Name: novel sequence discovery by subtractive genomics
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

De auteurs erkennen Michelle Biederman, Alyssa Pedersen en Colin J. Saldanha voor hun hulp bij de Zebravink genomics project in verschillende stadia. We erkennen ook Evgeny Bisk voor het berekenen van cluster Systeembeheer en NIH grant 1K22CA184297 (voor J.R.B.) en NIH NS 042767 (voor C.J.S).

1. DOVO monteren beginnen volgorde
Opmerking: Alle gegevens van Next-Generation reeks (NGS) kan worden gebruikt, zolang een vergadering kan worden geproduceerd uit die gegevens. Geschikte invoergegevens omvat Illumina, PacBio, of Oxford Nanopore geassembleerd in een fasta bestand leest. Voor concreet, hier beschreven een vergadering Illumina gebaseerde transcriptomic specifiek voor de Zebravink studie uitgevoerd we7; maar let erop dat de specifieke kenmerken per ...

<ol>
	<li>Barh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Comparative+Genomics+Analysis+for+Common+Drug+and+Vaccine+Targets+in+Corynebacterium+pseudotuberculosis+and+other+CMN+Group+of+Human+Pathogens.">A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).</li><li>Sarangi, A. N., Aggarwal, R., Rahman, Q., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtractive+Genomics+Approach+for+in+Silico+Identification+and+Characterization+of+Novel+Drug+Targets+in+Neisseria+Meningitides+Serogroup+B.">Subtractive Genomics Approach for in Silico Identification and Characterization of Novel Drug Targets in Neisseria Meningitides Serogroup B.</a> Journal of Computer Science &amp; Systems Biology. 2 (5), (2009).</li><li>Kaur, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Druggable+Targets+for+Acinetobacter+baumannii+Via+Subtractive+Genomics+and+Plausible+Inhibitors+for+MurA+and+MurB.">Identification of Druggable Targets for Acinetobacter baumannii Via Subtractive Genomics and Plausible Inhibitors for MurA and MurB.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 171 (2), 417-436 (2013).</li><li>Rathi, B., Sarangi, A. N., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+subtraction+for+novel+target+definition+in+Salmonella+typhi.">Genome subtraction for novel target definition in Salmonella typhi.</a> Bioinformation. 4 (4), 143-150 (2009).</li><li>Epstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+GBV-D,+a+Novel+GB-like+Flavivirus+from+Old+World+Frugivorous+Bats+(Pteropus+giganteus)+in+Bangladesh.">Identification of GBV-D, a Novel GB-like Flavivirus from Old World Frugivorous Bats (Pteropus giganteus) in Bangladesh.</a> PLoS Pathogens. 6 (7), (2010).</li><li>Kapoor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Rodent+Homologs+of+Hepatitis+C+Virus+and+Pegiviruses.">Identification of Rodent Homologs of Hepatitis C Virus and Pegiviruses.</a> MBio. 4 (2), (2013).</li><li>Biederman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+First+Germline-Restricted+Gene+by+Subtractive+Transcriptomic+Analysis+in+the+Zebra+Finch,+Taeniopygia+guttata.">Discovery of the First Germline-Restricted Gene by Subtractive Transcriptomic Analysis in the Zebra Finch, Taeniopygia guttata.</a> Current Biology. 28 (10), 1620-1627 (2018).</li><li>Readhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Analysis+of+Independent+Alzheimer's+Cohorts+Finds+Disruption+of+Molecular,+Genetic,+and+Clinical+Networks+by+Human+Herpesvirus.">Multiscale Analysis of Independent Alzheimer's Cohorts Finds Disruption of Molecular, Genetic, and Clinical Networks by Human Herpesvirus.</a> Neuron. 99, 1-19 (2018).</li><li>Carroll, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+virome+project.">The global virome project.</a> Science. 359 (6378), 872-874 (2016).</li><li>Pigozzi, M. I., Solari, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+restriction+and+regular+transmission+of+an+accessory+chromosome+that+mimics+a+sex+body+in+the+zebra+finch.+Taeniopygia+guttata.">Germ cell restriction and regular transmission of an accessory chromosome that mimics a sex body in the zebra finch. Taeniopygia guttata.</a> Chromosome Research. 6, 105-113 (1998).</li><li>Itoh, Y., Kampf, K., Pigozzi, M. I., Arnold, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+characterization+of+the+germline-restricted+chromosome+sequence+in+the+zebra+finch.">Molecular cloning and characterization of the germline-restricted chromosome sequence in the zebra finch.</a> Chromosoma. 118, 527-536 (2009).</li><li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+a+songbird.">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li><li>Balakrishnan, C. N., Lin, Y. C., London, S. E., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+transcriptome+analysis+of+male+and+female+zebra+finch+cell+lines.">RNAseq transcriptome analysis of male and female zebra finch cell lines.</a> Genomics. 100, 363-369 (2012).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAR:+a+fast+and+accurate+Illumina+Paired-End+reAd+mergeR.">PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR.</a> Bioinformatics. 30, 614-620 (2014).</li><li>Yang, X., Dorman, K. S., Aluru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reptile:+representative+tiling+for+short+read+error+correction.">Reptile: representative tiling for short read error correction.</a> Bioinformatics. 26, 2526-2533 (2010).</li><li>MacManes, M. D., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+transcriptome+assembly+through+error+correction+of+high-throughput+sequence+reads.">Improving transcriptome assembly through error correction of high-throughput sequence reads.</a> PeerJ. 1 (113), (2013).</li><li>Grabherr, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+transcriptome+assembly+from+RNA-seq+data+without+a+reference+genome.">Full-length transcriptome assembly from RNA-seq data without a reference genome.</a> Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).</li><li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+sequence+reads,+clone+sequences+and+assembly+contigs+with+BWA-MEM.">Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM.</a> arXiv. , (2013).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357-359 (2012).</li><li>Kearse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geneious+Basic:+an+integrated+and+extendable+desktop+software+platform+for+the+organization+and+analysis+of+sequence+data.">Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data.</a> Bioinformatics. 28 (12), 1647-1649 (2012).</li><li>Peirson, S. N., Butler, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+polymerase+chain+reaction.">Quantitative polymerase chain reaction.</a> Methods in Molecular Biology. 362, 349-362 (2007).</li><li>Hunt, M., Kikuchi, T., Sanders, M., Newbold, C., Berriman, M., Otto, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAPR+citation:+REAPR:+a+universal+tool+for+genome+assembly+evaluation.">REAPR citation: REAPR: a universal tool for genome assembly evaluation.</a> Genome Biology. 14 (5), (2013).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mitochondrial+genome+sequence+of+a+hominin+from+Sima+de+los+Huesos.">A mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos.</a> Nature. 505 (7483), 403-406 (2013).</li><li>Gunnarsd&#243;ttir, E. D., Li, M., Bauchet, M., Finstermeier, K., Stoneking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+complete+human+mtDNA+genomes+from+the+Philippines.">High-throughput sequencing of complete human mtDNA genomes from the Philippines.</a> Genome Research. 21 (1), 1-11 (2010).</li><li>King, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+and+high-throughput+massively+parallel+sequencing+of+the+human+mitochondrial+genome+using+the+Illumina+MiSeq.">High-quality and high-throughput massively parallel sequencing of the human mitochondrial genome using the Illumina MiSeq.</a> Forensic Science International: Genetics. 12, 128-135 (2014).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+in+Actinidiaceae:+Genome+Structure+and+Comparative+Analysis.">The First Complete Chloroplast Genome Sequences in Actinidiaceae: Genome Structure and Comparative Analysis.</a> Plos One. 10 (6), (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+of+Five+Epimedium+Species:+Lights+into+Phylogenetic+and+Taxonomic+Analyses.">The Complete Chloroplast Genome Sequences of Five Epimedium Species: Lights into Phylogenetic and Taxonomic Analyses.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oxytricha+trifallax+Mitochondrial+Genome.">The Oxytricha trifallax Mitochondrial Genome.</a> Genome Biologyogy and Evolution. 4 (2), 136-154 (2011).</li><li>Barth, D., Berendonk, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome+sequence+of+the+ciliate+Paramecium+caudatum+reveals+a+shift+in+nucleotide+composition+and+codon+usage+within+the+genus+Paramecium.">The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium.</a> BMC Genomics. 12 (1), (2011).</li><li>Coombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Complete+Sitka+Spruce+Chloroplast+Genome+Using+10X+Genomics'+GemCode+Sequencing+Data.">Assembly of the Complete Sitka Spruce Chloroplast Genome Using 10X Genomics' GemCode Sequencing Data.</a> Plos One. 11 (9), (2016).</li><li>Herschleb, J., Ananiev, G., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis.">Pulsed-field gel electrophoresis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).</li></ol>

Subtractieve genomics is krachtig, maar het is niet een cookie-cutter aanpak, waarbij aanpassingen op verschillende belangrijke stappen, en zorgvuldige selectie van referentie sequenties en proefmonsters. Als de query-vergadering van slechte kwaliteit is, misschien filteren stappen alleen isoleren vergadering artefacten. Daarom is het belangrijk om grondig valideren de DOVO vergadering met behulp van een geschikte validatie-protocol aan het specifieke project. Voor RNA-seq, worden richtsnoeren verstrekt op de we...

Het doel van deze methode is om te identificeren een nieuwe doelstelling (T) genomic opeenvolging, hetzij DNA hetzij RNA, uit een genomic context of een verwijzing (R) (Figuur 1). De methode is vooral handig als het doel niet fysiek worden gescheiden, of het zou duur om dit te doen. Alleen een paar organismen hebben genomen voor aftrekken, perfect afgewerkt dus een belangrijke innovatie van onze methode is de combinatie van computationele en methoden van de Bank in een cyclus waardoor onderzoekers te isoleren doel sequenties wanneer de verwijzing onvolmaakt is, of een ontwerp genoom van een organisme niet-model. Aan het einde van een cyclus, wordt qPCR testen gebruikt om te bepalen of meer aftrekken nodig is. Een reeks gevalideerde kandidaat-T zal de bekende T-positieve monsters statistisch meer detectie vertonen door qPCR.
Incarnaties van de methode zijn doorgevoerd in de ontdekking van nieuwe bacteriële drug targets die geen host homologen1,2,3,4 en identificatie van nieuwe virussen geïnfecteerde hosts 5,6. Naast de identificatie van T, kan de methode verbeteren R: wij recent gebruikte de methode om 936 ontbrekende genen van het genoom van de verwijzing Zebravink en een nieuw gen van een alleen-germline chromosoom (T)7te identificeren. Subtractieve genomics is bijzonder waardevol wanneer T dreigt te worden zeer uiteenlopende vanaf de bekende opeenvolgingen of wanneer de identiteit van T is in grote lijnen gedefinieerd, zoals de Zebravink germline-beperkte chromosoom7.
Doordat er geen positieve identificatie van T vooraf, is een belangrijk voordeel van subtractieve genomics dat er onbevooroordeelde. In een recente studie onderzocht Readhead et al. de relatie tussen de ziekte van Alzheimer en virale overvloed in vier hersengebieden. Readhead et al. gemaakt voor virale identificatie, een database van 515 virussen8, ernstig beperken de virale agenten die hun studie kon identificeren. Subtractieve genomics kunnen zijn gebruikt om het gezond en Alzheimer genoom te vergelijken om te isoleren mogelijk roman virussen die zijn gekoppeld aan de ziekte, ongeacht hun gelijkenis met bekende infectieuze agentia. Hoewel er 263 bekende mens-targeting virussen, wordt er geschat dat ongeveer 1,67 miljoen onontdekte virale soorten bestaat, met 631,000-827,000 van hen hebben een potentieel te infecteren mensen9.
Isolatie van roman virussen is een terrein waarop subtractieve genomics is bijzonder effectief, maar sommige studies wellicht niet zo'n strenge methode. Bijvoorbeeld, transcriberen studies identificerende roman virussen hebt gebruikt onbevooroordeelde high-throughput sequencing gevolgd door omgekeerde transcriptie en BLASTx voor virale opeenvolgingen5 of verrijking van virale nucleïnezuren te halen en keren virale opeenvolgingen 6. Hoewel deze studies werkzaam DOVO Sequencen en vergadering, aftrekken werd niet gebruikt omdat de doelgroep sequenties werden positief geïdentificeerd door BLAST. Als de virussen zijn volledig nieuw en niet verwant (of zijdelings gerelateerde) aan andere virussen, subtractieve genomics zou zijn geweest een nuttige techniek. Het voordeel van subtractieve genomics is dat sequenties die volledig nieuw zijn kunnen worden verkregen. Als van het organisme genoom bekend is, kan het worden afgetrokken uit te verlaten een virale opeenvolgingen. Bijvoorbeeld, in onze gepubliceerde studie geïsoleerd we een nieuwe virale sequence Zebravink via subtractieve genomics, hoewel het was niet onze oorspronkelijke opzet7.
Subtractieve genomics is ook nuttig bij de identificatie van bacteriële vaccin doelen, ingegeven door de dramatische stijging van de antibiotica-resistentie1,,2,,3,4gebleken. Om het risico van auto-immune reactie, onderzoekers het doelwit van vaccin door af te trekken alle proteïnen die homologen in de menselijke gastheer hebben teruggebracht. Een bijzondere studie, Corynebacterium pseudotuberculosis, kijken uitgevoerd aftrekken van gewervelde gastheer genomen vanaf verschillende bacteriële genoom om ervoor te zorgen dat de mogelijke drug targets niet afbreuk zou doen aan eiwitten in de hosts die leiden tot bijwerkingen 1. de basishandelingen stroom van deze studies is het downloaden van de bacteriële Proteoom, bepalen van vitale eiwitten, verwijderen van redundante eiwitten, gebruik BLASTp om te isoleren de essentiële eiwitten en BLASTp tegen gastheer Proteoom te verwijderen van alle eiwitten met host homologen 1 , 2 , 3 , 4. In dit geval subtractieve genomics ervoor zorgen dat de vaccins ontwikkeld geen af-target effecten in de host1,2,3,4 hebben zal.
We gebruikten subtractieve genomica te identificeren van het eerste eiwit-codeert gen op een germline-beperkte chromosoom (GRC) (in dit geval, T), dat in germlines wordt gevonden maar niet somatische weefsel van beide vrouwen10. Voor deze studie was de alleen genomische informatie die was bekend over het GRC een repetitieve regio11. DOVO vergadering werd uitgevoerd op RNA sequenced van eierstok en teste weefsels (R + T) van volwassen zebra vinken. De computationele afschaffing van sequenties werd uitgevoerd met behulp van gepubliceerde somatische (spier) genoom reeks (R1)12, haar rauwe (Sanger) lezen gegevens (R2), en een somatische (hersenen) transcriptome (R3)13. De sequentiële gebruik van drie verwijzingen werd gedreven door de qPCR testen bij stap 5 van elke cyclus (Figuur 2A), waaruit blijkt dat aanvullende filteren vereist was. Het ontdekte α-SNAP-gen werd bevestigd door de qPCR van DNA en RNA, klonen en rangschikken. We laten zien in ons voorbeeld dat deze methode flexibel is: het is niet afhankelijk van de matching van nucleic zuren (DNA vs RNA) en dat aftrekken kan uitgevoerd worden met verwijzingen (R), die bestaan uit assemblages of ruwe leest.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:499px;" width="498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accustart II Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:65px;">Quanta Bio</td>
			<td align="right" style="width:52px;">95141</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST)</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Bowtie 2</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://www.python.org/download/releases/2.7/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">BWA-MEM v. 0.7.12</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geneious</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">PEAR v. 0.9.6</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Personal Computer</td>
			<td style="width:65px;">Biomatters</td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.geneious.com/</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:215px;">PowerSYBR qPCR mix</td>
			<td style="width:65px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:52px;">4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Python v. 2.7</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Reptile v.1.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">Stratagene Mx3005P</td>
			<td style="width:65px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:52px;">401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TransDecoder v. 3.0.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Trinity v. 2.4.0</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel sequence discovery by subtractive genomics

Subtractieve genomics kan worden gebruikt in elk onderzoek waar het doel is om het identificeren van de sequentie van een gen, eiwit of algemene regio die is ingesloten in een bredere context van de genomic. Subtractieve genomics laat een onderzoeker een opeenvolging van de doelgroep van belang (T) isoleren door uitgebreide sequentie en af te trekken uit de bekende genetische elementen (referentie, R). De methode kan worden gebruikt voor het identificeren van nieuwe reeksen zoals mitochondriën, chloroplasten, virussen, of germline chromosomen beperkt, en is vooral handig als T niet kan worden eenvoudig geïsoleerd van R. beginnen met de uitgebreide genomic gegevens (R + T), de methode maakt gebruik van elementaire lokale Alignment Search Tool (BLAST) tegen een referentie-reeks, of sequenties, verwijderen van de overeenkomende bekende opeenvolgingen (R), weggaand achter het doel (T). Voor aftrekken te werken het beste, moet R een relatief volledige ontwerp dat T. ontbreekt Sinds sequenties overblijft nadat aftrekken worden getest door middel van kwantitatieve Polymerase Chain Reaction (qPCR), hoeft R niet te worden voltooid voor de methode om te werken. Hier koppelen we computationele stappen met experimentele stappen in een cyclus die herhaald kan worden, zo nodig, opeenvolgend verwijderen van meerdere referentie sequenties en verfijnen van het zoeken naar T. Het voordeel van subtractieve genomics is dat een volledig nieuwe target-reeks zelfs in gevallen waarin fysieke zuivering moeilijk, niet onmogelijk, of duur is kan worden geïdentificeerd. Een nadeel van de methode is het vinden van een geschikte referentiemiddelen voor aftrekken en het verkrijgen van T-positieve en negatieve monsters voor het testen van qPCR. Wij beschrijven onze implementatie van de methode in de identificatie van het eerste gen van het chromosoom germline-beperkte van Zebravink. In dat geval drie verwijzingen (R), opeenvolgend verwijderd gedurende drie cycli computationele filteren betrokken: een onvolledige genomic vergadering, ruwe genomische data en transcriptomic gegevens.

Na het uitvoeren van BLAST, zal de output bestand hebben een lijst van sequenties van de query die overeenkomen met de database. Na Python aftrekken, zal een aantal nonmatching sequenties worden verkregen en getest door qPCR. De resultaten van dit en de volgende stappen worden hieronder besproken.
Negatieve resultaat. Er zijn twee mogelijke negatieve resultaten die kunnen worden gezien na de explosie in de reeks...

Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Nieuwe reeks ontdekking door subtractieve Genomics

Het doel van dit protocol is met een combinatie van rekenkundige en onderzoek van de Bank te vinden van nieuwe sequenties die niet gemakkelijk kunnen worden gescheiden van een mede zuiverende sequentie, die slechts gedeeltelijk bekend kan zijn.

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Ons protocol is belangrijk omdat het kan worden gebruikt om genomische sequenties te identificeren die niet kunnen worden geïsoleerd van co-zuiverende sequenties, die zelf slechts gedeeltelijk bekend kunnen zijn. De belangrijkste voordelen van deze techniek is dat het goedkoop is, met behulp van meestal gratis software die kan worden gedownload en flexibel. Je het toepassen op veel biologische vragen.Mogelijke toepassingen zijn het identificeren van bacteriële vaccindoelen en het identificeren van virussen waarvan de sequenties zeer verschillend zijn van bekende microben. Deze methode kan worden toegepast op elk systeem waarin het onbekende niet experimenteel kan worden gescheiden, zolang de referentiesequentie zonder het genomische doel beschikbaar is. Deze techniek vergt wat trial and error, dus geduld is belangrijk.Het kan nodig zijn om problemen te schieten de programma's. U programma's gebruiken die verschillen van de programma's die we hier beschrijven. Gebruik de gebruikershandleidingen zoveel mogelijk.Visuele demonstratie van deze methode is nuttig omdat rekenwerk afhankelijk is van een basiskennis van hoe command line programming is gestructureerd. Gebruik om te beginnen Trimmomatic 0.32 om illuminaadapters en lage kwaliteitsbases te verwijderen. Gebruik Pear-versie 0.9.11 om samengevoegde reads van hoge kwaliteit te maken op basis van met aangepaste uitvoer met standaardparameters.Gebruik vervolgens Reptile versie 1.1 om fout te corrigeren de leest geproduceerd door Pear. Gebruik ten slotte Trinity versie 2.4.0 in de standaardmodus om de gecorrigeerde sequenties te monteren. Gebruik voor strengspecifieke bibliotheken de parameter SS_lib_type.De uitvoer is een FASTA-bestand dat wordt geplaatst in een nieuwe directory genaamd trinity_output. Maak een BLAST-database van de referentiereeks nucleotide_reference. fasta op de commandolijn.BLAST heeft de query gekoppeld aan de referentiedatabase. Gebruik BLAST_results om een uitvoerbestand te verkrijgen. txt Om tabelvormige uitvoer te genereren die nodig is voor subsequence-verwerkingsstappen met Python-scripts, gebruikt u outfmt 6 Voor verhoogde stringentie, gebruikt u eiwitsequenties uit de assemblage als de BLAST-query met vertaalde nucleotide BLAST, die zeswegvertaling van de nucleotide-database uitvoert.Voer de TransDecoder uit om eiwitsequenties voor de query te verkrijgen. De opdracht Long0rfs om de langste open leesframes van geassembleerde querysequenties te identificeren. Nu lopen tblastn.Zorg er indien nodig voor dat de juiste genetische code wordt geselecteerd voor het organisme dat wordt bestudeerd met behulp van de db_gencode met de juiste codeoptie. Als er een hoogwaardige eiwitreferentie beschikbaar is, gebruik dan eiwit-eiwit matching met blastp in plaats van tblastn Maak een BLAST-database van de eiwitreferentie. Zorg ervoor dat u het resultaat opslaat als een bestand voor downstreamverwerking en gebruik tabelvormige uitvoer om ervoor te zorgen dat de Python-scripts ze correct kunnen ontleden.Gebruik nu het subtractieve Python-script om overeenkomende sequenties te verwijderen. Als u de reads op de assemblage wilt toewijzen, gebruikt u BWA-MEM-versie 0.7.12 of bowtie 2 om de gedownloade ruwe leest op de queryassemblage in kaart te brengen. Eerst indexeren van de montage, dan in kaart de leest.De uitvoer wordt SAM-formaat. Voer het Python-script removeUnmapped uit. py met behulp van het SAM-bestand als invoer.Hiermee worden de namen van queryreeksen aangegeven zonder dat er een overeenkomend artikel wordt gelezen en wordt deze opgeslagen in een nieuw tekstbestand. De uitvoer van de vorige stap is een lijst met sequenties namen in een txt-bestand. Haal een FASTA-bestand met deze sequenties.De uitvoer zal een fasta-bestand zijn. Gebruik Genius om optimale primersequenties handmatig te bepalen. Markeer een kandidaat-reeks van 21 tot 28 basisparen voor de voorwaartse primer, waarbij runs van vier of meer van elke basis worden vermeden.Probeer een regio te targeten met een vrij uniforme combinatie van alle basisparen. Een enkele G of C op drie Prime End is gunstig, helpen om de primer te verankeren. Klik op het tabblad Statistieken aan de rechterkant van het scherm om de geschatte smelttemperatuur van die reeks weer te geven terwijl het kandidaat-gebied wordt gemarkeerd.Streef naar een smelttemperatuur tussen 55 en 60 graden Celsius, terwijl het vermijden van herhalingen, en lange runs van G C.Kies een omgekeerde primer op dezelfde manier, gelegen 150 tot 250 basisparen drie primer van de voorwaartse primer. Hoewel de primerlengtes niet hoeven overeen te komen, moet de voorspelde smelttemperatuur zo dicht mogelijk bij die van de voorwaartse primer liggen. Zorg ervoor dat u de volgorde omkeren door met de rechtermuisknop in Genius te klikken terwijl een reeks wordt gemarkeerd in een menuoptie.Een alternatieve methode is het gebruik van de functie Primer Design, die wordt gevonden in de bovenste werkbalk in het venster Reeks. Voeg de regio in om te versterken onder Doelgebied. Voeg onder het tabblad kenmerken de gewenste grootte, smelttemperatuur en procent G C in en klik op OK om primers te laten genereren.Om kwantitatieve PCR-validatie van de resterende reeks uit te voeren, moet u eerst een reactiemengsel voor elke sjabloon in drievoud bereiden, met onze SYBR Green Master Mix, voorwaartse en omgekeerde primers en water, voor een totaal volume van 25 microliter. Voer een qPCR-programma uit dat wordt geïnformeerd door de eerder gevalideerde temperatuur- en verlengingstijd. Definitieve denaturerende curven moeten ten minste worden gegenereerd de eerste keer dat de primers worden gebruikt in qPCR om de versterking van een enkel DNA-product te valideren.Meet de qPCR SYBR Groene signalen ten opzichte van Actin by Ct Voor alle gevallen, bereken het gemiddelde, en de standaarddeviatie van twee tot de Ct ten opzichte van Actin. Voer eindpuntgele elektroforese uit om de juiste detectie van de productgrootte door qPCR te bevestigen. Hier, lopen 25 microliter van de qPCR product gemengd met vijf microliter 6X Glitterol kleurstof op een 2%TAE Agarose gel op 200 volt gedurende 20 minuten.Als uw qPCR aangeeft dat u de doelsequenties niet hebt geïdentificeerd, herhaalt u de hele cyclus met een nieuwe referentie, die kan worden verkregen uit een online database. Het subtractieve project begon in dit geval met het sequencing van het RNA van kiemgelijnd weefsel van mannelijke en vrouwelijke volwassen zebravink. Uiteindelijk werden 935 somatische genen geïdentificeerd die niet eerder in de hele genoomannotatie waren opgenomen.Na computationele filtering kan kwantitatieve PCR een negatief resultaat opleveren waarbij er geen verschil was in detectie tussen vogelweefsels. Omgekeerd wordt een positief resultaat dat de identificatie van een True Target Sequence vertegenwoordigt bevestigd wanneer genomic DNA qPCR statistisch grotere detectie in het weefsel van belang toont, ten opzichte van de referentie. Hier werd het alfa snap-gen gevalideerd om kiembaan-beperkt te zijn omdat het was uitgeput in somatisch weefsel ten opzichte van testees DNA waar het aanwezig was dat niveaus gelijk aan Actin.Het is belangrijk om te onthouden om de juiste ingangen te gebruiken tijdens elk van de computationele stappen. Het kan zijn dat u meerdere keren door de cyclus moet gaan om de doelsequentie of sequenties te verkrijgen. Een verscheidenheid aan fylogenetische, structurele en functionele analyse kan worden uitgevoerd op de ontdekte genen.Deze aanvullende methoden geven inzicht in de evolutionaire en functionele rollen van de genen. We identificeerden het eerste gen op een kiembaan-beperkt zangvogel chromosoom, dat de interesse in dit verrassende genomische element verbreedde. Het verdere werk toonde gelijkaardige chromosomen in vele zangvogelsoorten die vele extra genen bevatten.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcriptie Testen en hun toepassing in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bepaling van de optimale chromosomale locatie (s) voor een DNA Element in Escherichia coli met behulp van een nieuwe benadering van Transposon-gemedieerde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Hoog vet dieet voeding en High Throughput triglyceride test bij Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic analyse van sequencedata van Batch gist 2-Hybrid schermen

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Het rangschikken van mRNA van geheel bloed gebruikend Nanogaatje het rangschikken

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Navigeren MARRVEL, een web-based tool die Human Genomics en model organisme genetica informatie integreert

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Sequentie ruimte verkennen om bindende sites te identificeren voor regulatoire RNA-bindende eiwitten

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...