Name: novel sequence discovery by subtractive genomics
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

Gli autori riconoscono Michelle Biederman, Alyssa Pedersen e Colin J. Saldanha per la loro assistenza con il progetto di genomica di zebra finch in varie fasi. Riconosciamo anche Evgeny Bijsk per computing cluster sistema amministrazione e NIH grant 1K22CA184297 (per J.R.B.) e 042767 NS NIH (a C.J.S).

1. sequenza di avvio assemblare de novo
Nota: Qualsiasi dati di sequenza di generazione (NGS) possono essere utilizzati, purché un assembly può essere prodotto da tali dati. Dati di input adatti includono Illumina, PacBio, o Oxford Nanopore legge assemblata in un file fasta. Per concretezza, questa sezione descrive un assembly basati su Illumina Transcrittomica specifico allo studio zebra finch abbiamo effettuato7; tuttavia essere consapevoli che le specifiche ...

<ol>
	<li>Barh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Comparative+Genomics+Analysis+for+Common+Drug+and+Vaccine+Targets+in+Corynebacterium+pseudotuberculosis+and+other+CMN+Group+of+Human+Pathogens.">A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).</li><li>Sarangi, A. 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Mentre sottrattiva genomica è potente, non si tratta di un approccio cookie cutter, che richiedono personalizzazione in diversi passaggi chiave e un'attenta selezione di sequenze di riferimento e campioni di prova. Se l'assembly di query è di scarsa qualità, passaggi di filtraggio potrebbe isolare solo artefatti di assemblaggio. Pertanto, è importante convalidare accuratamente l'Assemblea de novo utilizzando un protocollo di convalida appropriata al progetto specifico. Per RNA-seq, linee sono fornite sul sit...

Lo scopo di questo metodo consiste nell'identificare un'obiettivo novello (T) sequenza genomic, DNA o RNA, da un contesto genomico, o un riferimento (R) (Figura 1). Il metodo è più utile se la destinazione non può essere fisicamente separata, o che sarebbe stato costoso farlo. Solo alcuni organismi hanno perfettamente finito genomi per sottrazione, quindi un'innovazione chiave del nostro metodo è la combinazione di calcolo e metodi di panca in un ciclo che permette ai ricercatori di isolare sequenze bersaglio quando il riferimento è imperfetto, o un progetto genoma da un organismo non-modello. Alla fine di un ciclo, qPCR test viene utilizzato per determinare se è necessario più di sottrazione. Una sequenza di convalidato candidato T mostrerà statisticamente maggiore rilevamento in noti campioni di T-positivi di qPCR.
Incarnazioni del metodo sono state implementate nella scoperta di nuovi bersagli farmacologici batterica che non dispongono di host omologhi1,2,3,4 e identificazione di nuovi virus da host infetti 5,6. Oltre alla identificazione di T, il metodo può migliorare r: recentemente abbiamo utilizzato il metodo per identificare 936 geni mancanti dal genoma di riferimento zebra finch e un nuovo gene da una sola linea germinale del cromosoma (T)7. La genomica sottrattiva è particolarmente preziosa quando T rischia di essere estremamente divergenti da sequenze conosciute o quando l'identità di T è ampiamente definito, come la zebra finch germline-limitata del cromosoma7.
Non richiedendo identificazione positiva di T in anticipo, un vantaggio chiave della genomica sottrattiva è che è imparziale. In uno studio recente, Readhead et al ha esaminato la relazione tra il morbo di Alzheimer e virale abbondanza nelle quattro regioni del cervello. Per identificazione virale, Readhead et al ha creato un database di 515 virus8, limitando gravemente l'agenti virali che poteva identificare i loro studio. Sottrattiva genomica potrebbe sono stati utilizzati per confrontare i sani e genomi di morbo di Alzheimer al fine di isolare possibili nuovi virus associati alla malattia, indipendentemente dalla loro somiglianza con gli agenti infettivi noti. Mentre ci sono 263 noto virus umani-targeting, è stato stimato che circa 1,67 milioni da scoprire specie virale esistono, con 631.000-827.000 di loro che hanno un potenziale di infettare gli esseri umani9.
Isolamento di nuovi virus è un'area in cui sottrattiva genomica è particolarmente efficace, ma alcuni studi potrebbero non essere necessario tale metodo rigoroso. Ad esempio, studi identificazione nuovi virus hanno usato imparziale high throughput sequenziamento, seguita da trascrizione d'inversione e BLASTx per sequenze virali5 o arricchimento degli acidi nucleici virali per estrarre e invertire trascrivono sequenze virali 6. mentre questi studi impiegato sequenziamento de novo e assemblaggio, sottrazione non è stato utilizzato perché le sequenze bersaglio sono stati positivamente identificate attraverso BLAST. Se i virus erano completamente nuovi e non correlati (o lontanamente correlate) ad altri virus, genomica sottrattiva sarebbe stato una tecnica utile. Il vantaggio della genomica sottrattiva è che si possono ottenere sequenze che sono completamente nuove. Se è noto il genoma dell'organismo, possono essere sottratti fuori di lasciare eventuali sequenze virali. Ad esempio, nel nostro studio pubblicato abbiamo isolato una romanzo sequenza virale da zebra finch attraverso sottrattiva genomica, anche se non era nostro intento originale7.
Sottrattiva genomica si è dimostrata utile per l'identificazione di bersagli di vaccino batterico, motivati dall'aumento drammatico nella resistenza agli antibiotici1,2,3,4. Per ridurre al minimo il rischio di reazione autoimmune, ricercatori ha ristretto i potenziali bersagli di vaccino sottraendo qualsiasi proteine che sono omologhi nell'ospite umano. Uno studio particolare, guardando la pseudotuberculosi del corinebatterio, eseguita la sottrazione dei genoma ospite vertebrato da diversi genomi batterici per garantire che gli obiettivi della droga possibile non inciderebbe proteine nei padroni di casa che conduce agli effetti collaterali 1. il flusso di lavoro di base di questi studi è quello di scaricare il proteoma batterico, determinare le proteine vitali, rimuovere le proteine ridondanti, utilizzare BLASTp per isolare le proteine essenziali e BLASTp contro host proteoma per rimuovere eventuali proteine con gli omologhi host 1 , 2 , 3 , 4. In tal caso, genomica sottrattiva assicura che i vaccini sviluppati non avrà alcun effetto fuori bersaglio in host1,2,3,4.
Abbiamo usato sottrattiva genomica per identificare il primo gene di proteina-codificazione su un limitato di germline cromosoma (GRC) (in questo caso, T), che si trova in germlines ma non somatica tessuto di entrambi i sessi10. Prima di questo studio, le informazioni solo genomiche che è state conosciute circa il GRC è stato una regione ripetitiva11. De novo montaggio è stato eseguito su RNA sequenziato dai tessuti dell'ovaia e teste (R + T) da adulti zebra fringuelli. L'eliminazione computazionale delle sequenze è stata eseguita utilizzando pubblicati somatica (muscolo) genome sequence (R1)12, suo crudo (Sanger) leggere dati (R2) e un somatico (cervello) trascrittoma (R3)13. L'uso sequenza di tre riferimenti è stato guidato dalla qPCR test passaggio 5 di ciascun ciclo (Figura 2A), mostrando che altre opzioni di filtro è stato richiesto. Il gene α-SNAP scoperto è stato confermato mediante qPCR da DNA e RNA e clonazione e sequenziamento. Vi mostriamo nel nostro esempio che questo metodo è flessibile: non è dipenda su corrispondenti acidi nucleici (DNA vs RNA) e quello sottrazione può essere eseguita con riferimenti (R) che sono costituiti da assembly o crude letture.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:499px;" width="498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accustart II Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:65px;">Quanta Bio</td>
			<td align="right" style="width:52px;">95141</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST)</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Bowtie 2</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://www.python.org/download/releases/2.7/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">BWA-MEM v. 0.7.12</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geneious</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">PEAR v. 0.9.6</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Personal Computer</td>
			<td style="width:65px;">Biomatters</td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.geneious.com/</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:215px;">PowerSYBR qPCR mix</td>
			<td style="width:65px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:52px;">4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Python v. 2.7</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Reptile v.1.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">Stratagene Mx3005P</td>
			<td style="width:65px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:52px;">401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TransDecoder v. 3.0.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Trinity v. 2.4.0</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel sequence discovery by subtractive genomics

Sottrattiva genomica può essere utilizzato in qualsiasi ricerca dove l'obiettivo è quello di identificare la sequenza di un gene, la proteina o la regione generale che è incorporato in un contesto più ampio di genomico. Genomica sottrattivo consente un ricercatore isolare una sequenza di destinazione di interesse (T) mediante sequenziamento completo e sottrazione di elementi genetici conosciuti (riferimento, R). Il metodo può essere utilizzato per identificare nuove sequenze quali mitocondri, cloroplasti, virus, o germinale limitato di cromosomi ed è particolarmente utile quando T non può essere facilmente isolato da R. cominciando con i dati di genomici completi (R + T), il metodo utilizza base locale allineamento Cerca strumento (BLAST) contro una sequenza di riferimento, o sequenze, per rimuovere le sequenze note corrispondenti (R), lasciando dietro il bersaglio (T). Per la sottrazione funzionare al meglio, R dovrebbe essere una brutta copia relativamente completa che manca T. Dal sequenze restanti dopo sottrazione sono testati attraverso quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R non deve necessariamente essere completo per il metodo di lavoro. Qui ci colleghiamo passi computazionali con procedura sperimentale in un ciclo che può essere ripetuto se necessario, in sequenza rimozione più sequenze di riferimento e la rifinitura la ricerca di T. Il vantaggio della genomica sottrattiva è che una sequenza completamente nuovi target può essere identificata anche nei casi in cui la purificazione fisica è difficile, impossibile o costoso. Uno svantaggio del metodo è trovare un riferimento adatto per sottrazione e ottenere T-positivo e negativo di campioni per le prove di qPCR. Descriviamo la nostra implementazione del metodo nell'identificazione del primo gene sul cromosoma germline-limitata di zebra finch. In tal caso filtraggio computazionali coinvolti tre riferimenti (R), rimossi in sequenza su tre cicli: montaggio genomica incompleta, raw dati genomici e dati di trascrittomica.

Dopo l'esecuzione di BLAST, il file di output avrà un elenco di sequenze dalla query che corrisponda al database. Dopo la sottrazione di Python, un numero di sequenze non corrispondenti sarà ottenuto e testato da qPCR. I risultati di questo e prossimi passi, sono discussi di seguito.
Risultato negativo. Ci sono due possibili risultati negativi che possono essere visto dopo BLAST per la sequenza di riferimento....

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Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Scoperta di romanzo sequenza genomica sottrattiva

Lo scopo del presente protocollo è quello di utilizzare una combinazione di computazionale e panca ricerca per trovare nuove sequenze che non possono essere facilmente separate da una sequenza co-purificante, che può essere conosciuta solo parzialmente.

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Il nostro protocollo è significativo perché può essere utilizzato per identificare sequenze genomiche che non possono essere isolate da sequenze co-purificanti, che a loro volta possono essere conosciute solo parzialmente. I principali vantaggi di questa tecnica è che è economica, utilizzando principalmente software gratuito che può essere scaricato e flessibile. Puoi applicarlo a molte domande biologiche.Le potenziali applicazioni includono l'identificazione di bersagli di vaccini batterici e l'identificazione di virus le cui sequenze sono estremamente diverse dai microbi noti. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi sistema in cui l'ignoto non può essere separato sperimentalmente, purché sia disponibile la sequenza di riferimento senza il bersaglio genomico. Questa tecnica richiede alcuni tentativi ed errori, quindi la pazienza è importante.Potrebbe essere necessario creare problemi a riprendere i programmi. È possibile utilizzare programmi diversi da quelli che descriviamo qui. Utilizzare i manuali d'uso il più possibile.La dimostrazione visiva di questo metodo è utile perché il lavoro computazionale dipende da una comprensione di base di come è strutturata la programmazione della riga di comando. Per iniziare, utilizzare Trimmomatic 0.32 per rimuovere adattatori illuminanti e basi di bassa qualità. Utilizzate Pear versione 0.9.11 per creare letture unite di alta qualità da letture accoppiate di output trimmomatico utilizzando parametri predefiniti.Quindi utilizzare Reptile versione 1.1 per correggere le letture prodotte tramite Pear. Infine, utilizzate Trinity versione 2.4.0 in modalità predefinita per assemblare le sequenze corrette. Per le librerie specifiche del filamento, utilizzare il SS_lib_type di sezione.L'output è un file FASTA che verrà inserito in una nuova directory denominata trinity_output. Creare un database BLAST della sequenza di riferimento nucleotide_reference. fasta alla riga di comando.BLAST corrispondeva alla query assemblata al database di riferimento. Per ottenere un file di output, utilizzare BLAST_results. txt Per generare l'output tabulare necessario per le fasi di elaborazione della sottosequenza con script Python, utilizzare outfmt 6 Per aumentare il rigore, utilizzare sequenze proteiche dall'assembly come query BLAST con blast nucleotidico tradotto, che esegue la traduzione a sei del database nucleotidico.Per ottenere sequenze proteiche per la query, eseguire transdecoder. Long0rfs per identificare i frame di lettura aperti più lunghi dalle sequenze di query assemblate. Ora esegui tblastn.Se necessario, assicurarsi che il codice genetico corretto sia selezionato per l'organismo studiato utilizzando il db_gencode con un'opzione di codice appropriata. Se è disponibile un riferimento proteico di alta qualità, utilizzare l'abbinamento proteina-proteina con blastp piuttosto che tblastn Creare un database BLAST del riferimento proteico. Assicurati di salvare il risultato come file per l'elaborazione downstream e usa l'output tabulare per assicurarti che gli script Python possano analizzarli correttamente.Ora, usa lo script Python sottrattivo per rimuovere eventuali sequenze corrispondenti. Per mappare le letture sull'assembly, utilizzare BWA-MEM versione 0.7.12 o bowtie 2 per mappare le letture non elaborati scaricate nell'assembly di query. In primo luogo, indicizzare l'assembly, quindi mappare le letture.L'output sarà in formato SAM. Eseguire lo script Python removeUnmapped. py utilizzando il file SAM come input.In questo modo vengono identificati i nomi delle sequenze di query senza alcuna lettura corrispondente e vengono salvate in un nuovo file di testo. L'output del passaggio precedente è un elenco di nomi di sequenze in un file txt. Estrarre un file FASTA con queste sequenze.L'output sarà un file fasta. Utilizzare Genius per determinare manualmente le sequenze di primer ottimali. Evidenziare una sequenza candidata da 21 a 28 coppie di basi per il primer in avanti, evitando corse di quattro o più di qualsiasi base.Prova a indirizzare una regione con una combinazione abbastanza uniforme di tutte le coppie di basi. Una singola G o C a tre Prime End è benefica, aiutando ad ancorare il primer. Fare clic sulla scheda Statistiche sul lato destro dello schermo per visualizzare la temperatura di fusione stimata di tale sequenza man mano che viene evidenziata l'area candidata.Puntare a una temperatura di fusione compresa tra 55 e 60 gradi Celsius, evitando ripetizioni, e lunghe corse di G C.Scegliere un primer inverso nello stesso modo, situato da 150 a 250 coppie di basi tre prime del primer in avanti. Mentre le lunghezze del primer non devono corrispondere, la temperatura di fusione prevista dovrebbe essere il più vicina possibile a quella del primer in avanti. Assicurati di invertire la sequenza facendo clic con il pulsante destro del mouse su Genius mentre una sequenza è evidenziata in un'opzione di menu.Un metodo alternativo è quello di utilizzare la funzione Primer Design, che si trova nella barra degli strumenti superiore nella finestra Sequenza. Inserire l'area da amplificare in Area di destinazione. Nella scheda caratteristiche inserire la dimensione desiderata, la temperatura di fusione e la percentuale G C, quindi fare clic su OK per generare primer.Per eseguire la convalida quantitativa pcr della sequenza rimanente, preparare prima una miscela di reazione per ogni modello in triplice copia, con il nostro SYBR Green Master Mix, primer avanti e indietro e acqua, per un volume totale di 25 microlitri. Eseguire un programma qPCR informato dalla temperatura e dal tempo di estensione convalidati in precedenza. Le curve finali di denaturazione devono essere generate almeno la prima volta che i primer vengono impiegati in qPCR per convalidare l'amplificazione di un singolo prodotto del DNA.Misurare i segnali qPCR SYBR Green relativi ad Actin da Ct Per tutti i casi, calcolare la media e la deviazione standard di due alla Ct rispetto ad Actin. Eseguire l'elettroforesi del gel endpoint, per confermare il corretto rilevamento delle dimensioni del prodotto da parte di qPCR. Qui, eseguire 25 microlitri del prodotto qPCR miscelati con cinque microlitri di colorante glitterolo 6X su un gel 2%TAE Agarose a 200 volt per 20 minuti.Se qPCR mostra che non sono state identificate le sequenze di destinazione, ripetere l'intero ciclo con un nuovo riferimento, che può essere ottenuto da un database online. Il progetto sottrattivo in questo caso è iniziato con il sequenziamento dell'RNA dal tessuto rivestito di germi di fringuello zebra adulto maschio e femmina. Alla fine, sono stati identificati 935 geni somatici che non erano precedentemente inclusi nell'annotazione dell'intero genoma.Dopo il filtraggio computazionale, la PCR quantitativa può produrre un risultato negativo in cui non vi è stata alcuna differenza nel rilevamento tra i tessuti degli uccelli. Al contrario, un risultato positivo che rappresenta l'identificazione di una vera sequenza bersaglio è confermato quando il DNA genomico qPCR mostra un rilevamento statisticamente maggiore nel tessuto di interesse, rispetto al riferimento. Qui, il gene dello snap alfa è stato convalidato per essere limitato alla linea germinale perché era impoverito nel tessuto somatico rispetto al DNA dei testee dove era presente che livelli equivalenti ad Actin.È importante ricordare di utilizzare gli input corretti durante ciascuno dei passaggi computazionali. Potrebbe essere necessario passare attraverso la sottrazione del ciclo più volte per ottenere la sequenza o le sequenze di destinazione. Una varietà di analisi filogenetiche, strutturali e funzionali possono essere eseguite sui geni scoperti.Questi metodi aggiuntivi forniscono informazioni sui ruoli evolutivi e funzionali dei geni. Abbiamo identificato il primo gene su un cromosoma songbird limitato dalla linea germinale, che ha ampliato l'interesse per questo sorprendente elemento genomico. Lavori successivi hanno mostrato cromosomi simili in molte specie di uccelli canori contenenti molti geni aggiuntivi.

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