Name: novel sequence discovery by subtractive genomics
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

Forfatterne anerkender Michelle Biederman, Alyssa Pedersen og Colin J. Saldanha for deres hjælp med projektets zebrafinke genomforskning på forskellige stadier. Vi anerkender også Evgeny Bisk for computing klynge systemadministration og NIH grant 1K22CA184297 (til J.R.B.) og NIH NS 042767 (til C.J.S).

1. de novo samle starter sekvens
Bemærk: Alle data, næste generations sekvens (NGS) kan bruges, så længe en assembly kan fremstilles af disse data. Passende input data omfatter Illumina, PacBio, eller Oxford Nanopore læser samlet i en fasta fil. For konkrethed, i dette afsnit beskrives en Illumina-baserede transkriptom forsamling specifikke for zebrafinke undersøgelse vi udført7; dog være opmærksom på, at detaljerne vil variere fra projekt. For vores ek...

<ol>
	<li>Barh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Comparative+Genomics+Analysis+for+Common+Drug+and+Vaccine+Targets+in+Corynebacterium+pseudotuberculosis+and+other+CMN+Group+of+Human+Pathogens.">A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).</li><li>Sarangi, A. N., Aggarwal, R., Rahman, Q., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtractive+Genomics+Approach+for+in+Silico+Identification+and+Characterization+of+Novel+Drug+Targets+in+Neisseria+Meningitides+Serogroup+B.">Subtractive Genomics Approach for in Silico Identification and Characterization of Novel Drug Targets in Neisseria Meningitides Serogroup B.</a> Journal of Computer Science &amp; Systems Biology. 2 (5), (2009).</li><li>Kaur, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Druggable+Targets+for+Acinetobacter+baumannii+Via+Subtractive+Genomics+and+Plausible+Inhibitors+for+MurA+and+MurB.">Identification of Druggable Targets for Acinetobacter baumannii Via Subtractive Genomics and Plausible Inhibitors for MurA and MurB.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 171 (2), 417-436 (2013).</li><li>Rathi, B., Sarangi, A. N., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+subtraction+for+novel+target+definition+in+Salmonella+typhi.">Genome subtraction for novel target definition in Salmonella typhi.</a> Bioinformation. 4 (4), 143-150 (2009).</li><li>Epstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+GBV-D,+a+Novel+GB-like+Flavivirus+from+Old+World+Frugivorous+Bats+(Pteropus+giganteus)+in+Bangladesh.">Identification of GBV-D, a Novel GB-like Flavivirus from Old World Frugivorous Bats (Pteropus giganteus) in Bangladesh.</a> PLoS Pathogens. 6 (7), (2010).</li><li>Kapoor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Rodent+Homologs+of+Hepatitis+C+Virus+and+Pegiviruses.">Identification of Rodent Homologs of Hepatitis C Virus and Pegiviruses.</a> MBio. 4 (2), (2013).</li><li>Biederman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+First+Germline-Restricted+Gene+by+Subtractive+Transcriptomic+Analysis+in+the+Zebra+Finch,+Taeniopygia+guttata.">Discovery of the First Germline-Restricted Gene by Subtractive Transcriptomic Analysis in the Zebra Finch, Taeniopygia guttata.</a> Current Biology. 28 (10), 1620-1627 (2018).</li><li>Readhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Analysis+of+Independent+Alzheimer's+Cohorts+Finds+Disruption+of+Molecular,+Genetic,+and+Clinical+Networks+by+Human+Herpesvirus.">Multiscale Analysis of Independent Alzheimer's Cohorts Finds Disruption of Molecular, Genetic, and Clinical Networks by Human Herpesvirus.</a> Neuron. 99, 1-19 (2018).</li><li>Carroll, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+virome+project.">The global virome project.</a> Science. 359 (6378), 872-874 (2016).</li><li>Pigozzi, M. I., Solari, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+restriction+and+regular+transmission+of+an+accessory+chromosome+that+mimics+a+sex+body+in+the+zebra+finch.+Taeniopygia+guttata.">Germ cell restriction and regular transmission of an accessory chromosome that mimics a sex body in the zebra finch. Taeniopygia guttata.</a> Chromosome Research. 6, 105-113 (1998).</li><li>Itoh, Y., Kampf, K., Pigozzi, M. I., Arnold, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+characterization+of+the+germline-restricted+chromosome+sequence+in+the+zebra+finch.">Molecular cloning and characterization of the germline-restricted chromosome sequence in the zebra finch.</a> Chromosoma. 118, 527-536 (2009).</li><li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+a+songbird.">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li><li>Balakrishnan, C. N., Lin, Y. C., London, S. E., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+transcriptome+analysis+of+male+and+female+zebra+finch+cell+lines.">RNAseq transcriptome analysis of male and female zebra finch cell lines.</a> Genomics. 100, 363-369 (2012).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAR:+a+fast+and+accurate+Illumina+Paired-End+reAd+mergeR.">PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR.</a> Bioinformatics. 30, 614-620 (2014).</li><li>Yang, X., Dorman, K. S., Aluru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reptile:+representative+tiling+for+short+read+error+correction.">Reptile: representative tiling for short read error correction.</a> Bioinformatics. 26, 2526-2533 (2010).</li><li>MacManes, M. D., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+transcriptome+assembly+through+error+correction+of+high-throughput+sequence+reads.">Improving transcriptome assembly through error correction of high-throughput sequence reads.</a> PeerJ. 1 (113), (2013).</li><li>Grabherr, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+transcriptome+assembly+from+RNA-seq+data+without+a+reference+genome.">Full-length transcriptome assembly from RNA-seq data without a reference genome.</a> Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).</li><li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+sequence+reads,+clone+sequences+and+assembly+contigs+with+BWA-MEM.">Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM.</a> arXiv. , (2013).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357-359 (2012).</li><li>Kearse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geneious+Basic:+an+integrated+and+extendable+desktop+software+platform+for+the+organization+and+analysis+of+sequence+data.">Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data.</a> Bioinformatics. 28 (12), 1647-1649 (2012).</li><li>Peirson, S. N., Butler, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+polymerase+chain+reaction.">Quantitative polymerase chain reaction.</a> Methods in Molecular Biology. 362, 349-362 (2007).</li><li>Hunt, M., Kikuchi, T., Sanders, M., Newbold, C., Berriman, M., Otto, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAPR+citation:+REAPR:+a+universal+tool+for+genome+assembly+evaluation.">REAPR citation: REAPR: a universal tool for genome assembly evaluation.</a> Genome Biology. 14 (5), (2013).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mitochondrial+genome+sequence+of+a+hominin+from+Sima+de+los+Huesos.">A mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos.</a> Nature. 505 (7483), 403-406 (2013).</li><li>Gunnarsd&#243;ttir, E. D., Li, M., Bauchet, M., Finstermeier, K., Stoneking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+complete+human+mtDNA+genomes+from+the+Philippines.">High-throughput sequencing of complete human mtDNA genomes from the Philippines.</a> Genome Research. 21 (1), 1-11 (2010).</li><li>King, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+and+high-throughput+massively+parallel+sequencing+of+the+human+mitochondrial+genome+using+the+Illumina+MiSeq.">High-quality and high-throughput massively parallel sequencing of the human mitochondrial genome using the Illumina MiSeq.</a> Forensic Science International: Genetics. 12, 128-135 (2014).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+in+Actinidiaceae:+Genome+Structure+and+Comparative+Analysis.">The First Complete Chloroplast Genome Sequences in Actinidiaceae: Genome Structure and Comparative Analysis.</a> Plos One. 10 (6), (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+of+Five+Epimedium+Species:+Lights+into+Phylogenetic+and+Taxonomic+Analyses.">The Complete Chloroplast Genome Sequences of Five Epimedium Species: Lights into Phylogenetic and Taxonomic Analyses.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oxytricha+trifallax+Mitochondrial+Genome.">The Oxytricha trifallax Mitochondrial Genome.</a> Genome Biologyogy and Evolution. 4 (2), 136-154 (2011).</li><li>Barth, D., Berendonk, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome+sequence+of+the+ciliate+Paramecium+caudatum+reveals+a+shift+in+nucleotide+composition+and+codon+usage+within+the+genus+Paramecium.">The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium.</a> BMC Genomics. 12 (1), (2011).</li><li>Coombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Complete+Sitka+Spruce+Chloroplast+Genome+Using+10X+Genomics'+GemCode+Sequencing+Data.">Assembly of the Complete Sitka Spruce Chloroplast Genome Using 10X Genomics' GemCode Sequencing Data.</a> Plos One. 11 (9), (2016).</li><li>Herschleb, J., Ananiev, G., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis.">Pulsed-field gel electrophoresis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).</li></ol>

Mens subtraktiv genomforskning er kraftfuld, er det ikke en cookie-cutter tilgang, der kræver tilpasning på flere vigtige skridt, og omhyggelig udvælgelse af reference sekvenser og prøveemner. Hvis forespørgslen forsamling er af dårlig kvalitet, kan filtrering trin kun isolere forsamling artefakter. Det er derfor vigtigt at grundigt validere de novo forsamlingen ved hjælp af en passende valideringsprotokollen til det konkrete projekt. For RNA-FF. findes retningslinjerne på Trinity hjemmeside<sup class="x...

Formålet med denne metode er at identificere en roman mål (T) genomisk sekvens, enten DNA eller RNA, fra en genomisk kontekst eller en reference (R) (figur 1). Metoden er mest nyttigt, hvis målet ikke kan adskilles fysisk, eller det ville være dyrt at gøre. Kun et par organismer er helt færdig genomer for subtraktion, så en afgørende fornyelse af vores metode er den kombination af beregningsmæssige og bænk metoder i en cyklus, der gør det muligt for forskere at isolere target sekvenser, når henvisningen er ufuldstændig, eller et udkast til genom fra en ikke-model organisme. I slutningen af en cyklus bruges qPCR test til at afgøre, om mere subtraktion er nødvendig. En valideret kandidat T sekvens vil vise statistisk større afsløring i kendte T-positive prøver af qPCR.
Inkarnationer af metoden er blevet gennemført i opdagelsen af nye bakteriel stof mål, der ikke har vært homologs1,2,3,4 og identifikation af nye virus fra inficerede værter 5,6. Ud over identifikation af T, kan metoden, der forbedre R: vi for nylig brugte metoden til at identificere 936 mangler gener fra zebrafinke reference genom og et nyt gen fra en germline-only kromosom (T)7. Subtraktive genomforskning er særlig værdifuld når T forventes at være ekstremt divergerende fra kendte sekvenser, eller når identiteten af T er bredt udefineret, som i zebrafinke germline-begrænset kromosom7.
Ved ikke at kræve positiv identifikation af T på forhånd, er en afgørende fordel af subtraktiv genomforskning, at det er upartisk. I en nylig undersøgelse undersøgt Readhead et al. forholdet mellem Alzheimers sygdom og viral overflod i fire områder af hjernen. For viral identifikation, Readhead et al. oprettet en database over 515 virus8, alvorligt begrænser de virale agenter, som deres undersøgelse kunne identificere. Subtraktive genomforskning kunne have været brugt til at sammenligne den sunde og Alzheimers genomer for at isolere mulige roman virus forbundet med sygdommen, uanset deres lighed med kendte smitstoffer. Mens der er 263 kendte målretning af menneskelige virus, er det blevet anslået at ca 1,67 million uopdagede viral arter findes, med 631,000-827,000 af dem har et potentiale til at inficere mennesker9.
Isolering af nye virus er et område, hvor subtraktiv genomforskning er særligt effektive, men nogle undersøgelser kan ikke behøver sådan en stringent metode. For eksempel, transskribere undersøgelser at identificere nye vira har brugt upartiske høj overførselshastighed sekventering efterfulgt af reverse transkription og BLASTx for viral sekvenser5 eller berigelse af viral nukleinsyrer at udtrække og vende viral sekvenser 6. mens disse undersøgelser ansat de novo sekvensering og forsamling, subtraktion ikke blev brugt, fordi målet sekvenser var positivt identificeret gennem BLAST. Hvis virus var helt nye og ikke relaterede (eller fjernt beslægtede) til andre vira, subtraktiv genomforskning ville have været en nyttig teknik. Fordelen ved subtraktiv genomforskning er, at sekvenser, der er helt ny kan opnås. Hvis den organisme genom er kendt, kan det trækkes ud til at forlade enhver viral sekvenser. For eksempel, i vores offentliggjort undersøgelse isoleret vi en roman viral sekvens fra zebra finke gennem subtraktiv genomforskning, men det ikke var vores oprindelige hensigt7.
Subtraktive genomforskning har også vist sig nyttig i identifikation af bakterielle vaccine mål, motiveret af den dramatiske stigning i antibiotikaresistens1,2,3,4. For at minimere risikoen for autoimmun reaktion, indsnævret forskere de potentielle vaccine mål ved at fratrække alle proteiner, der har homologs i den menneskelig vært. En særlig undersøgelse, ser på Corynebacterium pseudotuberculosis, udført subtraktion af hvirveldyr vært genomer fra flere bakterielle genomer at sikre, at mulige drug mål ikke ville påvirke proteiner til hosts fører til bivirkninger 1. grundlæggende arbejdsflow af disse undersøgelser er at downloade det bakterielle proteomet, bestemme vigtige proteiner, fjerne overflødige proteiner, brug BLASTp til at isolere de væsentlige proteiner, og BLASTp mod vært proteomet for at fjerne enhver proteiner med vært homologs 1 , 2 , 3 , 4. I dette tilfælde subtraktiv genomforskning sikre, at vacciner udviklet ikke har nogen off-target effekter i vært1,2,3,4.
Vi brugte subtraktiv genomforskning til at identificere det første protein-kodning gen på en germline-begrænset kromosom (GRC) (i dette tilfælde, T), som findes i germlines men ikke somatiske væv af begge køn10. Før denne undersøgelse var de kun genomisk oplysninger, der blev kendt om GRC en gentagne region11. De novo Forsamling blev udført på RNA sekventeret fra æggestokken og teste væv (R + T) fra voksne zebrafinker. Den beregningsmæssige afskaffelse af sekvenser blev udført ved hjælp af offentliggjorte somatiske (muskel) genomet sekvens (R1)12, dets rå (Sanger) læse data (R2) og en somatisk (hjernen) transkriptom (R3)13. Sekventiel brugen af tre referencer var drevet af qPCR test på trin 5 for hver cyklus (figur 2A), viser, at yderligere filtrering var påkrævet. Opdaget α-SNAP genet blev bekræftet gennem qPCR fra DNA og RNA, og kloning og sekventering. Vi viser i vores eksempel, at denne metode er fleksibel: det er ikke afhængige af matchende nukleinsyrer (DNA vs RNA) og at subtraktion kan udføres med referencer (R), der består af forsamlinger eller rå læsninger.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:499px;" width="498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accustart II Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:65px;">Quanta Bio</td>
			<td align="right" style="width:52px;">95141</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST)</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Bowtie 2</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://www.python.org/download/releases/2.7/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">BWA-MEM v. 0.7.12</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geneious</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">PEAR v. 0.9.6</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Personal Computer</td>
			<td style="width:65px;">Biomatters</td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.geneious.com/</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:215px;">PowerSYBR qPCR mix</td>
			<td style="width:65px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:52px;">4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Python v. 2.7</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Reptile v.1.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">Stratagene Mx3005P</td>
			<td style="width:65px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:52px;">401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TransDecoder v. 3.0.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Trinity v. 2.4.0</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel sequence discovery by subtractive genomics

Subtraktiv genomforskning kan bruges i enhver forskning, hvor målet er at identificere sekvensen af et gen, protein eller generelle region, der er integreret i en større genomisk sammenhæng. Subtraktive genomforskning giver mulighed for en forsker at isolere en target sekvens af interesse (T) ved omfattende sekvensering og fratrække kendte genetiske elementer (reference, R). Metoden kan bruges til at identificere roman sekvenser som mitokondrier, grønkorn, vira, eller kønscelleoverførsel begrænset kromosomer, og er især nyttig, når T ikke være let isoleret fra R. begynder med den omfattende genomisk data (R + T), metoden bruger grundlæggende lokale justering søgning værktøj (BLAST) mod en reference sekvens, eller sekvenser, for at fjerne de tilsvarende kendte sekvenser (R), efterlader mål (T). For subtraktion til at fungere bedst, bør R være en forholdsvis komplette udkast, som mangler T. Siden sekvenser tilbage efter subtraktion er testet gennem kvantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), behøver R ikke at være komplet metode til at arbejde. Her linker vi beregningsmæssige trin med eksperimentelle skridt ind i en cyklus, der kan være gentog efter behov, sekventielt at fjerne flere reference sekvenser og raffinering søgen efter T. Fordelen ved subtraktiv genomforskning er, at en helt roman target sekvens kan identificeres selv i tilfælde, hvor fysisk rensning er vanskeligt, umuligt eller dyrt. En ulempe ved metoden at finde en passende henvisning til subtraktion og opnå T-positive og negative prøver for qPCR test. Vi beskriver vores gennemførelse af metoden i identifikationen af de første gen fra den germline-begrænset kromosom af zebrafinke. I så fald beregningsmæssige filtrering involveret tre referencer (R), sekventielt fjernet over tre cyklusser: en ufuldstændig genomisk forsamling, genomisk rådata og transkriptom data.

Efter at have kørt BLAST, vil outputfil have en liste af sekvenser fra forespørgslen, der svarer til databasen. Efter Python subtraktion, vil en række opfylder sekvenser blive indhentet, og testet af qPCR. Resultaterne af dette, og næste skridt er diskuteret nedenfor.
Negative resultat. Der er to mulige negative resultater, der kan ses efter BLAST til reference sekvens. Der kan være nogen BLAST resultater, ...

Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Roman sekvens opdagelsen af subtraktiv genomforskning

Formålet med denne protokol er at bruge en kombination af beregningsmæssige og bænk forskning for at finde roman sekvenser, der ikke kan adskilles let fra en co rensende sekvens, som muligvis er kun delvis kendt.

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Vores protokol er vigtig, fordi den kan bruges til at identificere genomiske sekvenser, der ikke kan isoleres fra co-rensende sekvenser, som i sig selv kun kan være delvist kendt. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at det er billigt, ved hjælp af det meste gratis software, der kan downloades samt fleksibel. Du kan anvende det til mange biologiske spørgsmål.Potentielle anvendelser omfatter identifikation af bakterielle vaccinemål og identifikation af virus, hvis sekvenser er ekstremt forskellige fra kendte mikrober. Denne metode kan anvendes på ethvert system, hvor det ukendte ikke kan adskilles eksperimentelt, så længe referencesekvensen uden det genomiske mål er tilgængeligt. Denne teknik tager nogle trial and error, så tålmodighed er vigtig.Du kan få brug for at problemer skyde programmerne. Du kan bruge programmer, der er forskellige fra dem, vi beskriver her. Brug brugervejledningerne så meget som muligt.Visuel demonstration af denne metode er nyttig, fordi beregningsarbejde afhænger af en grundlæggende forståelse af, hvordan programmering af kommandolinjen er struktureret. Til at begynde, skal du bruge Trimmomatic 0,32 til at fjerne illumina adaptere og lav kvalitet baser. Brug Pear version 0.9.11 til at oprette flettede læsninger af høj kvalitet fra trimmomatiske outputparrede læsninger ved hjælp af standardparametre.Brug derefter Reptil version 1,1 til fejl at korrigere læser produceret gennem Pear. Endelig bruge Trinity version 2.4.0 i standard-tilstand for at samle de korrigerede sekvenser. Brug parameteren SS_lib_type til strengspecifikke biblioteker.Outputtet er en FASTA-fil, der vil blive placeret i en ny mappe kaldet trinity_output. Lav en BLAST-database over referencesekvensen nucleotide_reference. fasta på kommandolinjen.BLAST matchede den forespørgsel, der blev samlet i referencedatabasen. Hvis du vil hente en outputfil, skal du BLAST_results. txt Hvis du vil generere det tabeloutput, der kræves til delsekvensbearbejdningstrin med Python-scripts, skal du bruge outfmt 6 For øget stringens skal du bruge proteinsekvenser fra samlingen som BLAST-forespørgslen med oversat nukleotid BLAST, som udfører seksvejsoversættelse af nukleotiddatabasen.Kør TransDecoder for at hente proteinsekvenser for forespørgslen. Kommandoen Long0rfs til at identificere de længste åbne læserammer fra samlede forespørgselssekvenser. Kør nu tblastn.Hvis det er nødvendigt, sikres, at den korrekte genetiske kode vælges for den organisme, der undersøges, ved hjælp af db_gencode med passende kodeindstilling. Hvis der findes en proteinreference af høj kvalitet, skal du bruge proteinproteinmatchning med blastp i stedet for tblastn Lav en BLAST-database over proteinreferencen. Sørg for at gemme resultatet som en fil til downstream-behandling, og brug tabeloutput for at sikre, at Python-scripts kan analysere dem korrekt.Brug nu det subtraktive Python-script til at fjerne eventuelle matchende sekvenser. Hvis du vil knytte læsningerne til samlingen, skal du bruge BWA-MEM Version 0.7.12 eller butterfly 2 til at knytte de hentede rålæsninger til forespørgselssamlingen. Først indekseres assemblyen, og tilknyt derefter læsningerne.Outputtet vil være SAM-format. Kør Python-scriptet removeUnmapped. py ved hjælp af SAM-filen som input.Dette identificerer navnene på forespørgselssekvenser uden at matche læser og gemmer dem i en ny tekstfil. Outputtet af det forrige trin er en liste over sekvensnavne i en txt-fil. Udpak en FASTA-fil med disse sekvenser.Outputtet vil være en fasta fil. Brug Genius til at bestemme optimale primersekvenser manuelt. Fremhæv en kandidatsekvens på 21 til 28 basispar til den forreste primer, så du undgår kørsler på fire eller flere af basen.Prøv at målrette en region med en nogenlunde ensartet kombination af alle base par. En enkelt G eller C på tre Prime End er gavnligt, bidrage til at forankre primer. Klik på fanen Statistik i højre side af skærmen for at se sekvensens anslåede smeltetemperatur, når kandidatregionen er fremhævet.Målet for en smeltetemperatur mellem 55 og 60 grader Celsius, samtidig med at du undgår gentagelser, og lange kørsler af G C.Choose en omvendt primer på samme måde, der ligger 150 til 250 base par tre prime af den forreste primer. Mens primer længder ikke behøver at matche, den forventede smeltetemperatur bør være så tæt som muligt på den forreste primer. Sørg for at vende supplere sekvensen ved at højreklikke i Genius, mens en sekvens er fremhævet i en menuindstilling.En alternativ metode er at bruge funktionen Primer Design, som findes på den øverste værktøjslinje i vinduet Sekvens. Indsæt området for at forstærke under Målområde. Indsæt den ønskede størrelse, smeltetemperatur og G C under fanen Egenskaber, og klik derefter på OK for at få primere genereret.For at udføre kvantitativ PCR validering af den resterende sekvens, først forberede en reaktion blanding for hver skabelon i tre eksemplarer, med vores SYBR Green Master Mix, frem og tilbage primere, og vand, for et samlet volumen på 25 mikroliter. Kør et qPCR-program, der er informeret af den tidligere validerede temperatur og forlængelsestid. Endelige denatureringskurver bør genereres mindst første gang primers er ansat i qPCR til at validere forstærkning af et enkelt DNA-produkt.Mål qPCR SYBR Green-signalerne i forhold til Actin af Ct For alle tilfælde skal du beregne den gennemsnitlige og standardafvigelse på to til Ct i forhold til Actin. Udfør endpoint gel elektroforese, for at bekræfte korrekt produktstørrelse detektion af qPCR. Her køres 25 mikroliter af qPCR-produktet blandet med fem mikroliter 6X Glitterol farvestof på en 2% TAE Agarose gel ved 200 volt i 20 minutter.Hvis din qPCR viser, at du ikke har identificeret målsekvenserne, skal du gentage hele cyklussen med en ny reference, som kan fås fra en onlinedatabase. Det subtraktive projekt i dette tilfælde startede med sekventering af RNA fra kim-foret væv af mandlige og kvindelige voksne zebrafinke. I sidste ende blev 935 somatiske gener, som ikke tidligere var inkluderet i hele genomanmærkningen, identificeret.Efter beregningsfiltrering kan kvantitativ PCR give et negativt resultat, hvor der ikke var nogen forskel i påvisning på tværs af fuglevæv. Omvendt bekræftes et positivt resultat, der repræsenterer identifikationen af en True Target Sequence, når genomisk DNA qPCR viser statistisk større påvisning i det væv af interesse, i forhold til referencen. Her blev alfasnap-genet valideret til at være kønsbegrænset, fordi det var udtømt i somatiske væv i forhold til testiklernes DNA, hvor det var til stede, at niveauer svarende til Actin.Det er vigtigt at huske at bruge de korrekte indgange under hvert af beregningstrinnene. Du skal muligvis gennemgå cyklusns subtraktion flere gange for at opnå målsekvensen eller sekvenserne. En række fylogenetiske, strukturelle og funktionelle analyser kan udføres på de fundne gener.Disse yderligere metoder giver indsigt i genernes evolutionære og funktionelle roller. Vi identificerede det første gen på et bakteriebegrænset sangfuglkromosom, som udvidede interessen for dette overraskende genomiske element. Efterfølgende arbejde viste lignende kromosomer i mange sangfuglarter, der indeholdt mange ekstra gener.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro-transskription Analyser og deres anvendelse i Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Novel RNA-bindende proteiner Isolering af den hurtige metode

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugering Parring Analyser for Sekvens-specifik analyse af Transfer proteiner involveret i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse af Optimal kromosomale placering for en DNA Element i Escherichia coli ved hjælp af en roman Transposon-medieret tilgang

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Høj fedt diæt fodring og High Throughput Triacylglyceride Assay i Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sekvens-specifikke og selektiv anerkendelse af dobbelt-strenget RNA'er over enkeltstrenget RNA'er af kemisk modificerede peptid nukleinsyrer

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

IT analyse af sekvens Data fra Batch gær 2-Hybrid skærme

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering af mRNA fra fuldblod ved hjælp af Nanopmalm sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Navigering MARRVEL, et webbaseret værktøj, der integrerer menneskelig Genomics og model organisme genetik information

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Udforskning sekvens plads til at identificere bindende sites for regulerende RNA-bindende proteiner

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...