Name: novel sequence discovery by subtractive genomics
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

Forfatterne bekrefter Michelle Biederman, Alyssa Pedersen og Colin J. Saldanha for deres hjelp med zebra finch genomics prosjektet på ulike stadier. Vi erkjenner også Evgeny Bisk for databehandling klynge systemadministrasjon og NIH grant 1K22CA184297 (til J.R.B.) og NIH NS 042767 (til C.J.S).

1. de novo montere starter sekvens
Merk: Neste generasjon sekvens (NGS) data kan brukes, så lenge en samling kan bli produsert fra disse dataene. Egnet inndataene inneholder Illumina, PacBio, eller Oxford Nanopore leser montert i fasta fil. Concreteness, denne delen beskriver en Illumina-baserte transcriptomic samling gjelder zebra finch studien vi utført7; men vær oppmerksom på at detaljene vil variere etter prosjekt. For vårt eksempel prosjekt, rådata var...

<ol>
	<li>Barh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Comparative+Genomics+Analysis+for+Common+Drug+and+Vaccine+Targets+in+Corynebacterium+pseudotuberculosis+and+other+CMN+Group+of+Human+Pathogens.">A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).</li><li>Sarangi, A. N., Aggarwal, R., Rahman, Q., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtractive+Genomics+Approach+for+in+Silico+Identification+and+Characterization+of+Novel+Drug+Targets+in+Neisseria+Meningitides+Serogroup+B.">Subtractive Genomics Approach for in Silico Identification and Characterization of Novel Drug Targets in Neisseria Meningitides Serogroup B.</a> Journal of Computer Science &amp; Systems Biology. 2 (5), (2009).</li><li>Kaur, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Druggable+Targets+for+Acinetobacter+baumannii+Via+Subtractive+Genomics+and+Plausible+Inhibitors+for+MurA+and+MurB.">Identification of Druggable Targets for Acinetobacter baumannii Via Subtractive Genomics and Plausible Inhibitors for MurA and MurB.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 171 (2), 417-436 (2013).</li><li>Rathi, B., Sarangi, A. N., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+subtraction+for+novel+target+definition+in+Salmonella+typhi.">Genome subtraction for novel target definition in Salmonella typhi.</a> Bioinformation. 4 (4), 143-150 (2009).</li><li>Epstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+GBV-D,+a+Novel+GB-like+Flavivirus+from+Old+World+Frugivorous+Bats+(Pteropus+giganteus)+in+Bangladesh.">Identification of GBV-D, a Novel GB-like Flavivirus from Old World Frugivorous Bats (Pteropus giganteus) in Bangladesh.</a> PLoS Pathogens. 6 (7), (2010).</li><li>Kapoor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Rodent+Homologs+of+Hepatitis+C+Virus+and+Pegiviruses.">Identification of Rodent Homologs of Hepatitis C Virus and Pegiviruses.</a> MBio. 4 (2), (2013).</li><li>Biederman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+First+Germline-Restricted+Gene+by+Subtractive+Transcriptomic+Analysis+in+the+Zebra+Finch,+Taeniopygia+guttata.">Discovery of the First Germline-Restricted Gene by Subtractive Transcriptomic Analysis in the Zebra Finch, Taeniopygia guttata.</a> Current Biology. 28 (10), 1620-1627 (2018).</li><li>Readhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Analysis+of+Independent+Alzheimer's+Cohorts+Finds+Disruption+of+Molecular,+Genetic,+and+Clinical+Networks+by+Human+Herpesvirus.">Multiscale Analysis of Independent Alzheimer's Cohorts Finds Disruption of Molecular, Genetic, and Clinical Networks by Human Herpesvirus.</a> Neuron. 99, 1-19 (2018).</li><li>Carroll, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+virome+project.">The global virome project.</a> Science. 359 (6378), 872-874 (2016).</li><li>Pigozzi, M. I., Solari, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+restriction+and+regular+transmission+of+an+accessory+chromosome+that+mimics+a+sex+body+in+the+zebra+finch.+Taeniopygia+guttata.">Germ cell restriction and regular transmission of an accessory chromosome that mimics a sex body in the zebra finch. Taeniopygia guttata.</a> Chromosome Research. 6, 105-113 (1998).</li><li>Itoh, Y., Kampf, K., Pigozzi, M. I., Arnold, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+characterization+of+the+germline-restricted+chromosome+sequence+in+the+zebra+finch.">Molecular cloning and characterization of the germline-restricted chromosome sequence in the zebra finch.</a> Chromosoma. 118, 527-536 (2009).</li><li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+a+songbird.">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li><li>Balakrishnan, C. N., Lin, Y. C., London, S. E., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+transcriptome+analysis+of+male+and+female+zebra+finch+cell+lines.">RNAseq transcriptome analysis of male and female zebra finch cell lines.</a> Genomics. 100, 363-369 (2012).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAR:+a+fast+and+accurate+Illumina+Paired-End+reAd+mergeR.">PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR.</a> Bioinformatics. 30, 614-620 (2014).</li><li>Yang, X., Dorman, K. S., Aluru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reptile:+representative+tiling+for+short+read+error+correction.">Reptile: representative tiling for short read error correction.</a> Bioinformatics. 26, 2526-2533 (2010).</li><li>MacManes, M. D., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+transcriptome+assembly+through+error+correction+of+high-throughput+sequence+reads.">Improving transcriptome assembly through error correction of high-throughput sequence reads.</a> PeerJ. 1 (113), (2013).</li><li>Grabherr, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+transcriptome+assembly+from+RNA-seq+data+without+a+reference+genome.">Full-length transcriptome assembly from RNA-seq data without a reference genome.</a> Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).</li><li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+sequence+reads,+clone+sequences+and+assembly+contigs+with+BWA-MEM.">Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM.</a> arXiv. , (2013).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357-359 (2012).</li><li>Kearse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geneious+Basic:+an+integrated+and+extendable+desktop+software+platform+for+the+organization+and+analysis+of+sequence+data.">Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data.</a> Bioinformatics. 28 (12), 1647-1649 (2012).</li><li>Peirson, S. N., Butler, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+polymerase+chain+reaction.">Quantitative polymerase chain reaction.</a> Methods in Molecular Biology. 362, 349-362 (2007).</li><li>Hunt, M., Kikuchi, T., Sanders, M., Newbold, C., Berriman, M., Otto, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAPR+citation:+REAPR:+a+universal+tool+for+genome+assembly+evaluation.">REAPR citation: REAPR: a universal tool for genome assembly evaluation.</a> Genome Biology. 14 (5), (2013).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mitochondrial+genome+sequence+of+a+hominin+from+Sima+de+los+Huesos.">A mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos.</a> Nature. 505 (7483), 403-406 (2013).</li><li>Gunnarsd&#243;ttir, E. D., Li, M., Bauchet, M., Finstermeier, K., Stoneking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+complete+human+mtDNA+genomes+from+the+Philippines.">High-throughput sequencing of complete human mtDNA genomes from the Philippines.</a> Genome Research. 21 (1), 1-11 (2010).</li><li>King, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+and+high-throughput+massively+parallel+sequencing+of+the+human+mitochondrial+genome+using+the+Illumina+MiSeq.">High-quality and high-throughput massively parallel sequencing of the human mitochondrial genome using the Illumina MiSeq.</a> Forensic Science International: Genetics. 12, 128-135 (2014).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+in+Actinidiaceae:+Genome+Structure+and+Comparative+Analysis.">The First Complete Chloroplast Genome Sequences in Actinidiaceae: Genome Structure and Comparative Analysis.</a> Plos One. 10 (6), (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+of+Five+Epimedium+Species:+Lights+into+Phylogenetic+and+Taxonomic+Analyses.">The Complete Chloroplast Genome Sequences of Five Epimedium Species: Lights into Phylogenetic and Taxonomic Analyses.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oxytricha+trifallax+Mitochondrial+Genome.">The Oxytricha trifallax Mitochondrial Genome.</a> Genome Biologyogy and Evolution. 4 (2), 136-154 (2011).</li><li>Barth, D., Berendonk, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome+sequence+of+the+ciliate+Paramecium+caudatum+reveals+a+shift+in+nucleotide+composition+and+codon+usage+within+the+genus+Paramecium.">The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium.</a> BMC Genomics. 12 (1), (2011).</li><li>Coombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Complete+Sitka+Spruce+Chloroplast+Genome+Using+10X+Genomics'+GemCode+Sequencing+Data.">Assembly of the Complete Sitka Spruce Chloroplast Genome Using 10X Genomics' GemCode Sequencing Data.</a> Plos One. 11 (9), (2016).</li><li>Herschleb, J., Ananiev, G., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis.">Pulsed-field gel electrophoresis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).</li></ol>

Mens subtraktiv genomics er kraftig, er det ikke en cookie-cutter tilnærming, krever tilpasning på flere viktige trinn, og forsiktig utvalg av referanse sekvenser og test prøver. Hvis spørringssamlingen er av dårlig kvalitet, kan filtrering trinn bare isolere montering gjenstander. Derfor er det viktig å validere grundig de novo samlingen med en aktuell validering-protokollen til det bestemte prosjektet. For RNA-seq, er retningslinjene gitt på Trinity nettsted18 og DNA, et verktøy...

Formålet med denne metoden er å identifisere en roman mål (T) genomisk sekvens, DNA eller RNA, fra genomisk sammenheng eller referanse (R) (figur 1). Metoden er mest nyttig hvis målet ikke kan deles fysisk, eller det ville være kostbart å gjøre dette. Bare noen organismer er helt ferdig genomer for subtraksjon, så en nøkkel innovasjon av vår metode er kombinasjonen av beregningsorientert og benk metoder i en syklus aktivere forskere isolere målet sekvenser når referansen er ufullkommen, eller en kladd genomet fra en ikke-modellen organisme. På slutten av en syklus, qPCR tester til å avgjøre om mer subtraksjon er nødvendig. En godkjent kandidat T sekvens viser statistisk større oppdagelsen i kjente T-positive eksempler av qPCR.
Inkarnasjoner av metoden som er implementert i oppdagelsen av nye bakteriell narkotika mål som ikke har vert, homologs,1,,2,,3,,4 og identifikasjon av romanen virus fra infiserte verter 5,6. I tillegg til identifikasjon av T, kan metoden forbedre R: vi nylig brukte metoden for å identifisere 936 nyrekreft fra zebra finch referanse genomet og en ny genetisk fra en germline bare kromosom (T)7. Subtraktiv genomics er spesielt verdifull når T er trolig bli svært avvikende fra kjente sekvenser eller når identiteten til T er bredt definert, som zebra finch germline begrenset kromosom7.
Ikke kreves positiv identifikasjon av T på forhånd, er en viktig fordel med subtraktiv genomics at det er saklig. I en fersk studie undersøkte Readhead et al. forholdet mellom Alzheimers og viral overflod i fire områder av hjernen. Viral identifikasjon, Readhead et al. opprettet en database 515 virus8, sterkt begrense viral agenter som deres studie kunne identifisere. Subtraktiv genomics kunne blitt brukt til å sammenligne den sunne og Alzheimers genomer for å isolere mulig romanen virus knyttet til sykdommen, uansett deres likhet med kjente smittestoffer. Mens det er 263 menneskelige målretting virus, er det anslått at ca 1,67 millioner uoppdagede viral arter finnes, med 631,000-827,000 av dem har et potensial til å infisere mennesker9.
Isolering av romanen virus er et område der subtraktiv genomics er spesielt effektive, men noen studier ikke trenger slik strenge metode. For eksempel transkribere studier identifiserende romanen virus har brukt upartiske høy gjennomstrømming sekvensering etterfulgt av omvendt transkripsjon og BLASTx for viral sekvenser5 eller berikende av viral nukleinsyrer å trekke ut og reversere viral sekvenser 6. mens disse studiene ansatt de novo sekvensering og montering, subtraksjon ikke ble brukt fordi målet sekvenser ble positivt identifisert gjennom BLAST. Hvis virusene var helt ny og ikke relatert (eller fjernt beslektede) til andre virus, subtraktiv genomics ville ha vært en nyttig teknikk. Fordelen med subtraktiv genomics er at sekvenser som er helt nye kan hentes. Hvis den organismes genom er kjent, kan det trekkes ut for å forlate noen viral sekvenser. For eksempel i våre publisert studie isolerte vi en roman viral sekvens fra zebra finch gjennom subtraktiv genomics, men det ikke var våre opprinnelige hensikt7.
Subtraktiv genomics har også vist seg nyttig ved identifikasjon av bakteriell vaksine mål, motivert av den dramatiske økningen i antibiotikaresistens1,2,3,4. For å minimere risikoen for autoimmun reaksjon, forskere snevret ned potensielle vaksine målene ved å trekke noen proteiner som har homologs i menneskelig verten. En bestemt studie, etter Corynebacterium pseudotuberculosis, utført subtraksjon av virveldyr vert genomer fra flere bakteriell genomer slik at mulige narkotika mål ikke vil påvirke proteiner i vertene fører til bivirkninger 1. grunnleggende arbeidsflyten for disse studiene er å laste ned den bakterielle proteom, finne viktige proteiner, fjerne overflødig proteiner, bruke BLASTp å isolere den essensielle proteiner og BLASTp mot vert proteom fjerner eventuelle proteiner med verten homologs 1 , 2 , 3 , 4. I dette tilfellet subtraktiv genomics sikre at vaksiner utviklet ikke vil ha noen off-målet effekter i vert1,2,3,4.
Vi brukte subtraktiv genomics å identifisere første protein-koding genet på en germline-begrenset kromosom (GRC) (i dette tilfellet, T), som finnes i germlines men ikke somatiske vev av begge kvinners10. Før denne studien var bare genomisk informasjon som var kjent om GRC en repeterende regionen11. De novo samlingen ble utført på RNA sekvensielt fra eggstokken og teste vev (R + T) fra voksen zebra finches. Beregningsorientert eliminering av sekvenser ble utført publiserte somatiske (muskel) genomet sekvens (R1)12, sin rå (Sanger) lese data (R2) og en somatiske (hjernen) transcriptome (R3)13. Sekvensiell bruk av tre referanser ble drevet av qPCR testing på trinn 5 hver syklus (figur 2A), viser at ekstra filtrering var nødvendig. Oppdaget α-SNAPPER genet ble bekreftet gjennom qPCR DNA og RNA, kloning og sekvenser. Vi viser i vårt eksempel at denne metoden er fleksibel: det er ikke avhengig av matchende nucleic syrer (DNA vs RNA) og subtraksjon som kan utføres med referanser (R) som består av samlinger eller lese rådata.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:499px;" width="498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accustart II Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:65px;">Quanta Bio</td>
			<td align="right" style="width:52px;">95141</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST)</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Bowtie 2</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://www.python.org/download/releases/2.7/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">BWA-MEM v. 0.7.12</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geneious</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">PEAR v. 0.9.6</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Personal Computer</td>
			<td style="width:65px;">Biomatters</td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.geneious.com/</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:215px;">PowerSYBR qPCR mix</td>
			<td style="width:65px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:52px;">4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Python v. 2.7</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Reptile v.1.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">Stratagene Mx3005P</td>
			<td style="width:65px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:52px;">401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TransDecoder v. 3.0.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Trinity v. 2.4.0</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel sequence discovery by subtractive genomics

Subtraktiv genomics kan brukes i noen forskning der målet er å identifisere sekvensen av genet, protein eller generelle regionen som er innebygd i en større genomisk sammenheng. Subtraktiv genomics kan forsker isolere en mål sekvens av interesse (T) av omfattende sekvensering og trekke ut kjent genetisk elementene (referanse, R). Metoden kan brukes til å identifisere romanen sekvenser som mitokondrier, chloroplasts, virus eller germline begrenset kromosomer, og er spesielt nyttig når T ikke kan være lett isolert fra R. begynner med omfattende genomic data (R + T), metoden bruker grunnleggende lokale justering Søk verktøyet (BLAST) mot en referanse sekvens eller sekvenser, fjerne den samsvarende kjente sekvenser (R), etterlater målet (T). Subtraksjon å fungere best, bør R være et relativt komplett utkast som mangler T. Siden sekvenser igjen etter subtraksjon er testet gjennom kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR), trenger R ikke å være komplett for metoden arbeide. Her koble vi beregningsorientert trinn med eksperimentelle skritt inn i en syklus som kan være iterated nødvendig sekvensielt fjerne flere referanse sekvenser og raffinering Søk etter T. Fordelen med subtraktiv genomics er at en helt ny målet sekvens kan identifiseres selv i tilfeller der fysisk rensing er vanskelig, umulig eller dyrt. En ulempe metoden er å finne en passende referanse for subtraksjon og få T-positive og negative prøver for qPCR testing. Vi beskriver implementeringen av metoden i identifikasjon av første genet fra germline-begrenset kromosomet av zebra finch. I så fall beregningsorientert filtrering involvert tre referanser (R), sekvensielt fjernet over tre sykluser: en ufullstendig genomisk montering, rå genomic data og transcriptomic data.

Etter running BLAST, vil utdatafilen ha en liste over sekvenser fra spørringen som samsvarer med databasen. Etter Python subtraksjon, vil en rekke ikke-samsvarende sekvenser være innhentet, og testet av qPCR. Resultatene av dette, og neste er omtalt nedenfor.
Negative resultatet. Det er to mulige negative konsekvenser som kan sees etter BLAST referanse-sekvensen. Det kan være noen BLAST resultater, betyr at d...

Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Romanen sekvens oppdagelsen av subtraktiv Genomics

Formålet med denne protokollen er å bruke en kombinasjon av beregningsorientert og benk forskning for å finne romanen sekvenser som ikke kan lett skilles fra en co rensing rekkefølge, som kan være bare delvis kjent.

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Vår protokoll er betydelig fordi den kan brukes til å identifisere genomiske sekvenser som ikke kan isoleres fra samtidige rensende sekvenser, som selv bare kan være delvis kjent. De viktigste fordelene med denne teknikken er at det er billig, ved hjelp av det meste gratis programvare som kan lastes ned, så vel som fleksibel. Du kan bruke den på mange biologiske spørsmål.Potensielle bruksområder inkluderer å identifisere bakterielle vaksinemål og identifisere virus hvis sekvenser er ekstremt forskjellige fra kjente mikrober. Denne metoden kan brukes på ethvert system der det ukjente ikke kan skilles eksperimentelt, så lenge referansesekvensen uten genomisk mål er tilgjengelig. Denne teknikken tar litt prøving og feiling, så tålmodighet er viktig.Du må kanskje problemer med å skyte programmene. Du kan bruke programmer som er forskjellige fra de vi beskriver her. Bruk brukerhåndbøkene så mye som mulig.Visuell demonstrasjon av denne metoden er nyttig fordi beregningsarbeid er avhengig av en grunnleggende forståelse av hvordan kommandolinjeprogrammering er strukturert. Til å begynne med bruker du Trimmomatic 0,32 til å fjerne belysningsadaptere og baser av lav kvalitet. Bruk Pear versjon 0.9.11 til å lage flettede leser av høy kvalitet fra trimmomatiske utdataparede leser ved hjelp av standardparametere.Bruk deretter Reptile versjon 1.1 til å feil korrigere lest opp gjennom Pear. Til slutt bruker du Trinity versjon 2.4.0 i standardmodus for å montere de korrigerte sekvensene. For strandspesifikke biblioteker bruker du SS_lib_type parameteren.Utdataene er en FASTA-fil som vil bli plassert i en ny katalog kalt trinity_output. Lag en BLAST-database for referansesekvensen nucleotide_reference. fasta ved kommandolinjen.BLAST samsvarte spørringen som er montert med referansedatabasen. Hvis du vil hente en utdatafil, bruker BLAST_results. txt Hvis du vil generere tabellutdata som kreves for behandlingstrinn under avsnittet med Python-skript, bruker du outfmt 6 For økt stringency bruker du proteinsekvenser fra samlingen som BLAST-spørringen med oversatt nukleotid BLAST, som utfører seksveis oversettelse av nukleotiddatabasen.Hvis du vil ha proteinsekvenser for spørringen, kjører du TransDecoder. Long0rfs-kommandoen for å identifisere de lengste åpne leserammene fra monterte spørringssekvenser. Kjør nå tblastn.Kontroller om nødvendig at riktig genetisk kode er valgt for organismen som studeres ved hjelp av db_gencode med passende kodealternativ. Hvis en proteinreferanse av høy kvalitet er tilgjengelig, bruk proteinproteinmatching med blastp i stedet for tblastn Lag en BLAST-database med proteinreferansen. Sørg for å lagre resultatet som en fil for nedstrøms behandling, og bruk tabellutdata for å sikre at Python-skriptene kan analysere dem riktig.Bruk nå det subtractive Python-skriptet til å fjerne eventuelle samsvarende sekvenser. Hvis du vil tilordne lesingene til samlingen, bruker du BWA-MEM versjon 0.7.12 eller bowtie 2 til å tilordne de nedlastede råleserne til spørringssamlingen. Først indekserer du samlingen, og deretter tilordner du lesingene.Utdataene vil være SAM-format. Kjør Python-skriptet removeUnmapped. py ved hjelp av SAM-filen som inndata.Dette identifiserer navnene på spørringssekvenser uten samsvarende lesinger og lagrer dem i en ny tekstfil. Utdataene fra det forrige trinnet er en liste over sekvensnavn i en txt-fil. Pakk ut en FASTA-fil med disse sekvensene.Utdataene vil være en fasta-fil. Bruk Genius til å bestemme optimale primersekvenser manuelt. Fremhev en kandidatsekvens på 21 til 28 basispar for den fremre primeren, unngå kjøringer av fire eller flere av en hvilken som helst base.Prøv å målrette mot en region med en ganske jevn kombinasjon av alle basispar. En enkelt G eller C på tre Prime End er gunstig, bidrar til å forankre primeren. Klikk på Statistikk-fanen til høyre på skjermen for å vise sekvensens estimerte smeltetemperatur når kandidatområdet er uthevet.Sikt på en smeltetemperatur mellom 55 og 60 grader Celsius, samtidig som du unngår gjentakelser, og lange løp av G C.Velg en omvendt primer på samme måte, som ligger 150 til 250 basepar tre primer. Mens primer lengder ikke trenger å matche, bør den forventede smeltetemperaturen være så nær som mulig til den fremre primeren. Pass på å reversere komplementer sekvensen ved å høyreklikke i Genius mens en sekvens er uthevet i et menyalternativ.En alternativ metode er å bruke Primer Design-funksjonen, som finnes på den øverste verktøylinjen i sekvensvinduet. Sett inn området for å forsterke under Målområde. Under egenskapsfanen setter du inn ønsket størrelse, smeltetemperatur og prosent G C, og deretter klikker du OK for å få primere generert.For å utføre kvantitativ PCR-validering av den gjenværende sekvensen, må du først lage en reaksjonsblanding for hver mal i triplikate, med vår SYBR Green Master Mix, fremover og omvendt primere og vann, for et totalt volum på 25 mikroliter. Kjør et qPCR-program informert av den tidligere validerte temperatur- og forlengelsestiden. Endelige denaturing kurver bør genereres minst første gang primers er ansatt i qPCR for å validere forsterkning av et enkelt DNA-produkt.Mål qPCR SYBR Grønne signaler i forhold til Actin av Ct For alle tilfeller beregner du gjennomsnittet og standardavviket på to til Ct i forhold til Actin. Utfør endepunkt gel elektroforese, for å bekrefte riktig produktstørrelse deteksjon av qPCR. Her kjører du 25 mikroliter av qPCR-produktet blandet med fem mikroliter 6X Glitterol-fargestoff på en 2% TAE Agarose gel ved 200 volt i 20 minutter.Hvis qPCR viser at du ikke har identifisert målsekvensene, gjentar du hele syklusen med en ny referanse, som kan hentes fra en elektronisk database. Det subtractive prosjektet i dette tilfellet startet med sekvensering av RNA fra bakterieforet vev av mannlig og kvinnelig voksen sebrafink. Til slutt ble 935 somatiske gener som ikke tidligere var inkludert i hele genommerknaden identifisert.Etter beregningsfiltrering kan kvantitativ PCR gi et negativt resultat der det ikke var noen forskjell i deteksjon på tvers av fuglevev. Omvendt bekreftes et positivt resultat som representerer identifisering av en sann målsekvens når genomisk DNA qPCR viser statistisk større deteksjon i vevet av interesse, i forhold til referansen. Her ble alfa snap genet validert til å være germline-begrenset fordi det ble utarmet i somatisk vev i forhold til testiklene DNA hvor det var til stede at nivåer tilsvarende Actin.Det er viktig å huske å bruke de riktige inngangene under hvert av beregningstrinnene. Du må kanskje gå gjennom syklusen subtraksjon flere ganger for å få målsekvensen eller sekvenser. En rekke fylogenetiske, strukturelle og funksjonelle analyser kan utføres på de oppdagede genene.Disse tilleggsmetodene gir innsikt i genenes evolusjonære og funksjonelle roller. Vi identifiserte det første genet på et germline-begrenset songbird kromosom, som utvidet interessen for dette overraskende genomiske elementet. Senere arbeid viste lignende kromosomer i mange sangfuglarter som inneholder mange ekstra gener.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transkripsjon Analyser og deres program i Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Novel RNA-bindende proteiner Isolering av den raske Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugerbare Mating Analyser for sekvens-spesifikk analyse av Transfer proteiner involvert i Konjugasjon

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse av den optimale Chromosomal plassering(er) gir et DNA i Escherichia coli bruker en ny Transposon-mediert tilnærming

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Høy fett diett fôring og høy gjennomstrømning Triacylglyceride analysen i Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sekvens-spesifikke og selektiv anerkjennelse av Double-strandet RNAs over Single-strandet RNAs av kjemisk endret peptid nukleinsyrer

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic analyse av sekvens Data fra satsvis gjær 2-Hybrid-skjermer

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering av mRNA fra hele Blood bruke Nanopore sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Navigering MARRVEL, en Web-basert verktøy som integrerer Human Genomics og modell organisme genetikk informasjon

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Utforske sekvens plass til å identifisere bindende områder for regulatoriske RNA-binding proteiner

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...