Name: novel sequence discovery by subtractive genomics
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

المؤلفين تقر بيديرمان ميشيل، بيدرسن أليسا وسالدانها جيه كولين لمساعدتها في مشروع الجينوم زيبرا فينش في مراحل مختلفة. ونعترف أيضا بيسك يفغيني للحوسبة العنقودية نظام الإدارة والمعاهد الوطنية للصحة منحة 1K22CA184297 (على J.R.B.) والمعاهد الوطنية للصحة 042767 NS (إلى C.J.S).

1- نوفو دي "تسلسل بدء تجميع"
ملاحظة: أي بيانات الجيل التالي تسلسل (خ ع) يمكن استخدامها، ما دام يمكن أن تنتج جمعية من تلك البيانات. تتضمن بيانات الإدخال المناسبة إيلومينا، باكبيو، أو "نانوبوري أكسفورد" يقرأ مجمعة في ملف فاستا. لواقعية، يصف هذا القسم جمعية على أساس إيلومينا ت?...

<ol>
	<li>Barh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Comparative+Genomics+Analysis+for+Common+Drug+and+Vaccine+Targets+in+Corynebacterium+pseudotuberculosis+and+other+CMN+Group+of+Human+Pathogens.">A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).</li><li>Sarangi, A. N., Aggarwal, R., Rahman, Q., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtractive+Genomics+Approach+for+in+Silico+Identification+and+Characterization+of+Novel+Drug+Targets+in+Neisseria+Meningitides+Serogroup+B.">Subtractive Genomics Approach for in Silico Identification and Characterization of Novel Drug Targets in Neisseria Meningitides Serogroup B.</a> Journal of Computer Science &amp; Systems Biology. 2 (5), (2009).</li><li>Kaur, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Druggable+Targets+for+Acinetobacter+baumannii+Via+Subtractive+Genomics+and+Plausible+Inhibitors+for+MurA+and+MurB.">Identification of Druggable Targets for Acinetobacter baumannii Via Subtractive Genomics and Plausible Inhibitors for MurA and MurB.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 171 (2), 417-436 (2013).</li><li>Rathi, B., Sarangi, A. N., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+subtraction+for+novel+target+definition+in+Salmonella+typhi.">Genome subtraction for novel target definition in Salmonella typhi.</a> Bioinformation. 4 (4), 143-150 (2009).</li><li>Epstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+GBV-D,+a+Novel+GB-like+Flavivirus+from+Old+World+Frugivorous+Bats+(Pteropus+giganteus)+in+Bangladesh.">Identification of GBV-D, a Novel GB-like Flavivirus from Old World Frugivorous Bats (Pteropus giganteus) in Bangladesh.</a> PLoS Pathogens. 6 (7), (2010).</li><li>Kapoor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Rodent+Homologs+of+Hepatitis+C+Virus+and+Pegiviruses.">Identification of Rodent Homologs of Hepatitis C Virus and Pegiviruses.</a> MBio. 4 (2), (2013).</li><li>Biederman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+First+Germline-Restricted+Gene+by+Subtractive+Transcriptomic+Analysis+in+the+Zebra+Finch,+Taeniopygia+guttata.">Discovery of the First Germline-Restricted Gene by Subtractive Transcriptomic Analysis in the Zebra Finch, Taeniopygia guttata.</a> Current Biology. 28 (10), 1620-1627 (2018).</li><li>Readhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Analysis+of+Independent+Alzheimer's+Cohorts+Finds+Disruption+of+Molecular,+Genetic,+and+Clinical+Networks+by+Human+Herpesvirus.">Multiscale Analysis of Independent Alzheimer's Cohorts Finds Disruption of Molecular, Genetic, and Clinical Networks by Human Herpesvirus.</a> Neuron. 99, 1-19 (2018).</li><li>Carroll, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+virome+project.">The global virome project.</a> Science. 359 (6378), 872-874 (2016).</li><li>Pigozzi, M. I., Solari, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+restriction+and+regular+transmission+of+an+accessory+chromosome+that+mimics+a+sex+body+in+the+zebra+finch.+Taeniopygia+guttata.">Germ cell restriction and regular transmission of an accessory chromosome that mimics a sex body in the zebra finch. Taeniopygia guttata.</a> Chromosome Research. 6, 105-113 (1998).</li><li>Itoh, Y., Kampf, K., Pigozzi, M. I., Arnold, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+characterization+of+the+germline-restricted+chromosome+sequence+in+the+zebra+finch.">Molecular cloning and characterization of the germline-restricted chromosome sequence in the zebra finch.</a> Chromosoma. 118, 527-536 (2009).</li><li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+a+songbird.">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li><li>Balakrishnan, C. N., Lin, Y. C., London, S. E., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+transcriptome+analysis+of+male+and+female+zebra+finch+cell+lines.">RNAseq transcriptome analysis of male and female zebra finch cell lines.</a> Genomics. 100, 363-369 (2012).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAR:+a+fast+and+accurate+Illumina+Paired-End+reAd+mergeR.">PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR.</a> Bioinformatics. 30, 614-620 (2014).</li><li>Yang, X., Dorman, K. S., Aluru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reptile:+representative+tiling+for+short+read+error+correction.">Reptile: representative tiling for short read error correction.</a> Bioinformatics. 26, 2526-2533 (2010).</li><li>MacManes, M. D., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+transcriptome+assembly+through+error+correction+of+high-throughput+sequence+reads.">Improving transcriptome assembly through error correction of high-throughput sequence reads.</a> PeerJ. 1 (113), (2013).</li><li>Grabherr, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+transcriptome+assembly+from+RNA-seq+data+without+a+reference+genome.">Full-length transcriptome assembly from RNA-seq data without a reference genome.</a> Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).</li><li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+sequence+reads,+clone+sequences+and+assembly+contigs+with+BWA-MEM.">Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM.</a> arXiv. , (2013).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357-359 (2012).</li><li>Kearse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geneious+Basic:+an+integrated+and+extendable+desktop+software+platform+for+the+organization+and+analysis+of+sequence+data.">Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data.</a> Bioinformatics. 28 (12), 1647-1649 (2012).</li><li>Peirson, S. N., Butler, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+polymerase+chain+reaction.">Quantitative polymerase chain reaction.</a> Methods in Molecular Biology. 362, 349-362 (2007).</li><li>Hunt, M., Kikuchi, T., Sanders, M., Newbold, C., Berriman, M., Otto, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAPR+citation:+REAPR:+a+universal+tool+for+genome+assembly+evaluation.">REAPR citation: REAPR: a universal tool for genome assembly evaluation.</a> Genome Biology. 14 (5), (2013).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mitochondrial+genome+sequence+of+a+hominin+from+Sima+de+los+Huesos.">A mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos.</a> Nature. 505 (7483), 403-406 (2013).</li><li>Gunnarsd&#243;ttir, E. D., Li, M., Bauchet, M., Finstermeier, K., Stoneking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+complete+human+mtDNA+genomes+from+the+Philippines.">High-throughput sequencing of complete human mtDNA genomes from the Philippines.</a> Genome Research. 21 (1), 1-11 (2010).</li><li>King, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+and+high-throughput+massively+parallel+sequencing+of+the+human+mitochondrial+genome+using+the+Illumina+MiSeq.">High-quality and high-throughput massively parallel sequencing of the human mitochondrial genome using the Illumina MiSeq.</a> Forensic Science International: Genetics. 12, 128-135 (2014).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+in+Actinidiaceae:+Genome+Structure+and+Comparative+Analysis.">The First Complete Chloroplast Genome Sequences in Actinidiaceae: Genome Structure and Comparative Analysis.</a> Plos One. 10 (6), (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+of+Five+Epimedium+Species:+Lights+into+Phylogenetic+and+Taxonomic+Analyses.">The Complete Chloroplast Genome Sequences of Five Epimedium Species: Lights into Phylogenetic and Taxonomic Analyses.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oxytricha+trifallax+Mitochondrial+Genome.">The Oxytricha trifallax Mitochondrial Genome.</a> Genome Biologyogy and Evolution. 4 (2), 136-154 (2011).</li><li>Barth, D., Berendonk, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome+sequence+of+the+ciliate+Paramecium+caudatum+reveals+a+shift+in+nucleotide+composition+and+codon+usage+within+the+genus+Paramecium.">The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium.</a> BMC Genomics. 12 (1), (2011).</li><li>Coombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Complete+Sitka+Spruce+Chloroplast+Genome+Using+10X+Genomics'+GemCode+Sequencing+Data.">Assembly of the Complete Sitka Spruce Chloroplast Genome Using 10X Genomics' GemCode Sequencing Data.</a> Plos One. 11 (9), (2016).</li><li>Herschleb, J., Ananiev, G., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis.">Pulsed-field gel electrophoresis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).</li></ol>

حين علم الجينوم الاختزالي قوية، ليس نهجاً قطع كعكة، التي تتطلب التخصيص في العديد من الخطوات الرئيسية، والاختيار الدقيق لتسلسل المرجعية وعينات الاختبار. تصفية الخطوات إذا كانت الجمعية العامة الاستعلام من نوعية رديئة، قد عزل التحف الجمعية فقط. ولذلك، من المهم أن دقة التحقق من الجمعية حي...

والغرض من هذا الأسلوب تحديد هدف رواية (T) الجينوم تسلسل، أما من الحمض النووي الريبي، أو من سياق الجينوم، أو إشارة (R) (الشكل 1). الأسلوب مفيد جداً إذا كان الهدف لا يمكن فصلها ماديا، أو أنها ستكون مكلفة القيام بذلك. فقط بعض الكائنات الانتهاء تماما مورثات للطرح، حيث أحد الابتكارات رئيسية لدينا أسلوب هو مزيج من الحسابية وأساليب مقاعد البدلاء في دورة تمكن الباحثين لعزل تسلسل الهدف عند الإشارة لا تخلو من العيوب، أو مشروع الجينوم من كائن غير نموذجية. في نهاية دورة، يستخدم qPCR اختبار لتحديد ما إذا كانت هناك حاجة إلى الطرح أكثر. سوف تظهر تسلسل المرشحين المصادق عليها تي كشف أكبر إحصائيا في عينات تي-الإيجابية المعروفة ب qPCR.
نفذت التجسيد للأسلوب في اكتشاف المخدرات البكتيرية الأهداف الجديدة التي لم تقم المضيف هومولوجس1،2،،من34 وتحديد الفيروسات رواية من المضيفين المصابة 5،6. بالإضافة إلى تحديد تي، يمكن تحسين الأسلوب r: استخدمنا الأسلوب مؤخرا لتحديد الجينات المفقودة 936 من الجينوم مرجع زيبرا فينش ومورثة جديدة من كروموسوم germline فقط (T)7. علم الجينوم الاختزالي قيمة خاصة عند تي يرجح أن تكون متباينة جداً من تسلسل المعروفة، أو عند هوية تي غير معروف على نطاق واسع، كما هو الحال في كروموسوم مقيدة بالفعل زيبرا فينش7.
التي لا تتطلب تحديد إيجابية من T مسبقاً، مزايا رئيسية للجينوم الاختزالي أنه غير متحيز. في دراسة أجريت مؤخرا، ريدهيد et al. دراسة العلاقة بين مرض الزهايمر ووفرة الفيروسية في أربع مناطق الدماغ. لتحديد الفيروسية، ريادهياد et al. بإنشاء قاعدة بيانات للفيروسات 5158، الحد من شدة عوامل فيروسية يمكن أن تحدد هذه الدراسة. الجينوميات الاختزالي يمكن قد استخدمت للمقارنة بين الأصحاء والجينوم الزهايمر بغية عزل الفيروسات رواية المحتملة المرتبطة بهذا المرض، بغض النظر عن التشابه مع العوامل المعدية المعروفة. بينما هناك 263 الفيروسات المعروفة تستهدف الإنسان، يقدر وجود حوالي 1.67 مليون من الأنواع الفيروسية غير المكتشفة، مع 631,000-827,000 منها يمكن أن تصيب البشر9.
عزل فيروسات جديدة منطقة فيها الاختزالي الجينوميات فعالة بشكل خاص، ولكن بعض الدراسات قد لا تحتاج إلى مثل هذا أسلوب صارمة. على سبيل المثال، دراسات استخدمت الفيروسات رواية تحديد التسلسل الفائق غير متحيزة تليها النسخ العكسي وبلاست لتسلسلات فيروسية5 أو إثراء للأحماض النووية الفيروسية لاستخراج وعكس نسخ تسلسلات فيروسية 6. في حين استخدمت هذه الدراسات تسلسل حيثياته والجمعية، الطرح لم يستخدم لأن تسلسل المستهدفة التي حددت إيجابيا من خلال الانفجار. إذا كانت الفيروسات تماما الرواية ولا يتصل (أو ذات الصلة بعيد) للفيروسات الأخرى، كان علم الجينوم الاختزالي تقنية مفيدة. الاستفادة من علم الجينوم الاختزالي هو أنه يمكن الحصول على تسلسلات جديدة تماما. إذا كان يعرف الجينوم للكائن، يمكن طرح خارجاً بمغادرة أي تسلسلات فيروسية. على سبيل المثال، في دراستنا المنشورة نحن عزل تسلسل فيروسية رواية من زيبرا فينش من خلال الجينوم الاختزالي، على الرغم من أنه ليس لدينا النية الأصلية7.
علم الجينوم الاختزالي أثبت أيضا مفيدة في تحديد أهداف اللقاحات البكتيرية، ودافع عن الارتفاع الكبير في مقاومة المضادات الحيوية1،2،،من34. للتقليل من مخاطر رد فعل المناعة الذاتية، ضاقت الباحثين أهداف اللقاح المحتملة عن طريق طرح أي البروتينات التي قد هومولوجس في المضيف البشري. دراسة خاصة واحدة، تبحث في pseudotuberculosis وتدية، يتم الطرح لجينوم مضيف الفقارية من عدة مورثات بكتيرية التأكد من أن الأهداف المحتملة المخدرات لن يؤثر على البروتينات في المضيفين مما يؤدي إلى آثار جانبية 1-تدفق العمل الأساسي لهذه الدراسات هو لتحميل البروتين البكتيري، تحديد البروتينات الحيوية، إزالة البروتينات الزائدة عن الحاجة، واستخدام بلاستب لعزل البروتينات الأساسية، وبلاستب ضد البروتين المضيف لإزالة أي البروتينات مع المضيف هومولوجس 1 , 2 , 3 , 4-وفي هذه الحالة، علم الجينوم الاختزالي ضمان أن اللقاحات البلدان المتقدمة النمو لن يكون أي آثار خارج الهدف في المضيف1،2،،من34.
استخدمنا الجينوم الاختزالي لتحديد الجينات ترميز البروتين الأولى في تقييد germline كروموسوم (GRC) (في هذه الحالة، تي)، الذي تم العثور عليه في جيرملينيس ولكن الأنسجة الجسدية لا من كلا الجنسين10. قبل هذه الدراسة، كانت المعلومات الجينومية فقط أنه كان يعرف عن GRC منطقة متكررة11. وأجرى الجمعية حيثياته في الجيش الملكي النيبالي متسلسلة من أنسجة المبيض ورؤوس (R + T) من الكبار زيبرا العصافير. أجرى القضاء متواليات حسابية باستخدام المنشورة جسدية (العضلات) الجينوم تسلسل (R1)12، الخام (سانجر) قراءة البيانات (ص2) و جسدية (الدماغ) الترنسكربيتوم (ص3)13. استخدام ثلاث إشارات متتابعة كان يقودها qPCR اختبار في الخطوة 5 لكل دورة (الشكل 2ألف)، تبين أن هناك حاجة إلى تصفية إضافية. وأكد الجين α-الأدوات المكتشفة من خلال قبكر من الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، والاستنساخ وتسلسلها. علينا أن نبدي في مثالنا أن هذا الأسلوب مرنة: أنها لا تعتمد على مطابقة الأحماض النووية (مقابل الحمض النووي الريبي)، ويمكن أن يؤديها هذا الطرح مع المراجع (R) التي تتألف من جمعيات أو يقرأ الخام.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:499px;" width="498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accustart II Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:65px;">Quanta Bio</td>
			<td align="right" style="width:52px;">95141</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST)</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Bowtie 2</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://www.python.org/download/releases/2.7/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">BWA-MEM v. 0.7.12</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geneious</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">PEAR v. 0.9.6</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Personal Computer</td>
			<td style="width:65px;">Biomatters</td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.geneious.com/</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:215px;">PowerSYBR qPCR mix</td>
			<td style="width:65px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:52px;">4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Python v. 2.7</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Reptile v.1.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">Stratagene Mx3005P</td>
			<td style="width:65px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:52px;">401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TransDecoder v. 3.0.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Trinity v. 2.4.0</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel sequence discovery by subtractive genomics

يمكن استخدام علم الجينوم مطروح في أي بحث حيث كان الهدف هو تحديد التسلسل الجيني أو البروتين، أو المنطقة العامة المضمنة في سياق أوسع المجين. علم الجينوم الاختزالي تمكن باحث لعزل تسلسل هدف من الفائدة (T) بترتيب شامل وطرح العناصر الوراثية المعروفة (مرجع, R). يمكن استخدام الأسلوب لتحديد تسلسل الرواية مثل الميتوكوندريا، والمعايشة، والفيروسات، أو germline مقيد الكروموسومات، وهي مفيدة بشكل خاص عندما تي لا يمكن أن تكون معزولة بسهولة من ر. تبدأ مع بيانات الجينوم شاملة (R + T)، الأسلوب يستخدم الأساسية المحلية المحاذاة البحث أداة (الانفجار) ضد سلسلة مرجع، أو تسلسل، لإزالة تسلسل المعروفة المطابقة (R)، تاركة وراءها الهدف (T). للطرح تعمل بشكل أفضل، ينبغي أن يكون البحث والتطوير مشروع مكتمل نسبيا يفتقد ت. منذ متواليات المتبقية بعد الطرح يتم اختبارها من خلال الكمية "تفاعل البوليميراز المتسلسل" (qPCR)، لا يلزم R تكون كاملة لأسلوب العمل. هنا نربط الخطوات الحسابية مع خطوات تجريبية في دوامة الذي يمكن تكراره حسب الحاجة، إزالة متعددة مرجع تسلسل تسلسلياً وصقل البحث عن ت. الاستفادة من علم الجينوم الاختزالي هو أنه يمكن تحديد تسلسل رواية تماما هدف حتى في الحالات التي يتم تنقية المادية صعبة أو مستحيلة أو باهظة الثمن. عيب الأسلوب هو إيجاد مرجع مناسب للطرح والحصول على T-إيجابية وسلبية عينات لاختبار قبكر. يصف لنا تنفيذنا للأسلوب في تحديد الجينات الأولى من كروموسوم مقيدة بالفعل من زيبرا فينش. في هذه الحالة تصفية حسابية تشترك ثلاث إشارات (R)، إزالة تسلسلياً على مدى ثلاث دورات: الجمعية الجينوم ناقصة وبيانات الجينوم الخام والبيانات ترانسكريبتوميك.

وسيكون ملف الإخراج بعد تشغيل الانفجار، قائمة بتسلسل من الاستعلام التي تتطابق مع قاعدة البيانات. بعد الطرح بيثون، عددا من المنظومات تسلسل سيتم الحصول عليها، واختبارها من قبل قبكر. وتناقش النتائج هذه، والخطوات المقبلة، أدناه.
سلبية ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

اكتشاف رواية تسلسل الجينوم مطروح

والغرض من هذا البروتوكول هو استخدام مزيج من الحسابية ومقاعد البدلاء للبحث للبحث عن تسلسل الرواية التي لا يمكن فصلها بسهولة عن تسلسل تنقية المشترك، الذي قد يكون معروفا إلا جزئيا.

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

بروتوكولنا مهم لأنه يمكن استخدامه لتحديد التسلسلات الجينومية التي لا يمكن عزلها عن تسلسلات التنقية المشتركة ، والتي قد تكون معروفة جزئيا فقط. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها غير مكلفة ، وذلك باستخدام برامج مجانية في الغالب التي يمكن تنزيلها وكذلك مرنة. يمكنك تطبيقه على العديد من الأسئلة البيولوجية.وتشمل التطبيقات المحتملة تحديد أهداف اللقاح البكتيرية وتحديد الفيروسات التي تختلف تتابعاتها اختلافاً شديداً عن الميكروبات المعروفة. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام لا يمكن فيه فصل المجهول تجريبيا، طالما أن التسلسل المرجعي دون الهدف الجينومي متاح. هذه التقنية تأخذ بعض التجربة والخطأ، لذلك الصبر مهم.قد تحتاج إلى مشكلة اطلاق النار على البرامج. يمكنك استخدام برامج مختلفة عن تلك التي نصفها هنا. استخدم أدلة المستخدم قدر الإمكان.العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب مفيد لأن العمل الحسابي يعتمد على فهم أساسي لكيفية هيكلة برمجة سطر الأوامر. للبدء، استخدم 0.32 تريدوماتيك لإزالة محولات illumina وقواعد ذات جودة منخفضة. استخدم الإصدار 0.9.11 إنشاء قراءات مدمجة عالية الجودة من القراءة المزاوجة الناتجة عن التشذيب باستخدام المعلمات الافتراضية.ثم استخدم الزواحف الإصدار 1.1 لتصحيح الأخطاء في القراءات التي تم إنتاجها من خلال الكمثرى. وأخيرا استخدام الثالوث الإصدار 2.4.0 في الوضع الافتراضي لتجميع تسلسل تصحيحها. لمكتبات محددة strand، استخدم المعلمة SS_lib_type.الإخراج هو ملف FASTA التي سيتم وضعها في دليل جديد يسمى trinity_output. جعل قاعدة بيانات BLAST التسلسل المرجعي nucleotide_reference. fasta في سطر الأوامر.تطابق BLAST الاستعلام تجميعها إلى قاعدة بيانات المرجع. للحصول على ملف إخراج، استخدم BLAST_results. txt لتوليد الإخراج الجدولية المطلوبة لمعالجة الخطوات subsequence مع البرامج النصية بيثون ، واستخدام outfmt 6 لزيادة اصرامة ، واستخدام تسلسل البروتين من الجمعية كما في استعلام انفجار مع نيوكليوتيد ترجم انفجار ، الذي ينفذ ترجمة سداسية الاتجاه من قاعدة البيانات النيوكليوتيد.للحصول على تسلسلات البروتين للاستعلام، قم بتشغيل TransDecoder. الأمر long0rfs لتحديد أطول فتح إطارات القراءة من تسلسل الاستعلام تجميعها. الآن تشغيل tblastn.إذا لزم الأمر، تأكد من اختيار الشفرة الوراثية الصحيحة للكائن الذي يجري دراسته باستخدام db_gencode مع خيار التعليمات البرمجية المناسبة. إذا كان مرجع عالي الجودة للبروتين متاحًا، استخدم البروتين البروتين المطابق مع blastp بدلاً من tblastn جعل قاعدة بيانات BLAST من مرجع البروتين. تأكد من حفظ النتيجة كملف لمعالجة المتلقين للمعلومات، واستخدم الإخراج الجدولي لضمان تحليل البرامج النصية Python بشكل صحيح.الآن، استخدم البرنامج النصي Python الطرح لإزالة أي تسلسلات مطابقة. لتعيين القراءات إلى التجميع، استخدم BWA-MEM الإصدار 0.7.12 أو 2 القوسي لتعيين القراءة الخام التي تم تحميلها على تجميع الاستعلام. أولاً، فهرسة التجميع ثم تعيين القراءة.سيكون الإخراج تنسيق SAM. تشغيل البرنامج النصي بيثون إزالةاً. py باستخدام ملف SAM كمدخل.هذا تعريف أسماء تسلسل الاستعلام بدون أي قراءة مطابقة وحفظها إلى ملف نصي جديد. إخراج الخطوة السابقة قائمة من أسماء التسلسلات في ملف txt. استخراج ملف FASTA مع هذه التسلسلات.سيكون الإخراج ملف fasta. استخدام عبقرية لتحديد تسلسل التمهيدي الأمثل يدويا. تمييز تسلسل المرشح من 21 إلى 28 أزواج قاعدة التمهيدي إلى الأمام، وتجنب أشواط أربعة أو أكثر من أي قاعدة.محاولة لاستهداف منطقة مع مزيج موحد إلى حد ما من جميع أزواج قاعدة. A G واحد أو C في ثلاثة نهاية رئيس الوزراء مفيد، مما يساعد على ترسيخ التمهيدي. انقر على علامة التبويب إحصائيات على الجانب الأيمن من الشاشة لعرض درجة حرارة الذوبان المقدرة للتسلسل مع تمييز المنطقة المرشحة.تهدف لذوبان درجة الحرارة بين 55 و 60 درجة مئوية، مع تجنب يكرر، والجري الطويل من G C.اختيار التمهيدي العكسي بنفس الطريقة، وتقع 150 إلى 250 قاعدة أزواج ثلاثة رئيس الوزراء من التمهيدي إلى الأمام. في حين أن أطوال التمهيدي لا تحتاج إلى مطابقة، ينبغي أن تكون درجة حرارة الذوبان المتوقعة أقرب ما يمكن إلى أن التمهيدي إلى الأمام. تأكد من عكس تسلسل من خلال النقر بزر الماوس الأيمن في Genius بينما يتم تمييز تسلسل في خيار القائمة.أسلوب بديل هو استخدام الدالة تصميم التمهيدي الذي تم العثور عليه في شريط الأدوات العلوي في إطار تسلسل. إدراج المنطقة لتضخيم تحت المنطقة المستهدفة. تحت علامة التبويب الخصائص، إدراج الحجم المطلوب، ودرجة حرارة الذوبان، وفي المائة G C، ثم انقر فوق موافق أن يكون التمهيديات التي تم إنشاؤها.لإجراء التحقق الكمي PCR من التسلسل المتبقي، أولاً إعداد خليط تفاعل لكل قالب في ثلاثية، مع لدينا SYBR الأخضر ماجستير ميكس، التمهيديات إلى الأمام وعكس، والماء، لحجم إجمالي 25 ميكرولتر. تشغيل برنامج qPCR على علم من درجة الحرارة التي تم التحقق من صحتها سابقا وتمديد الوقت. يجب أن يتم إنشاء منحنيات القذف النهائية على الأقل في المرة الأولى التي يتم فيها استخدام الأقواس التمهيدية في qPCR للتحقق من تضخيم منتج واحد من الحمض النووي.قياس إشارات QPCR SYBR الخضراء نسبة إلى Actin بواسطة Ct لجميع الحالات، وحساب المتوسط، والانحراف المعياري من اثنين إلى Ct نسبة إلى Actin. تنفيذ نقطة النهاية هلام الكهربائية، لتأكيد الكشف عن حجم المنتج الصحيح من قبل qPCR. هنا، تشغيل 25 ميكروليتر من المنتج qPCR مختلطة مع خمس ميكروليتر من صبغة 6X غليترول على هلام 2٪ TAE Agarose في 200 فولت لمدة 20 دقيقة.إذا أظهر qPCR الخاص بك أنك لم تحدد تسلسلات الهدف، كرر الدورة بأكملها مع مرجع جديد، والتي يمكن الحصول عليها من قاعدة بيانات عبر الإنترنت. بدأ المشروع الطرحي في هذه الحالة بتسلسل الحمض النووي الريبي من الأنسجة المبزّنة بالجرثومة من الحمار الوحشي البالغ الذكري والإناث. في نهاية المطاف، تم تحديد 935 جينات جسدية لم تكن مدرجة من قبل في شرح الجينوم بأكمله.بعد التصفية الحسابية، قد تنتج PCR الكمية نتيجة سلبية حيث لم يكن هناك فرق في الكشف عبر أنسجة الطيور. وعلى العكس من ذلك، يتم تأكيد نتيجة إيجابية تمثل تحديد تسلسل الهدف الحقيقي عندما يظهر qPCR الحمض النووي الجينومي كشف أكبر إحصائيا في الأنسجة ذات الاهتمام، نسبة إلى المرجع. هنا، تم التحقق من صحة الجين ألفا المفاجئة لتكون مقيدة على الخط الجرثومي لأنه كان مستنفدا في الأنسجة الجسدية نسبة إلى الحمض النووي الخصية حيث كان حاضرا أن مستويات تعادل أكتين.من المهم أن نتذكر لاستخدام المدخلات الصحيحة خلال كل من الخطوات الحسابية. قد تضطر إلى الانتقال من خلال الطرح دورة عدة مرات من أجل الحصول على تسلسل الهدف أو تسلسل. يمكن إجراء مجموعة متنوعة من التحليل الفيليوجينتيك والهيكلي والوظيفي على الجينات المكتشفة.هذه الأساليب الإضافية تعطي نظرة ثاقبة في الأدوار التطورية والوظيفية للجينات. حددنا الجين الأول على كروموسوم طائر الأغنية المقيد بالجراثيم، والذي وسع الاهتمام بهذا العنصر الجينومي المفاجئ. وأظهرت أعمال لاحقة كروموسومات مماثلة في العديد من أنواع الطيور المغردة التي تحتوي على العديد من الجينات الإضافية.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

النسخ في المختبر فحوصات وتطبيقها في اكتشاف الأدوية

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

رواية عزل-ملزم RNA والبروتينات التي السريع المنهجية

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

اقترانية التزاوج فحوصات لتحليل تسلسل محدد من البروتينات نقل تشارك في الإقتران البكتيرية

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

تحديد المواقع صبغية أمثل لعنصر الحمض النووي في الإشريكيّة القولونية باستخدام نهج ينقول بوساطة جديدة

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

تغذية حمية الدهون عالية وإنتاجية عالية بالانزيم ترياسيلجليسيريدي في Melanogaster المورفولوجية

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

الاعتراف الخاصة بتسلسل وانتقائية بالكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل على الكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل بتعديل كيميائيا الببتيد الأحماض النووية

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

تحليل بيانات تسلسل من دفعة الخميرة 2-الهجين شاشات المعلوماتي

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

تسلسل mRNA من الدم الكامل باستخدام التسلسل نانو

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

التنقل MARRVEL، أداة على شبكة الإنترنت التي تدمج علم الجينوم البشري ونموذج معلومات علم الوراثة الكائن الحي

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

استكشاف مساحة التسلسل لتحديد مواقع الربط للبروتينات الملزمة بالحمض النووي الريبي التنظيمية

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...