Name: induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice
Uploaded: 2019-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

Denna studie stöddes av Collaborative Research Center (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; projekt B03) (att K.H.) och CRC 1181 (CRC-DFG, projektet B05) (att K.H.), båda finansierade av den Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG, tyska Research Foundation).

De experimentella metoder som beskrivs här har godkänts av regeringen i Mittelfranken, Bayern, Tyskland.
1. GvHD induktion
<ol><li>Dag 0: Helkropps bestrålning av mottagarens möss
	<ol>
<li>Använda kvinnliga CD45.2+ H2kd+ BALB/c möss som är minst 10 veckor gammal som mottagare.</li>
		<li>Väga och registrera vikten av mottagarens mössen före GvHD induktion. Obs: Kontrollera att mottagaren har en minimal kroppsvikt på 20 g....

<ol>
	<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+pathogenesis+of+graft-versus-host+disease.">Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease.</a> British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).</li><li>Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+GvHD:+pathogenesis+and+classification.">Acute GvHD: pathogenesis and classification.</a> Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).</li><li>Naymagon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+graft-versus-host+disease+of+the+gut:+considerations+for+the+gastroenterologist.">Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14, 711-726 (2017).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation.</a> Blood. 127, 3117-3126 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Anthony, B. A., Hadley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+graft-versus-host+disease+and+in+vivo+T+cell+monitoring+using+an+MHC-matched+murine+model.">Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).</li><li>Beilhack, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+acute+graft-versus-host+disease+by+blocking+T-cell+entry+to+secondary+lymphoid+organs.">Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs.</a> Blood. 111, 2919-2928 (2008).</li><li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+colonoscopy+in+live+mice.">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).</li><li>Buchele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Inflammatory+T+Helper+Cells+via+Retinoic+Acid-Related+Orphan+Receptor+Gamma+t+Is+Ineffective+to+Prevent+Allo-Response-Driven+Colitis.">Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).</li><li>Ullrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BATF-dependent+IL-7RhiGM-CSF++T+cells+control+intestinal+graft-versus-host+disease.">BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).</li><li>Kaplan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+antigens+determine+graft-versus-host+disease+phenotype.">Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype.</a> Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).</li></ol>

Protokollet beskrivs metodiken för induktion och mini-endoskopisk bedömning av kolon fenotypen observerats i samband med intestinal GvHD. Det tjänar bredare syftet gör det möjligt för forskare att studera intestinal GvHD längdriktningen och noninvasivt över hela sjukdomsförloppet (dvs från uppkomsten av kolon manifestation och progression tills maximal sjukdomens aktivitet).
Det finns dock några kritiska steg och viktiga begränsningar inneboende presenteras metoder experimenter beh...

Hematopoetiska maligniteter som direkt följer av hematopoetiska stamceller facket och okontrollerad, finns snabbt framåt, och svåra immunmedierade sjukdomar ofta indikationer att utföra allo-HCT1,2. Även om redovisning för förekomsten av prognostisk gynnsamma graft-versus-tumör svar, är givare lymfocyter dock ofta inducera och främja en oönskad immunmedierade attack av frisk vävnad komponenter inom allo-HCT mottagaren , en process som kallas graft - versus - host sjukdom3. Manifestationer i tarmen, den så kallade intestinal GvHD, representerar den mest fruktade komplikationen av akut GvHD, svåra former som är rutinmässigt associerade med en hög dödlighet1,2,4.
Övergripande, murina modeller allo-HCT har dykt upp som ovärderligt verktyg för att identifiera och studera immunomedierade mekanismer bakom patogenesen av GvHD5. Kinetic bedömning av, exempelvis positiva effekterna av nya terapeutiska insatser över tid i levande möss rutinmässigt bygger dock på bestämning av kliniska GvHD noter6. Medan dessa noter är lämpliga att reflektera, exempelvis den totala sjukdomsbördan (dvs. den systemiska GvHD), kliniska noter brist på känslighet för att tillförlitligt spegel organ-specifika manifestationer (t.ex., i tarmen). Slutsatser, exempelvis med avseende på gut-skyddande effekter av en viss terapeutisk intervention, som baseras på dessa scoring system vanligtvis faller därför kort.
Trots stora framsteg genom uppfinningen av romanen hela kroppen imaging modaliteter i kombination med användning av antingen självlysande eller fluorescerande genetiska mus modeller7,8, metoder att direkt och specifikt bedöma den intestinala manifestation av GvHD i levande möss saknas. Logiken bakom protokollet endoskopiska bedömningen av intestinal GvHD fenotypen beskrivs i nästa avsnitt är därför att övervinna detta hinder. Dessutom motivation är också att minska mängden experimentella möss eftersom hittills, en detaljerad bedömning av cellulära, morfologiska och molekylära egenskaper (t.ex., av histopatologi eller molekylärbiologi) av intestinal GvHD manifestationen har slutligen krävs offrandet av experimentella musen.
Vår institution har tidigare rapporterat om metodiken för en mini-endoskopisk bedömning av kolon manifestationer i samband med syngena kolit modeller9. I protokollet presenteras här, har vi förfinat och anpassat den colonoscopic scoring matris för alloresponse-driven kolit i levande möss med intestinal GvHD vid transplantation av alloreactive HCT och givare lymfocyter i en MHC klass jag helt felaktigt inställning . Vi har identifierat fyra parametrar lämplig att återspegla intestinal GvHD-relaterade kolon lesioner. Dessutom har vi etablerat ett system som tillåter en finjusterad gradering av någon enskild faktor, vilket resulterar i en ny Poäng som lätt informerar läsaren om svårighetsgraden av intestinal GvHD finns i en viss mus vid en given tidpunkt. Histopatologiska analyser bekräftade att en endoskopisk poäng över ett visst tröskelvärde tillförlitligt förutspår måttlig till hög grad vävnadsinflammation. Därav, mini-endoskopisk utvärdering tycks representera en fungerande ersättning för det guldmyntfot histopatologi som rutinmässigt kräver offrandet av de experimentella möss. Allt detta protokoll kan tillämpas praktiskt taget alla given tidpunkt och kan användas flera gånger under loppet av sjukdom10,11. Dessutom i motsats till användningen av Mareld-beroende metoder, inga labor-intensiv och tidskrävande åtgärder som intercrossing genetiskt modified möss krävs och, därmed metoden kan tillämpas på valfri mus rad intresse.
Sammantaget ges skadlig klinisk synvinkel allo-HCT patienter med svår intestinal GvHD, är snabba vetenskapliga framsteg och mer insikt i de molekylära mekanismerna bakom immun patogenesen brådskande. Viktigt, etiska överväganden kräver likaså att förstärkningen av kunskap bör uppnås med användningen av det minimala antalet experimentella möss. Därför erkända både fordringar på forskarvärlden att utforska intestinal GvHD kan förskotteras av genomförandet seriella mini-endoskopisk utvärderingar av tjocktarmen i experimentellt arbete kedjan att övervaka och grad intestinal GvHD i levande experimentella mus modeller, som beskrivs och validerade i protokollet presenteras här.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1249px;" width="1249">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator</td>
			<td style="width:216px;">Gamma-Service Meical GmbH</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:479px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Phosphate-buffered saline (PBS )</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>D8662-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>R8758-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Hypodermic needle (26G)</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">1 mL syring</td>
			<td style="width:216px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:152px;">9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">50 mL tube</td>
			<td style="width:216px;">Sarstedt Ag &#38; Co.KG</td>
			<td align="right" style="width:152px;">62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Cell strainer with a 40 &#181;m mesh screen</td>
			<td style="width:216px;">BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td style="width:152px;">11209</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">8043.2</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td style="width:152px;">1,048,540,500</td>
			<td>ingredient of ACK lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD90.2 MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-049-101</td>
			<td>magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pan T Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-095-130</td>
			<td>magnet cell separation to isolate splenic T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>109822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>110730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)</td>
			<td style="width:216px;">Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Filtrated bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Pan Biotec</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>ingredient of FACS buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well polystyrene V-bottom plates</td>
			<td style="width:216px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">651201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:152px;">352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSRFortessa II flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Insulin syringe with sterile interior (30G)</td>
			<td style="width:216px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:152px;">324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Oxy Vet Oxymat 3</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>oxygen concentrator&#160; for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">NarkoVet&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">213062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Plexiglass chamber&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eickemeyer</td>
			<td align="right">214620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Straight Forward Telescope</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>64301 AA</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protection and Examination Sheath</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 C</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Examination Sheath with working channel</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td>61029 D</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">Biopsy Forceps</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">61071 ZJ&#160;</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;175 Watt SCB XenonLight Source</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">20132120</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber Optic Light Cable</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td style="width:152px;">495 NL</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 S3 Camera Head</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22220030</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image 1 SCB Camera Control Unit</td>
			<td style="width:216px;">KARL STORZ SE &#38;Co KG</td>
			<td align="right">22200020</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:403px;">LCD monitor</td>
			<td style="width:216px;">Olympus</td>
			<td>OEV181H</td>
			<td>part of the experimental setup for colonoscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forane / Isofluran</td>
			<td>AbbVie Inc.&#160;</td>
			<td>B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution 37 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:152px;">7398.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5,0 mL Dispenser tip&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Eppendorf AG</td>
			<td align="right">30089456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal graft-versus-host disease and its mini-endoscopic assessment in live mice

Akut graft - versus - host sjukdom (GvHD) representerar den allvarligaste komplikationen att patienter som tidigare genomgår allogen hematopoetisk stamcellstransplantation (allo-HCT) transplantation ansikte och associeras ofta med en dålig kliniskt resultat. Tag, exempelvis GvHD manifestationer av huden är vanligtvis lyhörda för etablerade immun-undertryckande terapier och, därför, tar inte en dödlig kurs, förekomsten och intensiteten av intestinal GvHD, särskilt av mitten av-till-nedre delar av tarmen, påverka starkt utfallet och totala överlevnaden hos patienter med akut GvHD. terapeutiska alternativ är i huvudsak begränsade till klassiska immun-undertryckande agenter ger endast måttlig sjukdom-förmildrande effekter. Därför detaljerad kunskap om vävnad boförälder immun kaskad, förändringar i den intestinala bakterieflora, och stromal svaret före, vid och efter intestinal GvHD uppkomsten är mycket angeläget att förstå händelser och mekanismerna bakom dess patogenes och utveckla innovativa terapeutiska alternativ. Murina modeller av GvHD är ofta anställda att identifiera och bedöma funktionellt molekyler och vägar förment körning intestinal GvHD. Dock saknas innebär att särskilt övervaka och utvärdera tarminflammation med tiden i huvudsak eftersom etablerade poängen att bedöma och klassificera akut GvHD rutinmässigt består av olika parametrar som snarare speglar systemisk GvHD manifestationerna. Detaljutvärderingen av intestinal GvHD har varit begränsad till studier med euthanized möss, därmed i huvudsak exklusive längsgående (dvs rörelseenergi) analyser av kolon utrymmet under ett givet experimentella villkor (t.ex. antikroppsmedierad blockad av en proinflammatoriska cytokiner) i levande möss (dvs. in vivo). Mini-endoskopisk jordbaserad bedömningen av distala kolon av allo-HCT-behandlade möss beskrivs här tillåter en) en utförlig makroskopisk bedömning av olika aspekter av tarminflammation och b) möjlighet att samla vävnadsprover för nedströms analyser på olika tidpunkter under loppet av observationsperioden. Sammantaget ger den mini-endoskopisk metoden ett stort framsteg i prekliniska icke-invasiv övervakning och bedömning av intestinal GvHD.

Det nuvarande protokollet, som beskriver den mini-endoskopisk utvärderingen av intestinal GvHD-associerade lesioner av distala tjocktarmen, har fastställts och godkänts i möss som tidigare utsatts för systemisk induktion av en svår akut GvHD modell. I denna studie använde vi en MHC klass jag helt felaktigt modellsystem som BALB/c möss var dödligt bestrålade, följt av transplantation av T-cell-utarmat allogen benmärg ochav GvHD-inducerande alloreactive C57BL/6 CD3 administ...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice at JoVE.com

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Induktion av Intestinal Graft - versus - host sjukdom och dess Mini-endoskopisk bedömning i levande möss

Här presenterar vi ett protokoll som beskriver allogen hematopoetisk stamcellstransplantation och tillåter repetitiva mini-endoskopisk utvärderingar av distala kolon på plats för närvaro, egenskaper och svårighetsgrad av kolon inflammation inom live möss som lider av intestinal graft - versus - host sjukdom.

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Mini-endoskopisk utvärdering av tjocktarmen i levande möss ger viktiga experimentella stöd för att undersöka intestinala manifestationer av akut graf-versus-host sjukdom, GvHD, på allogena, hematopoietic stamcellstransplantation. Den icke-invasiva bedömningen av akut GvHD-relaterade kolit kan fungera som en fungerande substitut för guldmyntfoten histopatologi, därigenom göra upprepade djur offer för att erhålla vävnad exemplar onödiga. Demonstrerar proceduren blir Vera Buchele, en post-doc från mitt laboratorium.En dag efter total-body bestrålning av mottagaren BALB/ c möss, placera en CD-45.1 levande 5B6 SJL givaren mus i utsatt position på en ren arbetsslinga, och använda en 13-cm böjda och sågtandade spets av en simkin forceps att lyfta pälsen på en Achilles hälen. Använda härdade 8,5-cm fin sax med raka spetsar, incise huden mellan tång och en häl, avlånga snittet kranialt för att underlätta avlägsnande av huden och päls från bakbenen. När huden har tagits bort från bakbenen, skär genom varje höft, fotled, och knäled.Förvara låret och skaftet på varje bakben i en enda 92 mm Petriskål fylld med PVS på is och avlägsna försiktigt så mycket muskler som möjligt från varje ben, och överför varje rengjort lårben och skenben till ett 50-mL-rör av sterilt RPMI 1640 medium på våt is. För att isolera benmärgen, överför ett ben i taget till en ny 92-mL Petri-skål fylld med färskt RPMI 1640 medium, och använd en skalpell för att skära ändarna av varje ben. Därefter använder en 1-mL spruta utrustad med en 26-gauge nål för att spola benen med 1 mL färskt medium i taget i en 50-mL insamlingsrör som innehåller 5 mL medium.När alla ben har spolats, försiktigt pipettera smuliga benmärg bitar upp och ner flera gånger för att generera en encellig suspension innan filtrering cellerna genom en 40-mikrometer mesh-screen cell sil i en ny 50-mL samlingsrör. Pellet cellerna genom centrifugering och åter uppstäng cellerna i 5 mL av ammoniumklorid kaliumlysbuffert för en tre minuters inkubation vid rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen, stoppa reaktionen med 10 mL PVS, och centrifug cellerna igen.Åter upphäva pelleten i 2 mL av färska PVS för räkning, och avsätta en sex gånger 10 till sjätte cellen alikvot för nedströms flöde cytometrisk analys. Därefter använder en kommersiellt tillgänglig cellreningssats för att magnetiskt tömma CD90.2-positiva T-celler från benmärgen encellig suspension, enligt tillverkarens instruktioner, och avsätta en en gånger 10 till den sjätte cellen alikvot av T-cellen-utarmat för nedströms flöde cytometrisk analys av cellen renhet och sammansättning före och efter separation. Använd sedan en 1-mL spruta utrustad med en 30-gauge nål för att injicera fem gånger 10 till den femte T-cells-utarmat benmärg celler i 100 mikroliter av PVS intravenöst i retrobulbar utrymmet i venösa sinus av varje bestrålade mottagardjur.Nästa dag, placera en mjälte skördas från en givare djur på en 40-mikrometer maska sil i en 50-mL insamlingsrör, och använda en spruta kolven för att trycka mjälten vävnaden genom silen i röret. Tvätta silen och kolven med PVS för att samla alla splenocyter, och pellet cellerna genom centrifugeringen. Efter röda blodkroppar lys påvisas, åter avbryta de vita blodkropparna för räkning, och avsätta en sex gånger 10 till den sjätte cellen alikvot för nedströms flöde cytometrisk analys.För en total CD3-positiv T-cellsisolering från totala splenocyter, använd en kommersiellt tillgänglig cellreningssats enligt tillverkarens anvisningar, och avsätt en en gång 10 till den sjätte CD3-positiva T-cells alikvoten från den positiva cellfraktionen för cytometrisk analys nedströms flöde av cellens renhet och sammansättning före och efter separationen. Injicera sedan sju gånger 10 till de femte alloreaktiva CD3-positiva T-cellerna i 100 mikroliter av PVS intravenöst i retrobulbarutrymmet för varje mottagarmus för att inducera GvHD. För att göra poäng GvHD-relaterade skador genom mini-endoskopi av regionen distala kolorektal, lyfta svansen på ett mottagande djur strax ovanför svansroten med ena handen, och använda den andra handen för att försiktigt sätta in endoskopet i ändtarmen via anus.Medan luftströmmen blåses upp kolorektal lumen, sakta och försiktigt flytta endoskopet framåt i aboral riktning. För att undvika colonic tarmskador, hålla endoskopet i mitten området av lumen med hjälp av live video skärmen till stöd i denna positionering. Börja spela in videoströmmen och poängsättning av inflammation, utvärdera GvHD-relaterade inflammation i tjocktarmen genom att göra poäng parametrarna som illustreras.När en poängfläck har lokaliserats flyttar du endoskopet försiktigt och något fram och tillbaka för att bedöma de olika parametrarna. För att bedöma parametern translucens och avföring konsekvens, placera endoskopet på ett bredare avstånd i förhållande till den colonic väggen. För att bedöma lesionens granularitet och vaskularitet, placera endoskopet i närheten av den coloniska väggen, och noggrant applicera väldoserad spänning på den koloniska väggen med spetsen av endoskopet.Efter avslutad poängprocess, stoppa inspelningen. Jämfört med kontroller, allogenic hematopoieic stamcellstransplantation som visat producerar en reproducibly robust induktion av en systemisk GvHD fenotyp, med successivt ökande kliniska GvHD poäng i mottagare djur. Dessa mini-endoskopiskt bedöma kriterier var särskilt anpassade från tidigare rapporterade syngeneic kolit i samband med allo-svar-driven kolit scoring parametrar för den exakta beskrivningen, scoring och gradering av intestinala GvHD-sjukdom-associerade skador i den distala kolon.Det minidoscopically baserade betygssystemet möjliggör en enkel diskriminering av donator-lymfocyter-mottagande möss med allvarliga tecken på tarminflammation från kontroll möss som i huvudsak saknar GvHD. Ogiltighet av mini-endoskopiskt baserade graderingssystem histopatologiska studier bekräftade att tjocktarmen av möss som drabbats hårt av GvHD-relaterade inflammation visa på samma sätt starka histopatologiska tecken på inflammation. Däremot visade kolonvävnader av kontroll möss nej till, på sin plats, milda histopatologiska tecken på inflammation, i samförstånd med den virtuella frånvaron av mini-endoskopiskt detekterbara tecken på kolit.Vidare visar korrelationsstudier mellan mini-endoskopiskt och histopatologiskt bedömd kolitaktivitet och systemisk GvHD-poäng att mini-endoskopiskt fastställt några poäng på mindre än eller lika med tre tillförlitligt förutsäga frånvaron av mitten till högre grad intestinala GvHD-associerade colonic inflammation poäng erhålls från histopatologisk gradering. Dessutom visar svårighetsgraden av den endoskopiskt bedömda intestinala GvHD en korrelation med systemisk GvHD sjukdom verksamhet. För att standardisera resultaten av minidoscopic utvärdering av kolonisk inflammation och för att säkerställa jämförbarhet över olika möss och experiment över tiden, bör en definierad anatomisk webbplats väljas för poängsättning.Förutom scoring colonic inflammation, den inbyggda arbetskanalen inom mini-endoskopisk setup tillåter hämtning av visa-guidad vävnad tarmbiopsier som gäller för olika nedströms analyser, såsom standard histopatologi. På grund av att icke-invasiv karaktär mini-endoskopi, akut GvHD-relaterade kolit kan upprepade gånger bedömas inom samma djur som praktiskt taget helst, och därigenom ger fascinerande insikter i intestinala GvHD.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Induktion av Experimentell Autoimmun Hypophysitis i SJL Möss

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion av transplantat-mot-värd-sjukdom och<em&gt; In Vivo</em&gt; T cell övervakning med en MHC-matchade musmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion av murina tarminflammation med adoptiv överföring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hög</sup&gt; T-celler i möss med immunbrist

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induktion av experimentell autoimmun encefalomyelit hos möss och utvärdering av sjukdomen beroende Distribution av immunceller i olika vävnader

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

En icke-invasiv och tekniskt icke intensiva metod för induktion och fenotypning av experimentell bakteriell lunginflammation hos möss

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

Induktion av ett inflammatoriskt svar i Primär hepatocytkulturer från möss

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Bedömning av den cytotoxiska och immunmodulerande effekter av ämnen i Human Precision-cut Lung skivor

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Induktion och poängsättning av graft-versus-host-sjukdom i en Xenogeneisk murin modell och kvantifiering av humana T-celler i mus vävnader med hjälp av digital PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Induktion av läkemedelsinducerad, autoimmun hepatit hos BALB / c-möss för studier av dess patogena mekanismer

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Bone Marrow Transplantation Plattform för att undersöka rollen av dendritiska celler i Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...