Name: induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice
Uploaded: 2019-02-11T13:00:00
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Este estudio fue apoyado por la colaboración investigación centros (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; proyecto B03) (a K.H.) y CRC 1181 (CRC-DFG, proyecto B05) (a K.H.), ambos financiados por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación alemana de investigación).

Los métodos experimentales descritos aquí han sido aprobados por el gobierno de Mittelfranken, Baviera, Alemania.
1. EICH inducción
<ol><li>Día 0: Total irradiación de cuerpo entero de los ratones receptores
	<ol>
<li>Uso femenino CD45.2+ H2kd+ BALB/c los ratones que son al menos 10 semanas de edad como beneficiarios.</li>
		<li>Pesar y registrar el peso de los ratones receptores antes de la inducción de la EICH. Nota: Asegúre...

<ol>
	<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+pathogenesis+of+graft-versus-host+disease.">Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease.</a> British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).</li><li>Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+GvHD:+pathogenesis+and+classification.">Acute GvHD: pathogenesis and classification.</a> Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).</li><li>Naymagon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+graft-versus-host+disease+of+the+gut:+considerations+for+the+gastroenterologist.">Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14, 711-726 (2017).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation.</a> Blood. 127, 3117-3126 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Anthony, B. A., Hadley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+graft-versus-host+disease+and+in+vivo+T+cell+monitoring+using+an+MHC-matched+murine+model.">Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).</li><li>Beilhack, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+acute+graft-versus-host+disease+by+blocking+T-cell+entry+to+secondary+lymphoid+organs.">Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs.</a> Blood. 111, 2919-2928 (2008).</li><li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+colonoscopy+in+live+mice.">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).</li><li>Buchele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Inflammatory+T+Helper+Cells+via+Retinoic+Acid-Related+Orphan+Receptor+Gamma+t+Is+Ineffective+to+Prevent+Allo-Response-Driven+Colitis.">Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).</li><li>Ullrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BATF-dependent+IL-7RhiGM-CSF++T+cells+control+intestinal+graft-versus-host+disease.">BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).</li><li>Kaplan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+antigens+determine+graft-versus-host+disease+phenotype.">Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype.</a> Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).</li></ol>

El protocolo describe la metodología de la inducción y evaluación mini-endoscópica del colon fenotipo observado en el curso de GvHD intestinal. Sirve el mayor propósito de permitir a los científicos estudiar GvHD intestinal longitudinalmente y de forma no invasiva en el transcurso de toda enfermedad (es decir, desde el inicio de la manifestación colónica y la progresión hasta la actividad máxima de la enfermedad).
Sin embargo, hay algunos pasos críticos y limitaciones importantes in...

Malignidades hematopoyéticas derivadas directamente del compartimento de células madre hematopoyéticas y descontrolada, progresando rápidamente y graves desordenes inmune-mediados suelen ser indicaciones para HCT allo1,2. Sin embargo, aunque son responsables de la ocurrencia de la respuesta de injerto contra tumor beneficio pronóstica, los linfocitos del donante con frecuencia inducir y promover un ataque inmune-mediado no deseado de los componentes de tejido sano en el recipiente allo-HCT , un proceso que se llama injerto - versus - host disease3. En el intestino, el supuesto GvHD intestinal, las manifestaciones representan la complicación más temida de la GvHD aguda, formas graves de que son habitualmente asociadas con una alta mortalidad1,2,4.
General modelos murinos de allo-HCT han surgido como herramientas muy valiosas para identificar y estudiar mecanismos inmune-mediados subyacente a la patogenesia de GvHD5. Sin embargo, la evaluación cinética de, por ejemplo, efectos beneficiosos de las intervenciones terapéuticas novedosas con el tiempo en vivo ratones rutinariamente basa en la determinación de GvHD clínico puntuaciones6. Mientras que estos puntajes son convenientes reflejar, por ejemplo, la carga total de enfermedad (es decir, la GvHD sistémica), clínica puntuaciones falta la sensibilidad para reflejar confiablemente manifestaciones órgano específicas (por ejemplo,, en el intestino). Por lo tanto, conclusiones, por ejemplo con respecto a los efectos de gut-protección de una determinada intervención terapéutica, que se basan estos sistemas de puntuación generalmente se quedan cortas.
A pesar de los avances importantes a través de la invención de la novela todo el cuerpo la proyección de imagen modalidades en combinación con el uso de cualquier modelos de ratón genético bioluminiscente o fluorescente7,8, metodologías directamente y específicamente evaluar la intestinal carecen de manifestación de GvHD en ratones vivos. Por lo tanto, la razón de ser del Protocolo de la evaluación endoscópica de fenotipo GvHD intestinal que se describe en la sección siguiente es superar este obstáculo. Además, la motivación debe también reducir el número de ratones experimentales ya que, hasta ahora, una evaluación detallada de las características celulares, morfológicas y moleculares (e.g., por histopatología o biología molecular) de GvHD intestinal manifestación en última instancia ha requerido el sacrificio del ratón experimental.
Nuestra institución ha divulgado previamente en la metodología de la evaluación mini-endoscópica de colon manifestaciones en el curso de colitis syngeneic modelos9. En el protocolo que presentamos, hemos refinado y adaptado el colonoscopic puntuación matrix para la colitis alloresponse-conducido en vivo ratones con EICH intestinal sobre trasplante de alloreactive HCT y donante de linfocitos en un MHC de clase totalmente unida mal ajuste . Se identificaron cuatro parámetros adecuados para reflejar lesiones colónicas relacionadas con el EICH intestinales. Además, establecimos un sistema que permite una clasificación ajustada de cualquier factor individual, dando lugar a una nueva escala que fácilmente informa al lector acerca de la severidad de GvHD intestinal presente en un ratón dado en un momento dado. Los análisis histopatológicos confirmaron que una puntuación endoscópica por encima de cierto umbral es predecir confiablemente moderado a alto grado inflamación de los tejidos. Por lo tanto, la evaluación endoscópica mini parece representar un sustituto del trabajo de la histopatología de patrón oro que habitualmente requiere el sacrificio de los ratones experimentales. Importante, este protocolo puede ser aplicado en prácticamente cualquier punto de tiempo dado y puede ser utilizado repetidamente durante el curso de la enfermedad10,11. Además, en contraste con el uso de enfoques dependientes de bioluminiscencia, ninguna medida laboral intensa y laboriosa como entrecruzar genéticamente modificado ratones se requieren y, por lo tanto, la metodología puede ser aplicada en prácticamente cualquier línea de ratón de interés.
Tomados en conjunto, dado el punto de vista clínico perjudicial de pacientes allo-HCT con GvHD intestinal severo, rápido progreso científico y una visión más clara en los mecanismos moleculares subyacentes la patogenesia inmune están urgente. Asimismo, importantes consideraciones éticas exigen que el aumento de los conocimientos debe lograrse con el uso de la mínima cantidad de ratones experimentales. Por lo tanto, ambos reconocieron reclamaciones en la comunidad de investigación explorando GvHD intestinal se pueden avanzar mediante la aplicación de evaluaciones seriales mini-endoscópica del colon en la cadena de trabajo experimental para supervisar y GvHD intestinal en vivo ratón experimental del grado modelos, descrito y validado en el protocolo presentado aquí.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1249px;" width="1249">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator</td>
			<td style="width:216px;">Gamma-Service Meical GmbH</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:479px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Phosphate-buffered saline (PBS )</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>D8662-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>R8758-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Hypodermic needle (26G)</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">1 mL syring</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:152px;">9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">50 mL tube</td>
			<td style="width:216px;">Sarstedt Ag &#38; Co.KG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Cell strainer with a 40 &#181;m mesh screen</td>
			<td style="width:216px;">BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td style="width:152px;">11209</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">8043.2</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td style="width:152px;">1,048,540,500</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pan T Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-095-130</td>
			<td>magnet cell separation to isolate splenic T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>109822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>110730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Filtrated bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Pan Biotec</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>ingredient of FACS buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well polystyrene V-bottom plates</td>
			<td style="width:216px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">651201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:152px;">352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSRFortessa II flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Insulin syringe with sterile interior (30G)</td>
			<td style="width:216px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:152px;">324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Oxy Vet Oxymat 3</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>oxygen concentrator&#160; for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">NarkoVet&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">213062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Plexiglass chamber&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">214620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Straight Forward Telescope</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>64301 AA</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protection and Examination Sheath</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 C</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Examination Sheath with working channel</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 D</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Biopsy Forceps</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">61071 ZJ&#160;</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;175 Watt SCB XenonLight Source</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">20132120</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber Optic Light Cable</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">495 NL</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 S3 Camera Head</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22220030</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 SCB Camera Control Unit</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22200020</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">LCD monitor</td>
			<td style="width:216px;">Olympus</td>
			<td>OEV181H</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forane / Isofluran</td>
			<td>AbbVie Inc.&#160;</td>
			<td>B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution 37 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">7398.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5,0 mL Dispenser tip&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eppendorf AG</td>
			<td align="right">30089456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice

Agudo injerto - versus - host disease (GvHD) representa la complicación más severa que los pacientes previamente sometidos a cara de (allo-HCT) del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas y se asocia frecuentemente con un resultado clínico pobre. Mientras que, por ejemplo, GvHD manifestaciones de la piel generalmente responden a terapias inmune supresora establecidas y, por lo tanto, no tienen un curso fatal, la presencia y la intensidad de la GvHD intestinal, especialmente de las partes de la mitad inferior del intestino, influir fuertemente en el resultado y en general la supervivencia de pacientes con agudo GvHD. opciones terapéuticas son esencialmente se limita a los clásicos agentes inmune supresora rendimiento sólo moderados efectos atenuantes de la enfermedad. Por lo tanto, un conocimiento detallado sobre la cascada inmune reside en el tejido, cambios en la microbiota intestinal y la respuesta estromal anterior, sobre y después de la aparición de EICH intestinal se necesitan urgentemente para entender los acontecimientos y los mecanismos que subyacen a su patogenesia y desarrollar opciones terapéuticas innovadoras. Modelos murinos de GvHD se emplean con frecuencia para identificar y evaluar funcionalmente las moléculas y vías de conducción supuestamente GvHD intestinal. Sin embargo, significa específicamente monitorear y evaluar inflamación intestinal con el tiempo esencialmente faltan desde puntuaciones establecidas para evaluar grado de EICH aguda habitualmente se componen de diversos parámetros que reflejan más bien sistémica GvHD manifestaciones. La evaluación detallada de GvHD intestinal ha sido restringida a estudios utilizando ratones eutanasia, exclusión de tal modo esencialmente longitudinal (es decir, cinética) análisis del compartimiento del colon bajo una determinada condición experimental (por ejemplo, anticuerpo-mediada bloqueo de una citocina proinflamatoria) en ratones vivos (es decir, en vivo). La evaluación in situ mini-endoscópica del colon distal de ratones tratados con HCT de allo que se describe aquí permite a) una evaluación macroscópica detallada de diferentes aspectos de la inflamación intestinal y b) la opción de recoger muestras de tejido para análisis posteriores en diferentes momentos a lo largo del período de observación. En general, el enfoque endoscópico mini proporciona un gran avance en evaluación de GvHD intestinal y monitoreo no invasivo preclínico.

El protocolo actual, describir la evaluación mini-endoscópica de lesiones asociadas de GvHD intestinales del colon distal, ha sido establecido y validado en ratones sometidos previamente a la inducción sistémica de un modelo de GvHD aguda severa. En este estudio, usamos una clase de MHC unió completamente mal sistema modelo en que BALB/c ratones fueron irradiados letalmente, seguida por el trasplante de médula alogénico t-célula-agotado y por la administración de inducir GvHD all...

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Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Inducción de Intestinal injerto - versus - host Disease y su evaluación Mini-endoscópica en ratones vivos

Aquí, presentamos un protocolo que describe el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas y permite evaluaciones repetitivas mini-endoscópica del colon distal in situ para la presencia, características y severidad de inflamación colónica en vivo ratones de intestinal injerto - versus - host disease.

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

La evaluación minidoscópica del colon en ratones vivos proporciona un apoyo experimental clave para investigar las manifestaciones intestinales de la enfermedad aguda de gráfico contra huésped, GvHD, sobre el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. La evaluación no invasiva de la colitis aguda relacionada con la GvHD puede funcionar como un sustituto de trabajo de la histopatología estándar del oro, lo que hace innecesarios sacrificios animales repetidos para obtener especímenes de tejido. Demostrando el procedimiento estará Vera Buchele, una post-doc de mi laboratorio.Un día después de la irradiación total del cuerpo de los ratones BALB/c receptores, coloque un ratón donante 5B6 SJL vivo de CD-45.1 en la posición propensa sobre una funda de trabajo limpia, y use una punta curvada y serrada de 13 cm de un fórceps de simkin para levantar el pelaje en un talón de Aceshill. Usando tijeras finas endurecidas de 8,5 cm con puntas rectas, incitar la piel entre los fórceps y un talón, alargando la incisión cranialmente para facilitar la eliminación de la piel y el pelaje de las extremidades posteriores. Cuando la piel se haya quitado de las extremidades posteriores, corte cada articulación de la cadera, el tobillo y la rodilla.Almacene el muslo y el vástago de cada extremidad posterior en un único plato de Petri de 92 mm lleno de PVS sobre hielo y retire cuidadosamente tanto músculo como sea posible de cada hueso, transfiriendo cada fémur y tibia limpiados a un tubo de 50 ml de RPMI estéril 1640 medio sobre hielo húmedo. Para aislar la médula ósea, transfiera un hueso a la vez a un nuevo plato de Petri de 92 ml lleno de RPMI 1640 medio fresco, y use un bisturí para cortar los extremos de cada hueso. A continuación, utilice una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de calibre 26 para lavar los huesos con 1 ml de medio fresco a la vez en un tubo de recogida de 50 ml que contenga 5 ml de medio.Cuando todos los huesos han sido lavados, pipetee suavemente las piezas de médula ósea de migas varias veces para generar una suspensión de una sola célula antes de filtrar las células a través de un colador de células de malla de malla de 40 micrómetros en un nuevo tubo de recolección de 50 ml. Pelecila las células por centrifugación y vuelva a suspender las células en 5 ml de tólizar de lyis potán de cloruro de amonio para una incubación de tres minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, detenga la reacción con 10 ml de PVS y centrifugar las células de nuevo.Vuelva a suspender el pellet en 2 ml de PVS fresco para el recuento, y reserve una alícuota de seis veces 10 a la sexta célula para el análisis citométrico de flujo descendente. A continuación, utilice un kit de purificación celular disponible comercialmente para agotar magnéticamente las células T CD90.2 positivas de la suspensión de una sola célula de médula ósea, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y reservar una de cada 10 a la sexta alícuota celular del eluido de células T agotado para el análisis citométrico de flujo descendente de la pureza y composición de la célula antes y después de la separación. Luego, utilice una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de calibre 30 para inyectar cinco veces 10 a las quintas células de médula ósea agotadas por células T en 100 microlitros de PVS por vía intravenosa en el espacio retrobulbar del seno venoso de cada animal receptor irradiado.Al día siguiente, coloque un bazo cosechado de un animal donante en un colador de malla de 40 micrómetros en un tubo de recolección de 50 ml, y utilice un émbolo de jeringa para presionar el tejido del bazo a través del colador en el tubo. Lavar el colador y el émbolo con PVS para recoger todos los esplocitos, y peletizar las células por centrifugación. Después de demostrar la lelisis de glóbulos rojos, vuelva a suspender los glóbulos blancos para el recuento y reserve una seis veces 10 a la sexta celda alícuota para el análisis citométrico de flujo descendente.Para un aislamiento total de células T CD3 positivas del total de esplenocitos, utilice un kit de purificación celular disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y reserve una alícuota de células T de una por 10 a la sexta alícuota de células T CD3 positivas de la fracción celular positiva para el análisis citométrico de flujo descendente de la pureza y composición de la célula antes y después de la separación. Luego, inyecte siete veces 10 a las quintas células T aloreactivas CD3 positivas en 100 microlitros de PVS por vía intravenosa en el espacio de la barra retrobulbar de cada ratón receptor para inducir la GvHD. Para puntuar lesiones relacionadas con la GvHD mediante mini-endoscopia de la región colorrectal distal, levante la cola de un animal receptor justo por encima de la raíz de la cola con una mano, y use la otra mano para insertar cuidadosamente el endoscopio en el recto a través del ano.Mientras la corriente de aire infla el lumen colorrectal, mueva lentamente y cuidadosamente el endoscopio hacia adelante en la dirección aboral. Para evitar lesiones intestinales en el colon, mantenga el endoscopio en la zona media del lumen usando la pantalla de video en vivo para ayudar en este posicionamiento. Comience a grabar la secuencia de vídeo y a puntuar la inflamación, evaluando la inflamación relacionada con GvHD del colon mediante la puntuación de los parámetros como se ilustra.Cuando se haya localizado un punto de puntuación, mueva el endoscopio suavemente y ligeramente hacia adelante y hacia atrás para evaluar los diferentes parámetros. Para evaluar la translucidez del parámetro y la consistencia de las heces, coloque el endoscopio a una distancia más amplia en relación con la pared colónica. Para evaluar la granularidad y vascularidad de la lesión, coloque el endoscopio en la proximidad cercana a la pared colónica y aplique cuidadosamente tensión bien dosificada a la pared colónica con la punta del endoscopio.Una vez completado el proceso de puntuación, detenga la grabación. En comparación con los controles, el trasplante de células madre hematopoyéticas alogénicas como se ha demostrado produce una inducción reproduciblemente robusta de un fenotipo GvHD sistémico, con un aumento progresivo de las puntuaciones clínicas de GvHD en animales receptores. Estos criterios mini-endoscópicamente evaluables se adaptaron específicamente de la colitis singénea previamente notificada en el contexto de parámetros de puntuación de colitis basados en la alo response para la descripción, puntuación y calificación precisas de lesiones asociadas a la enfermedad de GvHD intestinal en el colon distal.De hecho, el sistema de clasificación basado en minidoscópicamente permite una fácil discriminación de los ratones receptores de donantes-linfocitos con signos graves de inflamación intestinal de ratones de control que están esencialmente desprovistos de GvHD. Invalidación del sistema de clasificación minidoscópicamente basado en estudios histopatológicos confirmó que el colon de ratones gravemente afectados por la inflamación relacionada con la GvHD muestra signos histopatológicos igualmente fuertes de inflamación. Por el contrario, los tejidos de colon de los ratones de control mostraron que no se producen, como máximo, signos histopatológicos leves de inflamación, de acuerdo con la ausencia virtual de signos de colitis miniendoscópicamente detectables.Además, los estudios de correlación entre la actividad de colitis evaluada en minidoscópica e histopatológicamente y las puntuaciones sistémicas de GvHD demuestran que las puntuaciones de inflamación colónica asociadas a la GvHD de grado medio a superior se obtienen de la gradación histopatológica. Además, la gravedad de la GvHD intestinal evaluada endoscópicamente muestra una correlación con la actividad sistémica de la enfermedad por hección de televisión por asalariado. Para estandarizar los resultados de la evaluación minidoscópica de la inflamación colónica y garantizar la comparabilidad entre diferentes ratones y experimentos a lo largo del tiempo, se debe seleccionar un sitio anatómico definido para la puntuación.Además de puntuar la inflamación colónica, el canal de trabajo incorporado dentro de la configuración minidoscópica permite la recuperación de biopsias de tejido guiadas por visión aplicables a diversos análisis posteriores, como la histopatología estándar. Debido a la naturaleza no invasiva de la mini-endoscopia, la colitis aguda relacionada con la GvHD se puede evaluar repetidamente dentro del mismo animal en prácticamente cualquier momento, lo que produce información fascinante sobre la GvHD intestinal.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

La inducción de la hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Investigación

Inmunología e Infección

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

La inducción de la enfermedad de injerto contra huésped y<em&gt; En Vivo</em&gt; T Monitoreo Celular Utilizando un modelo murino MHC de concordancia

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

La inducción de una respuesta inflamatoria en la Primaria hepatocitos culturas de ratones

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Evaluación de la citotóxica y efectos inmunomoduladores de sustancias en lonchas de pulmón humano de precisión de corte

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Inducción y puntuación de la enfermedad de injerto-versus-huésped en un modelo de murina xenógeno y cuantificación de células T humanas en tejidos de ratón utilizando PCR digital

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Inducción de hepatitis autoinmune inducida por fármacos en ratones BALB/c para el estudio de sus mecanismos patógenos

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Plataforma de trasplante de médula ósea para investigar el papel de las células dendríticas en la enfermedad de injerto contra huésped

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...