Name: novel sequence discovery by subtractive genomics
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

Les auteurs reconnaissent Michelle Biederman, Alyssa Pedersen et Colin J. Saldanha pour leur aide avec le projet de génomique de zebra finch à divers stades. Nous remercions également Evgeny Boivin au calcul d’administration système de cluster et NIH grant 1K22CA184297 (pour J.R.B.) et 042767 NS NIH (à C.J.S).

1. séquence de démarrage assembler de novo
Remarque : Toute séquence de génération (NGS) données peuvent servir, tant qu’un assembly peut être produit à partir de ces données. Les données d’entrée appropriées comprennent Illumina, PacBio, ou Oxford Nanopore lit assemblé dans un fichier de fasta. Pour concret, cette section décrit un assembly de base Illumina transcriptomique spécifique à l’étude de zebra finch, nous avons réalisé7; Toute...

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	<li>Barh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Comparative+Genomics+Analysis+for+Common+Drug+and+Vaccine+Targets+in+Corynebacterium+pseudotuberculosis+and+other+CMN+Group+of+Human+Pathogens.">A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).</li><li>Sarangi, A. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+First+Germline-Restricted+Gene+by+Subtractive+Transcriptomic+Analysis+in+the+Zebra+Finch,+Taeniopygia+guttata.">Discovery of the First Germline-Restricted Gene by Subtractive Transcriptomic Analysis in the Zebra Finch, Taeniopygia guttata.</a> Current Biology. 28 (10), 1620-1627 (2018).</li><li>Readhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Analysis+of+Independent+Alzheimer's+Cohorts+Finds+Disruption+of+Molecular,+Genetic,+and+Clinical+Networks+by+Human+Herpesvirus.">Multiscale Analysis of Independent Alzheimer's Cohorts Finds Disruption of Molecular, Genetic, and Clinical Networks by Human Herpesvirus.</a> Neuron. 99, 1-19 (2018).</li><li>Carroll, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+virome+project.">The global virome project.</a> Science. 359 (6378), 872-874 (2016).</li><li>Pigozzi, M. 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Tandis que la génomique soustractive est puissante, il n’est pas une approche d’emporte-pièce, nécessitant une personnalisation à plusieurs étapes clés et une sélection rigoureuse des séquences de référence et des échantillons pour essai. Si l’assembly de la requête est de mauvaise qualité, des mesures de filtrage pourrait isoler seulement artefacts de l’Assemblée. Par conséquent, il est important de valider complètement l’assembly en reprenant à l’aide d’un protocole de validation...

Le but de cette méthode est d’identifier une nouvelle cible (T) séquence génomique, ADN ou ARN, d’un contexte génomique, ou d’une référence (R) (Figure 1). La méthode est plus utile si la cible ne peut pas être physiquement séparée, ou il serait coûteux de le faire. Seuls quelques organismes ont fini parfaitement génomes pour la soustraction, donc une innovation majeure de notre méthode est la combinaison de calcul et les méthodes de banc dans un cycle permettant aux chercheurs d’isoler les séquences cibles lorsque la référence est imparfaite, ou un projet génome d’un organisme non-modèle. À la fin d’un cycle, qPCR test sert à déterminer si la soustraction plus est nécessaire. Une séquence de candidat validé T montrera détection statistiquement supérieure dans les échantillons de T positifs connus de qPCR.
Incarnations de la méthode ont été mis en œuvre dans la découverte de nouvelles cibles de médicaments bactérienne qui n’ont pas d’hôte homologues1,2,3,4 et l’identification de nouveaux virus d’hôtes infectés 5,6. En plus de l’identification de T, la méthode peut améliorer r : nous avons récemment utilisé la méthode pour identifier des gènes manquants 936 du génome de référence zebra finch et un nouveau gène provenant d’une seule lignée germinale chromosome (T)7. La génomique soustractive est particulièrement précieuse lorsque T est susceptible d’être extrêmement divergentes de séquences connues, ou lorsque l’identité de T est largement indéfinie, comme dans le zebra finch germline restreints du chromosome7.
En n’exigeant ne pas une identification positive de T au préalable, un avantage majeur de génomique soustractive est qu’il est non biaisée. Dans une étude récente, Readhead et coll. ont examiné la relation entre la maladie d’Alzheimer et l’abondance viral dans quatre régions du cerveau. D’identification virale, Readhead et coll. a créé une base de données de 515 virus8, limitant sévèrement les agents viraux qui pourrait identifier leur étude. Soustractive génomique pourrait ont été utilisés pour comparer des bien-portants et génomes Alzheimer afin d’isoler les possibles nouveaux virus associés à la maladie, quelle que soit leur ressemblance à des agents infectieux connus. Bien qu’il y a 263 virus connus de ciblage de l’homme, on estime qu’environ 1,67 millions espèces virales non découvertes existent, avec 631 000-827 000 d'entre eux ayant un potentiel d’infecter les humains9.
Isolement des nouveaux virus est un domaine dans lequel soustractive génomique est particulièrement efficace, mais certaines études ne peut-être pas besoin d’une telle méthode rigoureuse. Par exemple, études, identification de nouveaux virus ont utilisé le séquençage haut débit impartial suivie par transcription inverse et BLASTx pour séquences virales5 ou enrichir des acides nucléiques viraux d’extraire et d’inverser transcrivent des séquences virales 6. alors que ces études utilisées séquençage de novo et Assemblée, soustraction n’était pas utilisée parce que les séquences cibles ont été identifiés par le biais de BLAST. Si les virus étaient complètement nouveaux et non liées (ou lointainement apparentées) à d’autres virus, génomique soustractive aurait été une technique utile. L’avantage de la génomique soustractive est qu’on peuvent obtenir les séquences qui sont complètement nouveaux. Si le génome de l’organisme est connu, il peut déduire de quitter toutes les séquences virales. Par exemple, dans notre étude publiée nous avons isolé un roman-fleuve virale de zebra finch par la génomique soustractive, même s’il n’était pas notre intention originale7.
Soustractive génomique s’est avérée aussi utile dans l’identification des cibles de vaccin bactérien, motivés par l’augmentation impressionnante de la résistance aux antibiotiques1,2,3,4. Pour minimiser le risque de réaction auto-immune, chercheurs a réduit les cibles potentielles de vaccin en soustrayant toutes les protéines qui ont des homologues chez l’hôte humain. Une étude particulière, en regardant pseudotuberculosis Corynebacterium, jouée soustraction des génomes de vertébrés hôtes de plusieurs génomes bactériens pour s’assurer que cibles médicamenteuses possibles n’affecterait pas les protéines chez les hôtes conduisant à des effets secondaires 1. le flux de travail de base de ces études est de télécharger le protéome bactérien, déterminer les protéines vitales, éliminer les protéines redondants, utiliser BLASTp pour isoler les protéines essentielles et BLASTp contre hôte proteome pour enlever toutes les protéines avec les homologues de l’hôte 1 , 2 , 3 , 4. dans ce cas, génomique soustractive assure que les vaccins mis au point n’auront pas d’effets hors cible dans l’hôte1,2,3,4.
Nous avons utilisé soustractive génomique pour identifier le premier gène codant pour des protéines sur un lignée germinale restreints du chromosome (GRC) (dans ce cas, T), qui se trouve dans germlines mais tissu pas somatique des deux sexes10. Avant cette étude, l’information seulement génomique qui savait sur la GRC était une région répétée11. Assemblée de novo a été réalisée sur RNA séquencée à partir de tissus de l’ovaire et teste (R + T) de diamants mandarins adultes. L’élimination de calcul des séquences a été effectuée à l’aide de publiées somatique (muscle) génome sequence (R1)12, ses brute (Sanger) lire données (R2) et un de transcriptome (R3) somatique (cerveau)13. L’utilisation séquentielle de trois références est pilotée par le qPCR test à l’étape 5 de chaque cycle (Figure 2A), indiquant qu’il fallait un filtrage supplémentaire. Le gène α-SNAP découvert a été confirmé par qPCR d’ADN et d’ARN et clonage et séquençage. Nous montrons dans notre exemple que cette méthode est souple : il n’est pas tributaire de l’appariement des acides nucléiques (ADN vs RNA) et cette soustraction peut être effectuée avec des références (R) qui sont composent d’assemblées ou de lectures brutes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:499px;" width="498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accustart II Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:65px;">Quanta Bio</td>
			<td align="right" style="width:52px;">95141</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST)</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Bowtie 2</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://www.python.org/download/releases/2.7/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">BWA-MEM v. 0.7.12</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geneious</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">PEAR v. 0.9.6</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Personal Computer</td>
			<td style="width:65px;">Biomatters</td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.geneious.com/</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:215px;">PowerSYBR qPCR mix</td>
			<td style="width:65px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:52px;">4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Python v. 2.7</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Reptile v.1.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">Stratagene Mx3005P</td>
			<td style="width:65px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:52px;">401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TransDecoder v. 3.0.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Trinity v. 2.4.0</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel sequence discovery by subtractive genomics

Soustractive génomique peut être utilisé dans des recherches dont le but est d’identifier la séquence d’un gène, protéine ou une région qui est incorporée dans un contexte plus large de génomique. Soustractive génomique permet à un chercheur d’isoler une séquence cible d’intérêt (T) en séquençage complet et en soustrayant les éléments génétiques connus (référence, R). La méthode peut être utilisée pour identifier de nouvelles séquences comme les mitochondries, chloroplastes, virus, ou cellules germinales restreinte de chromosomes et est particulièrement utile lorsque T ne peut pas être facilement isolé de R. commençant par les données génomiques complètes (R + T), la méthode utilise base locale alignement Search Tool (BLAST) contre une séquence de référence, ou séquences, pour supprimer les séquences connues correspondants (R), laissant derrière lui la cible (T). Pour la soustraction fonctionner au mieux, R doit être un projet relativement complet auquel il manque T. Depuis les séquences restantes après soustraction sont testés à travers quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R n’a pas besoin d’être terminés pour que la méthode fonctionne. Ici nous relions computational étapes avec des étapes expérimentales dans un cycle qui peut être itéré selon les besoins, séquentiellement, supprimant plusieurs séquences de référence et affiner la recherche de T. L’avantage de la génomique soustractive, c’est qu’une séquence complètement nouvelle cible soient reconnaissables même dans les cas où la purification physique est difficile, impossible ou coûteux. L’inconvénient de la méthode est trouver une référence appropriée pour la soustraction et obtenir T-positifs et négatifs des échantillons pour les tests de qPCR. Nous décrivons notre implémentation de la méthode dans l’identification du premier gène du chromosome germline restreints de zebra finch. Dans ce cas de filtrage informatique impliqué trois références (R), retirés dans l’ordre pendant trois cycles : un assemblage génomique incomplète et données génomiques brutes données transcriptomiques.

Après l’exécution de BLAST, le fichier de sortie aura une liste de séquences de la requête qui correspond à la base de données. Après soustraction de Python, un certain nombre de séquences non correspondantes est obtenu et testé par qPCR. Les résultats du présent et les prochaines étapes, sont examinés ci-dessous.
Résultat négatif. Il y a deux résultats négatifs possibles qui peuvent être vus...

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Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Découverte de roman-fleuve de génomique soustractive

Le but du présent protocole est d’utiliser une combinaison de calcul et de la recherche de banc pour trouver de nouvelles séquences qui ne peuvent être facilement séparés d’une séquence co purificatrice, qui peut-être n'être que partiellement connue.

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Notre protocole est significatif parce qu’il peut être utilisé pour identifier des séquences génomiques qui ne peuvent pas être isolées des séquences de co-purification, qui peuvent elles-mêmes seulement être partiellement connues. Les principaux avantages de cette technique est qu’il est peu coûteux, en utilisant principalement des logiciels libres qui peuvent être téléchargés ainsi que flexible. Vous pouvez l’appliquer à de nombreuses questions biologiques.Les applications potentielles incluent l’identification de cibles vaccinale bactériennes et l’identification de virus dont les séquences sont extrêmement différentes des microbes connus. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel système dans lequel l’inconnu ne peut pas être séparé expérimentalement, tant que la séquence de référence sans la cible génomique est disponible. Cette technique demande des essais et des erreurs, donc la patience est importante.Vous devrez peut-être difficulté à tirer sur les programmes. Vous pouvez utiliser des programmes différents de ceux que nous décrivons ici. Utilisez autant que possible les manuels d’utilisation.La démonstration visuelle de cette méthode est utile parce que le travail de calcul dépend d’une compréhension de base de la façon dont la programmation des lignes de commande est structurée. Pour commencer, utilisez Trimmomatic 0.32 pour enlever les adaptateurs d’illumina et les bases de mauvaise qualité. Utilisez pear version 0.9.11 pour créer des lectures fusionnées de haute qualité à partir de lectures paires de sortie trimmomatique à l’aide de paramètres par défaut.Ensuite, utilisez reptile version 1.1 pour corriger les lectures produites par Pear. Utilisez enfin trinity version 2.4.0 en mode par défaut pour assembler les séquences corrigées. Pour les bibliothèques spécifiques au brin, utilisez le paramètre SS_lib_type’utilisation.La sortie est un fichier FASTA qui sera placé dans un nouveau répertoire appelé trinity_output. Faites une base de données BLAST de la séquence de référence nucleotide_reference. fasta à la ligne de commande.BLAST correspondait à la requête rassemblée dans la base de données de référence. Pour obtenir un fichier de sortie, utilisez BLAST_results. txt Pour générer la sortie tabulaire requise pour les étapes de traitement de la subséquence avec les scripts Python, utilisez outfmt 6 Pour une plus grande rigueur, utilisez des séquences protéiques de l’assemblage comme requête BLAST avec blast nucléotide traduit, qui effectue la traduction à six sens de la base de données nucléotide.Pour obtenir des séquences protéiques pour la requête, exécutez le TransDecoder. Commande Long0rfs pour identifier les plus longs cadres de lecture ouverts à partir de séquences de requêtes assemblées. Maintenant, exécutez tblastn.Si nécessaire, assurez-vous que le code génétique correct est sélectionné pour l’organisme à l’étude en utilisant db_gencode avec l’option de code appropriée. Si une référence protéique de haute qualité est disponible, utilisez l’appariement protéines-protéines avec blastp plutôt que tblastn Faites une base de données BLAST de la référence protéique. Assurez-vous d’enregistrer le résultat en tant que fichier pour le traitement en aval, et utilisez la sortie tabulaire pour vous assurer que les scripts Python peuvent les affiner correctement.Maintenant, utilisez le script Python soustractif pour supprimer toutes les séquences correspondantes. Pour cartographier les lectures sur l’assemblage, utilisez la version BWA-MEM 0.7.12 ou le nœud papillon 2 pour cartographier les premières téléchargées sur l’assemblage de requêtes. Tout d’abord, indexer l’assemblage, puis cartographier les lectures.La sortie sera format SAM. Exécutez le script Python supprimerUnmapped. py en utilisant le fichier SAM comme entrée.Cela identifie les noms des séquences de requête sans aucune lecture correspondante et les enregistre dans un nouveau fichier texte. La sortie de l’étape précédente est une liste de noms de séquences dans un fichier txt. Extraire un fichier FASTA avec ces séquences.La sortie sera un fichier fasta. Utilisez Genius pour déterminer manuellement les séquences optimales d’amorce. Mettez en surbrillance une séquence de candidats de 21 à 28 paires de base pour l’amorce avant, en évitant les courses de quatre ou plus de n’importe quelle base.Essayez de cibler une région avec une combinaison assez uniforme de toutes les paires de base. Un seul G ou C à trois Prime End est bénéfique, aidant à ancrer l’amorce. Cliquez sur l’onglet Statistiques sur le côté droit de l’écran pour afficher la température de fusion estimée de cette séquence au fur et à mesure que la région candidate est mise en évidence.Visez une température de fusion comprise entre 55 et 60 degrés Celsius, tout en évitant les répétitions, et de longues courses de G C.Choisissez une amorce inverse de la même manière, située de 150 à 250 paires de base trois premiers de l’amorce avant. Bien que les longueurs d’amorce n’ont pas besoin d’correspondre, la température de fusion prévue devrait être aussi proche que possible de celle de l’amorce avant. Assurez-vous d’inverser la séquence en cliquant à droite dans Genius tandis qu’une séquence est mise en surbrillance dans une option de menu.Une autre méthode consiste à utiliser la fonction Primer Design, que l’on retrouve dans la barre d’outils supérieure de la fenêtre Séquence. Insérez la région à amplifier sous la région cible. Sous l’onglet caractéristiques, insérez la taille désirée, la température de fusion et pour cent de G C, puis cliquez sur OK pour faire générer des amorces.Pour effectuer la validation quantitative pcr de la séquence restante, préparez d’abord un mélange de réaction pour chaque modèle en triplicate, avec notre SYBR Green Master Mix, amorces avant et arrière, et de l’eau, pour un volume total de 25 microlitres. Exécutez un programme qPCR informé par la température et le temps d’extension précédemment validés. Les courbes finales de dénaturation devraient être générées au moins la première fois que les amorces sont utilisées dans qPCR pour valider l’amplification d’un seul produit d’ADN.Mesurer les signaux verts qPCR SYBR par rapport à Actin par Ct Pour tous les cas, calculer la moyenne, et l’écart type de deux par rapport à Actin. Effectuez l’électrophoresis de gel de point de terminaison, pour confirmer la détection correcte de taille de produit par qPCR. Ici, exécutez 25 microlitres du produit qPCR mélangés avec cinq microlitres de colorant Glitterol 6X sur un gel Agarose 2%TAE à 200 volts pendant 20 minutes.Si votre qPCR montre que vous n’avez pas identifié les séquences cibles, répétez l’ensemble du cycle avec une nouvelle référence, qui peut être obtenue à partir d’une base de données en ligne. Le projet subtractif dans ce cas-ci a commencé par le séquençage de l’ARN à partir de tissu tapissé de germes de pinsons zèbres adultes mâles et femelles. En fin de compte, 935 gènes somatiques qui n’étaient pas précédemment inclus dans l’annotation du génome entier ont été identifiés.Après le filtrage computationnel, le PCR quantitatif peut donner un résultat négatif dans lequel il n’y avait aucune différence dans la détection entre les tissus d’oiseaux. Inversement, un résultat positif représentant l’identification d’une véritable séquence cible est confirmé lorsque l’ADN génomique qPCR montre une détection statistiquement plus grande dans le tissu d’intérêt, par rapport à la référence. Ici, le gène alpha snap a été validé pour être limité par la germline parce qu’il a été appauvri en tissu somatique par rapport à l’ADN des testicules où il était présent que les niveaux équivalents à Actin.Il est important de se rappeler d’utiliser les entrées correctes pendant chacune des étapes de calcul. Vous devrez peut-être passer par la soustraction du cycle plusieurs fois afin d’obtenir la séquence ou les séquences cibles. Une variété d’analysephylogénétique, structurale et fonctionnelle peut être effectuée sur les gènes découverts.Ces méthodes supplémentaires donnent un aperçu des rôles évolutifs et fonctionnels des gènes. Nous avons identifié le premier gène sur un chromosome d’oiseau chanteur germinale-restreint, qui a élargi l’intérêt dans cet élément génomique surprenant. Des travaux ultérieurs ont montré des chromosomes similaires chez de nombreuses espèces d’oiseaux chanteurs contenant de nombreux gènes supplémentaires.

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