих эффектов веществ в легкое человека точности cut ломтики

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Индукция и скоринг трансплантата-Versus-Host болезни в Xenogeneic Murine модели и количественной оценки человеческих Т-клеток в мышь тканей с помощью цифровых ПЦР

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Индукция лекарственно-индуцированного аутоиммунного гепатита у мышей BALB/c для изучения его патогенных механизмов

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Платформа трансплантации костного мозга для изучения роли дендритных клеток в трансплантации против хост болезни

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...