Name: novel sequence discovery by subtractive genomics
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

המחברים להכיר מישל בידרמן, אליסה פדרסן, קולין. ג'יי Saldanha לסיוע שלהם עם הפרויקט גנומיקה זברה פינק בשלבים שונים. אנו גם להכיר יבגני Bisk עבור מחשוב ניהול המערכת אשכול ואת NIH גרנט 1K22CA184297 (ל J.R.B.) NIH NS 042767 (ל C.J.S).

1. דה נובו להרכיב מתחיל רצף
הערה: נתונים הדור הבא ברצף (הגדרות) יכול לשמש, כל עוד הרכבה ניתן להפיק את הנתונים האלה. נתוני קלט מתאים כולל אילומינה, PacBio, או Nanopore אוקספורד הקראה התאספו לתוך קובץ fasta. עבור קונקרטיות, סעיף זה מתאר הרכבה transcriptomic מבוססי אילומינה ספיציפית המחקר זברה...

<ol>
	<li>Barh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Comparative+Genomics+Analysis+for+Common+Drug+and+Vaccine+Targets+in+Corynebacterium+pseudotuberculosis+and+other+CMN+Group+of+Human+Pathogens.">A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).</li><li>Sarangi, A. N., Aggarwal, R., Rahman, Q., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtractive+Genomics+Approach+for+in+Silico+Identification+and+Characterization+of+Novel+Drug+Targets+in+Neisseria+Meningitides+Serogroup+B.">Subtractive Genomics Approach for in Silico Identification and Characterization of Novel Drug Targets in Neisseria Meningitides Serogroup B.</a> Journal of Computer Science &amp; Systems Biology. 2 (5), (2009).</li><li>Kaur, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Druggable+Targets+for+Acinetobacter+baumannii+Via+Subtractive+Genomics+and+Plausible+Inhibitors+for+MurA+and+MurB.">Identification of Druggable Targets for Acinetobacter baumannii Via Subtractive Genomics and Plausible Inhibitors for MurA and MurB.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 171 (2), 417-436 (2013).</li><li>Rathi, B., Sarangi, A. N., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+subtraction+for+novel+target+definition+in+Salmonella+typhi.">Genome subtraction for novel target definition in Salmonella typhi.</a> Bioinformation. 4 (4), 143-150 (2009).</li><li>Epstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+GBV-D,+a+Novel+GB-like+Flavivirus+from+Old+World+Frugivorous+Bats+(Pteropus+giganteus)+in+Bangladesh.">Identification of GBV-D, a Novel GB-like Flavivirus from Old World Frugivorous Bats (Pteropus giganteus) in Bangladesh.</a> PLoS Pathogens. 6 (7), (2010).</li><li>Kapoor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Rodent+Homologs+of+Hepatitis+C+Virus+and+Pegiviruses.">Identification of Rodent Homologs of Hepatitis C Virus and Pegiviruses.</a> MBio. 4 (2), (2013).</li><li>Biederman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+First+Germline-Restricted+Gene+by+Subtractive+Transcriptomic+Analysis+in+the+Zebra+Finch,+Taeniopygia+guttata.">Discovery of the First Germline-Restricted Gene by Subtractive Transcriptomic Analysis in the Zebra Finch, Taeniopygia guttata.</a> Current Biology. 28 (10), 1620-1627 (2018).</li><li>Readhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Analysis+of+Independent+Alzheimer's+Cohorts+Finds+Disruption+of+Molecular,+Genetic,+and+Clinical+Networks+by+Human+Herpesvirus.">Multiscale Analysis of Independent Alzheimer's Cohorts Finds Disruption of Molecular, Genetic, and Clinical Networks by Human Herpesvirus.</a> Neuron. 99, 1-19 (2018).</li><li>Carroll, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+virome+project.">The global virome project.</a> Science. 359 (6378), 872-874 (2016).</li><li>Pigozzi, M. I., Solari, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+restriction+and+regular+transmission+of+an+accessory+chromosome+that+mimics+a+sex+body+in+the+zebra+finch.+Taeniopygia+guttata.">Germ cell restriction and regular transmission of an accessory chromosome that mimics a sex body in the zebra finch. Taeniopygia guttata.</a> Chromosome Research. 6, 105-113 (1998).</li><li>Itoh, Y., Kampf, K., Pigozzi, M. I., Arnold, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+characterization+of+the+germline-restricted+chromosome+sequence+in+the+zebra+finch.">Molecular cloning and characterization of the germline-restricted chromosome sequence in the zebra finch.</a> Chromosoma. 118, 527-536 (2009).</li><li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+a+songbird.">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li><li>Balakrishnan, C. N., Lin, Y. C., London, S. E., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+transcriptome+analysis+of+male+and+female+zebra+finch+cell+lines.">RNAseq transcriptome analysis of male and female zebra finch cell lines.</a> Genomics. 100, 363-369 (2012).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAR:+a+fast+and+accurate+Illumina+Paired-End+reAd+mergeR.">PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR.</a> Bioinformatics. 30, 614-620 (2014).</li><li>Yang, X., Dorman, K. S., Aluru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reptile:+representative+tiling+for+short+read+error+correction.">Reptile: representative tiling for short read error correction.</a> Bioinformatics. 26, 2526-2533 (2010).</li><li>MacManes, M. D., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+transcriptome+assembly+through+error+correction+of+high-throughput+sequence+reads.">Improving transcriptome assembly through error correction of high-throughput sequence reads.</a> PeerJ. 1 (113), (2013).</li><li>Grabherr, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+transcriptome+assembly+from+RNA-seq+data+without+a+reference+genome.">Full-length transcriptome assembly from RNA-seq data without a reference genome.</a> Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).</li><li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+sequence+reads,+clone+sequences+and+assembly+contigs+with+BWA-MEM.">Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM.</a> arXiv. , (2013).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357-359 (2012).</li><li>Kearse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geneious+Basic:+an+integrated+and+extendable+desktop+software+platform+for+the+organization+and+analysis+of+sequence+data.">Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data.</a> Bioinformatics. 28 (12), 1647-1649 (2012).</li><li>Peirson, S. N., Butler, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+polymerase+chain+reaction.">Quantitative polymerase chain reaction.</a> Methods in Molecular Biology. 362, 349-362 (2007).</li><li>Hunt, M., Kikuchi, T., Sanders, M., Newbold, C., Berriman, M., Otto, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAPR+citation:+REAPR:+a+universal+tool+for+genome+assembly+evaluation.">REAPR citation: REAPR: a universal tool for genome assembly evaluation.</a> Genome Biology. 14 (5), (2013).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mitochondrial+genome+sequence+of+a+hominin+from+Sima+de+los+Huesos.">A mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos.</a> Nature. 505 (7483), 403-406 (2013).</li><li>Gunnarsd&#243;ttir, E. D., Li, M., Bauchet, M., Finstermeier, K., Stoneking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+complete+human+mtDNA+genomes+from+the+Philippines.">High-throughput sequencing of complete human mtDNA genomes from the Philippines.</a> Genome Research. 21 (1), 1-11 (2010).</li><li>King, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+and+high-throughput+massively+parallel+sequencing+of+the+human+mitochondrial+genome+using+the+Illumina+MiSeq.">High-quality and high-throughput massively parallel sequencing of the human mitochondrial genome using the Illumina MiSeq.</a> Forensic Science International: Genetics. 12, 128-135 (2014).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+in+Actinidiaceae:+Genome+Structure+and+Comparative+Analysis.">The First Complete Chloroplast Genome Sequences in Actinidiaceae: Genome Structure and Comparative Analysis.</a> Plos One. 10 (6), (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+of+Five+Epimedium+Species:+Lights+into+Phylogenetic+and+Taxonomic+Analyses.">The Complete Chloroplast Genome Sequences of Five Epimedium Species: Lights into Phylogenetic and Taxonomic Analyses.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oxytricha+trifallax+Mitochondrial+Genome.">The Oxytricha trifallax Mitochondrial Genome.</a> Genome Biologyogy and Evolution. 4 (2), 136-154 (2011).</li><li>Barth, D., Berendonk, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome+sequence+of+the+ciliate+Paramecium+caudatum+reveals+a+shift+in+nucleotide+composition+and+codon+usage+within+the+genus+Paramecium.">The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium.</a> BMC Genomics. 12 (1), (2011).</li><li>Coombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Complete+Sitka+Spruce+Chloroplast+Genome+Using+10X+Genomics'+GemCode+Sequencing+Data.">Assembly of the Complete Sitka Spruce Chloroplast Genome Using 10X Genomics' GemCode Sequencing Data.</a> Plos One. 11 (9), (2016).</li><li>Herschleb, J., Ananiev, G., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis.">Pulsed-field gel electrophoresis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).</li></ol>

בעוד גנומיקה מופחתים הוא רב עוצמה, זה לא בגישה לשירי, המחייב התאמה אישית מספר השלבים החשובים, וכן בחירה זהירה של רצפי הפניה ודוגמאות מבחן. אם מכלול שאילתה באיכות ירודה, סינון צעדים אולי רק לבודד חפצים הרכבה. לכן, חשוב יסודי לאמת את מכלול דה נובו באמצעות פרוטוקול האימות המתאים לפרוייקט ?...

מטרת שיטה זו הוא לזהות של הרומן היעד (T) רצף גנומית, DNA או RNA, ההקשר גנומית, או הפניה (R) (איור 1). השיטה זו שימושית במיוחד אם היעד לא יכולה להיות מופרדים פיזית, או שזה יהיה יקר לעשות זאת. רק כמה אורגניזמים לחלוטין סיימו את הגנום עבור חיסור, אז חידוש מפתח בשיטה שלנו היא שילוב של חישובית של השיטות הספסל לתוך מעגל הפעלת חוקרים לבודד המטרה רצפים כאשר ההפניה היא פגומה, או טיוטה הגנום של אורגניזם שאינו-מודל. בסוף מחזור, בדיקות qPCR משמש כדי לקבוע אם יש צורך חיסור נוסף. רצף המאומת המועמד T יראה זיהוי סטטיסטית בדגימות T-חיוביות מוכרות על-ידי qPCR.
גלגולים של השיטה יושמו גילוי חדש חיידקי סמים מטרות שאין המארח homologs1,2,3,4 , זיהוי של וירוסים הרומן לנשאים נגועים 5,6. בנוסף זיהוי של T, השיטה יכול לשפר את r: לאחרונה השתמשנו בשיטת לזהות גנים חסרים 936 מן הגנום הפניה זברה פינק גן חדש של כרומוזום germline בלבד (T)7. גנומיקה מופחתים הוא יקר במיוחד כאשר T צפוי להיות מאוד מתפצלת של רצפי ידוע, או כאשר זהותו של T אינה מוגדרת בהרחבה, כמו זברה פינק מוגבלת germline כרומוזום7.
ואחרת לא זיהוי חיובי של T מראש, יתרון מפתח של מופחתים גנומיקה היא שזה לא משוחדת. במחקר שנערך לאחרונה, Readhead. ואח בדק את הקשר בין מחלת אלצהיימר ושפע ויראלית באזורים במוח ארבעה. עבור זיהוי ויראלי, Readhead. et al. ליצור מסד נתונים של וירוסים 5158, מגבילה מאוד את הסוכנים ויראלי המחקר שלהם שיכול לזהות. גנומיקה מופחתים יכול שימשו כדי להשוות בין הבריאים ואת הגנום אלצהיימר על מנת לבודד וירוסים הרומן הקשורים במחלה, ללא קשר הדמיון שלהם לגורמי ידוע. אמנם ישנם וירוסים פילוח האדם מוכרים 263, ההערכה היא כי כ 1.67 מיליון שעדיין לא התגלו מינים ויראלי קיימים, עם 631,000-827,000 מהם יש אפשרות להדביק בני אדם9.
בידוד של וירוסים הרומן הוא אזור שבו מופחתים גנומיקה יעיל במיוחד, אך מחקרים ייתכן שלא תזדקק השיטה מחמירים. לדוגמה, מחקרים זיהוי וירוסים הרומן השתמשו מוטים רצף תפוקה גבוהה ואחריו שעתוק במהופך, BLASTx עבור רצפי ויראלי5 או העשרה של חומצות גרעין נגיפיות כדי לחלץ ולהפוך לתמלל ויראלי רצפים 6. בעוד מחקרים אלה המועסקים דה נובו רצף והרכבה, חיסור לא שימש כי הרצפים היעד זוהו באופן חיובי באמצעות פיצוץ. אם וירוסים ולחלוטין, לא קשורים (או קרובים רחוקים) וירוסים אחרים, גנומיקה מופחתים היה טכניקה שימושית. היתרון של גנומיקה מופחתים הוא כי ניתן להשיג רצפי אשר הינם חדשים לחלוטין. אם הגנום של האורגניזם ידוע, זה ניתן להפחית לעזוב כל רצפי ויראלי. כך למשל, במחקר שפורסם שלנו בודדנו רצף ויראלי הרומן של זברה פינק באמצעות גנומיקה מופחתים, למרות שזה לא כוונה המקורי שלנו7.
גנומיקה מופחתים גם הוכיח שימושי בזיהוי מטרות חיסון חיידקי, מוטיבציה מאת לעליה דרמטית עמידות לאנטיביוטיקה1,2,3,4. כדי למזער את הסיכון של תגובה אוטואימונית, חוקרים צמצמתי את מטרות אפשריות של החיסון על-ידי חיסור כל החלבונים שיש homologs לארח אדם. מחקר אחד מסוים, מסתכלים על Corynebacterium pseudotuberculosis, ביצע חיסור של הגנום מארח חוליות מן הגנום חיידקית מספר כדי להבטיח אפשרי סמים מטרות לא ישפיע על חלבונים ב המארחים שמוביל לתופעות לוואי 1. תהליך עבודה בסיסי של מחקרים אלה היא להוריד את פרוטאום חיידקי, לקבוע חלבונים חיוניים, להסיר חלבונים יתיר, השתמש BLASTp כדי לבודד את החלבונים חיוניים, BLASTp נגד פרוטאום המארח כדי להסיר את כל החלבונים עם המארח homologs 1 , 2 , 3 , 4. במקרה זה, גנומיקה מופחתים להבטיח כי החיסונים פיתחו לא יהיו תופעות את המטרה מארח1,2,3,4.
השתמשנו גנומיקה מופחתים כדי לזהות את הגן הראשון חלבונים על מוגבלת germline כרומוזום (GRC) (במקרה זה, T), הנמצא germlines אבל לא סומאטית רקמות של שני המינים10. לפני במחקר זה, המידע רק גנומית היה ידוע אודות למרפאה היה אזור החוזרות על עצמן11. דה נובו ההרכבה בוצעה ב- RNA וסודרו מן השחלה ואת teste רקמות (R + T) מן הפרושים זברה למבוגרים. חיסול חישובית של רצפי התבצע בעזרת שפורסמו סומאטית (שריר) הגנום רצף (R1)12, שלו raw (סנגר) לקרוא נתונים (R2), transcriptome (R3) סומאטית (המוח)13. שימוש רציף ושלוש הפניות הסיע את qPCR בדיקות בשלב 5 של כל מחזור (איור 2א), מראה כי סינון נוסף היה נדרש. הגן α-SNAP שהתגלו אושר דרך qPCR של ה-DNA ו- RNA, ו שיבוט רצף. אנחנו מראים בדוגמה שלנו כי שיטה זו היא גמישה: זה לא תלויה התאמת חומצות גרעין (DNA לעומת ה-RNA), ניתן לבצע את החיסור הפניות (R) מורכבות של הרכבות או קריאות raw.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:499px;" width="498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accustart II Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:65px;">Quanta Bio</td>
			<td align="right" style="width:52px;">95141</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST)</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Bowtie 2</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://www.python.org/download/releases/2.7/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">BWA-MEM v. 0.7.12</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geneious</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">PEAR v. 0.9.6</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Personal Computer</td>
			<td style="width:65px;">Biomatters</td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.geneious.com/</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:215px;">PowerSYBR qPCR mix</td>
			<td style="width:65px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:52px;">4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Python v. 2.7</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Reptile v.1.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">Stratagene Mx3005P</td>
			<td style="width:65px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:52px;">401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TransDecoder v. 3.0.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Trinity v. 2.4.0</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel sequence discovery by subtractive genomics

גנומיקה מופחתים ניתן להשתמש במחקר כלשהו שבו המטרה היא לזהות את הרצף של גנים, חלבונים או אזור כללי שמוטבעת בתוך הקשר גנומית גדול. גנומיקה מופחתים מאפשר חוקר לבודד המטרה רצף של עניין (T) על ידי רצף מקיף ומחסר החוצה מרכיבים גנטיים מוכרים (הפניה, R). השיטה יכולה לשמש לזיהוי רצפים הרומן המיטוכונדריה, מהכלורופלסט, וירוסים, או germline מוגבלת כרומוזומים, יעיל במיוחד כאשר T לא יכול להיות בקלות מבודד מ ר מתחיל עם הנתונים גנומית מקיף (R + T), השיטה משתמש בסיסי מקומי יישור חיפוש כלי (פיצוץ) נגד רצף הפניה או רצפים, כדי להסיר את התאמת ידועים רצפי (R), משאיר מאחור את המטרה (T). עבור חיסור לפעול בצורה הטובה ביותר, R צריך להיות טיוטה שלמה יחסית שחסרה לו ט מאז רצפים שנותרו לאחר חיסור נבדקים דרך כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR), R לא צריך להיות מושלם. שיטת העבודה. כאן אנחנו קישור צעדים חישובית עם מדרגות ניסיוני לתוך מחזור זה יכול להיות iterated בהתאם לצורך, ברצף הסרת מספר רצפי הפניה וכוונון החיפוש אחר טי היתרון של גנומיקה מופחתים הוא כי ברצף ולחלוטין היעד ניתן לזהות אפילו במקרים שבהם טיהור פיזית קשה, בלתי אפשרי או יקר. החיסרון של השיטה הוא מציאת הפניה מתאימה עבור חיסור וקבלת T-חיובי ושלילי דגימות לבדיקת qPCR. אנו מתארים שלנו ויישום שיטת הזיהוי של הגן הראשון של כרומוזום germline מוגבלת של זברה פינק. במקרה זה סינון חישובית מעורב 3 הפניות (R), ברצף להסיר מעל בשלושה מחזורים: מכלול לא שלם גנומית, הנתונים הגולמיים גנומית, ונתונים transcriptomic.

לאחר הפעלת הפיצוץ, קובץ הפלט יהיה רשימה של רצפי מהשאילתה התואמות במסד הנתונים. לאחר חיסור פיתון, מספר רצפי צורות להיות מושגת, ונבדק על ידי qPCR. התוצאות של זה, ואת השלבים הבאים, נדונים להלן.
שלילי התוצאה. ישנן שתי תוצאות שליליות אפשר?...

Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

גילוי רצף הרומן מאת גנומיקה מופחתים

המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש שילוב של חישובית ומחקר ספסל למצוא רצפי חדשניים אשר לא ניתן להפריד בקלות בין רצף טיהור משותף, אשר עשוי להיות מוכר באופן חלקי בלבד.

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

הפרוטוקול שלנו הוא משמעותי כי זה יכול לשמש כדי לזהות רצפים גנומיים שלא ניתן לבודד רצפי טיהור שותף, אשר עשויים עצמם להיות ידועים רק חלקית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו היא שזה זול, באמצעות תוכנה חופשית בעיקר כי ניתן להוריד, כמו גם גמיש. אתה יכול ליישם את זה על שאלות ביולוגיות רבות.יישומים פוטנציאליים כוללים זיהוי מטרות חיסון חיידקי וזיהוי וירוסים שהרצפים שלהם שונים מאוד ממיקרואורגניזמים ידועים. ניתן להחיל שיטה זו על כל מערכת שבה לא ניתן להפריד את הלא נודע באופן ניסיוני, כל עוד רצף הייחוס ללא היעד הגנומי זמין. טכניקה זו לוקחת קצת ניסוי וטעייה, ולכן סבלנות חשובה.ייתכן שיהיה עליך בעיות לירות בתוכניות. אתה יכול להשתמש בתוכניות שונות מאלה שאנו מתארים כאן. השתמש במדריכים למשתמש ככל האפשר.הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית מכיוון שעבודה חישובית תלויה בהבנה בסיסית של אופן המבנה של תיכנות שורת הפקודה. כדי להתחיל, השתמש Trimmomatic 0.32 כדי להסיר מתאמי illumina ובסיסים באיכות נמוכה. השתמש בגירסה אגס 0.9.11 כדי ליצור קריאות ממוזגות באיכות גבוהה מפלט trimmomatic מזווג קריאות באמצעות פרמטרי ברירת המחדל.לאחר מכן השתמש בגירסה זוחלים 1.1 כדי לתקן את הקרויים המיוצרים באמצעות אגס. לבסוף השתמש ב- Trinity גירסה 2.4.0 במצב ברירת מחדל כדי להרכיב את הרצפים מתוקנים. עבור ספריות ספציפיות לגדילים, השתמש בפרמטר SS_lib_type גדיל.הפלט הוא קובץ FASTA שימוקם בספריה חדשה הנקראת trinity_output. הפוך מסד נתונים BLAST של רצף ההפניה nucleotide_reference. פאסה בשורת הפקודה.BLAST התאימה לשאילתה שהורכבה למסד הנתונים של ההפניה. כדי להשיג קובץ פלט, השתמש BLAST_results. txt כדי ליצור פלט טבלאי הנדרש עבור שלבי עיבוד תת-קווינס עם סקריפטים של פייתון, השתמש ב- outfmt 6 להקפצה מוגברת, השתמש ברצפי חלבונים מההרכבה כשאילתת BLAST עם NUCLEOTIDE BLAST מתורגם, המבצע תרגום שישה-לכיוון של מסד הנתונים של הנוקלאוטיד.כדי להשיג רצפי חלבונים עבור השאילתה, הפעל את TransDecoder. הפקודה Long0rfs כדי לזהות את מסגרות הקריאה הפתוחות הארוכות ביותר מתוך רצפי שאילתות שהורכבו. עכשיו תרוץ תבלסטן.במידת הצורך, ודא שהקוד הגנטי הנכון נבחר עבור האורגניזם הנחקר באמצעות db_gencode עם אפשרות הקוד המתאימה. אם יש התייחסות לחלבון באיכות גבוהה, השתמשו בהתאמת חלבון-חלבון עם blastp במקום tblastn הפוך מסד נתונים BLAST של התייחסות החלבון. הקפד לשמור את התוצאה כקובץ לעיבוד במורד הזרם, ולהשתמש בפלט טבלאי כדי להבטיח שקבצי ה- Script של פייתון יוכלו לנתח אותם כראוי.עכשיו, השתמש בסקריפט הפייתון התת-אקטיבי כדי להסיר רצפים תואמים. כדי למפות את ההיקראות על ההרכבה, השתמש BWA-MEM גירסה 0.7.12 או bowtie 2 כדי למפות את קריאות גלם שהורדו על הרכבת השאילתה. תחילה, צור אינדקס להרכבה ולאחר מכן מפה את ההקרנות.הפלט יהיה בתבנית SAM. הפעל את הסרת קובץ ה- Script של פייתון ללא מיפוי. py באמצעות קובץ SAM כקלט.פעולה זו מזהה את השמות של רצפי שאילתות ללא קריאות תואמות ושמור אותם בקובץ טקסט חדש. הפלט של השלב הקודם הוא רשימה של שמות רצפים בקובץ txt. חלץ קובץ FASTA עם רצפים אלה.הפלט יהיה קובץ fasta. השתמשו ב-Genius כדי לקבוע רצפי פריימר אופטימליים באופן ידני. הדגש רצף מועמדים של 21 עד 28 זוגות בסיס עבור פריימר קדימה, הימנעות ריצות של ארבעה או יותר של כל בסיס.נסו למקד אזור עם שילוב אחיד למדי של כל זוגות הבסיס. G או C יחיד בשלושה פריים אנד מועיל, עוזר לעגן את פריימר. לחץ על הכרטיסיה סטטיסטיקה בצד ימין של המסך כדי להציג את טמפרטורת ההיתוך המשוערת של רצף זה כאשר האזור המועמד מסומן.כוון לטמפרטורת התכה בין 55 ל -60 מעלות צלזיוס, תוך הימנעות מחזרות, ו ריצות ארוכות של G C.Choose פריימר הפוך באותו אופן, ממוקם 150 עד 250 זוגות בסיס שלושה פריים של פריימר קדימה. בעוד אורכי פריימר לא צריך להתאים, טמפרטורת ההיתוך החזוי צריך להיות קרוב ככל האפשר לזה של פריימר קדימה. הקפד להפוך את הרצף על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני ב- Genius בזמן שהרצף מסומן באפשרות תפריט.שיטה חלופית היא להשתמש בפונקציה עיצוב פריימר, שנמצאת בסרגל הכלים העליון בחלון הרצף. הוסף את האזור להגברתו תחת אזור היעד. תחת הכרטיסיה מאפיינים, הוסף את הגודל הרצוי, טמפרטורת ההיתוך ו- G C אחוזים, ולאחר מכן לחץ על אישור כדי ליצור פריימרים.כדי לבצע אימות PCR כמותי של הרצף הנותר, הכינו תחילה תערובת תגובה עבור כל תבנית ב- triplicate, עם תערובת המאסטר הירוקה של SYBR, פריימרים קדימה ואחפה ומים, לנפח כולל של 25 מיקרוליטרים. הפעל תוכנית qPCR המודיעה על-ידי הטמפרטורה ותזמן ההארכה שהיו מאומתים בעבר. עקומות denaturing הסופי צריך להיווצר לפחות בפעם הראשונה פריימרים מועסקים qPCR כדי לאמת את ההגברה של מוצר DNA יחיד.למדוד את האותות הירוקים qPCR SYBR יחסית Actin על ידי Ct עבור כל המקרים, לחשב את הממוצע, ואת סטיית התקן של שניים Ct יחסית Actin. בצע אלקטרופורזה של ג'ל נקודת קצה, כדי לאשר זיהוי נכון של גודל המוצר על-ידי qPCR. כאן, להפעיל 25 microlitres של המוצר qPCR מעורבב עם חמישה microlitres של צבע 6X Glitterol על 2%TAE אגרוז ג'ל ב 200 וולט במשך 20 דקות.אם ה- qPCR שלך מראה שלא זיהית את רצפי היעד, חזור על המחזור כולו עם הפניה חדשה, שעשויה להתקבל ממסד נתונים מקוון. הפרויקט התת-אקטיבי במקרה זה התחיל ברצף ה-RNA מרקמה מרופדת חיידקים של פרוש זברה בוגר זכר ונקבה. בסופו של דבר, זוהו 935 גנים סומטיים שלא נכללו קודם לכן בכל ביאור הגנום.לאחר סינון חישובי, PCR כמותי עשוי להניב תוצאה שלילית שבה לא היה הבדל בזיהוי על פני רקמות ציפורים. לעומת זאת, תוצאה חיובית המייצגת את הזיהוי של רצף יעד אמיתי מאושרת כאשר DNA גנומי qPCR מראה זיהוי גדול יותר סטטיסטית ברקמת העניין, ביחס להתייחסות. כאן, גן הצמד אלפא אומת להיות מוגבל נבט כי זה היה מדולדל ברקמה סומטית יחסית לדנ"א האשכים שבו היה נוכח כי רמות שוות ערך Actin.חשוב לזכור להשתמש בקלט הנכון במהלך כל אחד מהצעדים החישוביים. ייתכן שיהיה עליך לעבור את חיסור המחזור מספר פעמים כדי להשיג את רצף היעד או רצפים. מגוון ניתוחים פילוגנטיים, מבניים ותפקודיים יכולים להתבצע על הגנים שהתגלו.שיטות נוספות אלה מעניקות תובנה לגבי התפקידים האבולוציוניים והתפקודיים של הגנים. זיהינו את הגן הראשון על כרומוזום ציפורי שיר מוגבל נבט, שהרחיב את העניין ביסוד הגנומי המפתיע הזה. העבודה שלאחר מכן הראתה כרומוזומים דומים במין ציפורי שיר רבים המכילים גנים רבים נוספים.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

מבחני מזווג Conjugative עבור ניתוח רצף ספציפי של חלבוני העברה מעורבים קוניוגציה

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

קביעת Location(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור רכיב ה-DNA ב- Escherichia coli באמצעות גישה מוזרה בתיווך Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

ניווט MARRVEL, כלי מבוסס אינטרנט המשלבת גנומיקה האנושית ומודל האורגניזם גנטיקה מידע

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

סיור במרחב הרצף כדי לזהות אתרי כריכה עבור חלבונים כריכת רנ א תקינה

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...