Name: novel sequence discovery by subtractive genomics
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00
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Os autores reconhecem Michelle Biederman, Alyssa Pedersen e Colin J. Saldanha por sua ajuda com o projeto de genômica zebra finch em várias fases. Também reconhecemos Evgeny Bisk para computação de administração do sistema de cluster e NIH grant 1K22CA184297 (para J.R.B.) e NIH NS 042767 (para C.J.S).

1. montar começando sequência de novo
Nota: Os dados de sequência de próxima geração (NGS) podem ser usados, enquanto um assembly pode ser produzido a partir desses dados. Dados de entrada apropriados incluem Illumina, PacBio, ou Nanopore de Oxford lê montado em um arquivo fasta. Para a concretude, esta seção descreve um assembly Illumina-baseado transcriptomic específicas para o estudo de zebra finch foram realizadas7; no entanto, esteja ciente de que ...

<ol>
	<li>Barh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Comparative+Genomics+Analysis+for+Common+Drug+and+Vaccine+Targets+in+Corynebacterium+pseudotuberculosis+and+other+CMN+Group+of+Human+Pathogens.">A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).</li><li>Sarangi, A. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis.">Pulsed-field gel electrophoresis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).</li></ol>

Enquanto subtrativa genómica é poderosa, não é uma abordagem do bolinho-cortador, que exigem personalização em diversas etapas-chave e a seleção cuidadosa de sequências de referência e amostras de teste. Se o assembly de consulta é de má qualidade, etapas de filtragem pode isolar apenas artefatos de montagem. Portanto, é importante validar completamente novo de assembly usando um protocolo de validação adequada para o projeto específico. Para RNA-seq, orientações são fornecidas sobre o Trinity...

A finalidade desse método é identificar uma alvo romance (T) sequência genômica, ou DNA ou RNA, de um contexto genômico, ou uma referência (R) (Figura 1). O método é mais útil se o destino não pode ser separado fisicamente, ou que seria caro para fazê-lo. Somente alguns organismos perfeitamente terminar de genomas para subtração, então uma inovação chave do nosso método é a combinação de computacionais e métodos de banco em um ciclo, possibilitando que os pesquisadores isolar sequências de destino quando a referência é imperfeita, ou um projecto genoma de um organismo não-modelo. No final de um ciclo, qPCR teste é usado para determinar se é necessário mais subtração. Uma sequência de candidato validado T mostrará a deteção estatisticamente maior em amostras de T-positivas conhecidas por qPCR.
Encarnações do método têm sido implementadas na descoberta de novos alvos de drogas bacteriana que não têm acolhimento homologs1,2,3,4 e identificação de novos vírus de hospedeiros infectados 5,6. Além da identificação de T, o método pode melhorar r: recentemente usamos o método para identificar 936 faltando genes do genoma de referência de zebra finch e um novo gene de um cromossomo apenas germline (T)7. Genómica subtrativa é particularmente valiosa quando T é provável ser extremamente divergentes de sequências conhecidas, ou quando a identidade de T é amplamente indefinida, como a zebra finch restrito germline cromossoma7.
Por não exigir uma identificação positiva de T previamente, a principal vantagem da genómica subtrativa é que é imparcial. Em um estudo recente, Readhead et al analisou a relação entre a doença de Alzheimer e abundância viral em quatro regiões do cérebro. Para identificação viral, Readhead et al criou um banco de dados de 515 vírus8, limitando severamente as agentes virais que seu estudo poderia identificar. Genómica subtrativa poderia ter sido usada para comparar o saudável e genomas de Alzheimer para isolar possíveis novos vírus associados com a doença, independentemente de sua semelhança com os agentes infecciosos conhecidos. Enquanto existem 263 vírus multiplataforma em humanos conhecidos, estima-se que existem aproximadamente 1,67 milhões por descobrir espécies virais, com 631.000-827.000 deles tendo um potencial de infectar seres humanos9.
Isolamento de vírus romance é uma área na qual subtrativa genómica é particularmente eficaz, mas alguns estudos podem não precisar de um método tão rigoroso. Por exemplo, estudos de identificação de novos vírus utilizaram imparcial sequenciamento do elevado-throughput seguido por transcrição reversa e BLASTx para sequências viral5 ou enriquecimento de viral de ácidos nucleicos para extrair e reverter transcrevem sequências virais 6. enquanto estes estudos empregado novo de sequenciamento e montagem, subtração não foi usada porque as sequências de destino foram positivamente identificadas através da explosão. Se o vírus estavam totalmente inédita e não relacionados (ou distantemente relacionados) para outros vírus, genômica subtrativa teria sido uma técnica útil. O benefício da genómica subtrativa é que sequências que são completamente novas podem ser obtidas. Se o genoma do organismo é conhecida, pode ser subtraída para fora para deixar qualquer sequências virais. Por exemplo, em nosso estudo publicado isolamos uma sequência viral romance de zebra finch através de genómica subtrativa, embora não fosse nossa intenção original7.
Genómica subtrativa também provou ser útil na identificação de alvos de vacina bacteriana, motivados pelo aumento dramático da resistência aos antibióticos,1,2,3,4. Para minimizar o risco de reação auto-imune, pesquisadores reduziu os possíveis alvos de vacina subtraindo quaisquer proteínas que têm homologs no hospedeiro humano. Um estudo particular, olhando pseudotuberculosis Corynebacterium, realizada a subtração de genomas de vertebrados anfitrião de vários genomas bacterianas para garantir que alvos possíveis drogas não afectaria as proteínas nos anfitriões levando a efeitos colaterais 1. o fluxo de trabalho básico desses estudos é baixar o proteome bacteriano, determinar as proteínas vitais, remover proteínas redundantes, use BLASTp para isolar as proteínas essenciais e BLASTp contra o anfitrião proteome para remover qualquer proteínas com homologs do anfitrião 1 , 2 , 3 , 4. neste caso, genómica subtrativa certifique-se de que as vacinas desenvolvidas não terá quaisquer efeitos fora do alvo no anfitrião1,2,3,4.
Costumávamos subtrativa genomics identificar o primeiro gene codificantes de proteínas restrito germline cromossomo (GRC) (no caso, T), que é encontrado em germlines mas não somático tecido de ambos os sexos10. Antes deste estudo, as informações genômicas só que era conhecidas sobre o GRC eram uma região repetitiva11. Montagem de novo foi a RNA sequenciado do ovário e teste os tecidos (R + T) de adultos zebra finches. A eliminação computacional de sequências foi realizada utilizando publicado somáticas (músculo) genoma sequência (R1)12, seu bruto (Sanger) ler dados (R2) e um de transcriptoma (R3) somática (cérebro)13. O uso sequencial de três referências foi guiado pelo qPCR teste na etapa 5 de cada ciclo (Figura 2A), mostrando que a filtragem adicional era necessária. O gene de α-SNAP a descoberta foi confirmado através de qPCR de DNA e RNA e clonagem e sequenciamento. Mostramos em nosso exemplo que este método seja flexível: não é dependente de correspondência de ácidos nucleicos (DNA versus RNA) e a subtração pode ser realizada com referências (R) que são compostas de módulos (assemblies) ou leituras crus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:499px;" width="498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accustart II Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:65px;">Quanta Bio</td>
			<td align="right" style="width:52px;">95141</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST)</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Bowtie 2</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://www.python.org/download/releases/2.7/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">BWA-MEM v. 0.7.12</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geneious</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">PEAR v. 0.9.6</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Personal Computer</td>
			<td style="width:65px;">Biomatters</td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.geneious.com/</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:215px;">PowerSYBR qPCR mix</td>
			<td style="width:65px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:52px;">4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Python v. 2.7</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Reptile v.1.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">Stratagene Mx3005P</td>
			<td style="width:65px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:52px;">401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TransDecoder v. 3.0.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Trinity v. 2.4.0</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel sequence discovery by subtractive genomics

Genómica subtrativa pode ser usada em qualquer pesquisa onde o objetivo é identificar a sequência de um gene, proteína ou região geral que está incorporado em um contexto maior genoma. Genómica subtrativa permite que um pesquisador isolar uma sequência do alvo do interesse (T) sequenciamento abrangente e subtraindo elementos genéticos conhecidos (referência, R). O método pode ser usado para identificar sequências de romance como mitocôndrias, cloroplastos, vírus, ou germline restrito de cromossomos e é particularmente útil quando T não pode ser facilmente isolado de R. começando com os dados completos de genômicos (R + T), o método usa base Local alinhamento pesquisa ferramenta (explosão) contra uma sequência de referência, ou sequências, para remover as sequências conhecidas correspondentes (R), deixando para trás o alvo (T). Para subtração funcionar melhor, R deve ser um projecto relativamente completo que está faltando T. Desde sequências restantes após subtração são testados através de quantitativos Polymerase Chain Reaction (qPCR), R não precisa ser completa para o método de trabalho. Aqui temos link passos computacionais com etapas experimentais em um ciclo que pode ser iterado conforme necessário, sequencialmente, removendo várias sequências de referência e refinar a busca por T. A vantagem da genómica subtrativa é que uma sequência totalmente inédita do alvo pode ser identificada mesmo nos casos em que a purificação física é caro, difícil ou impossível. Uma desvantagem do método é encontrar uma referência adequada para subtração e obtenção de T-positivo e negativo de amostras para testes de qPCR. Descrevemos nossa implementação do método na identificação do primeiro gene cromossomo germline restrito de zebra finch. Nesse caso a filtragem computacional envolveu três referências (R), removidas sequencialmente em três ciclos: um assembly genômica incompleto, dados brutos de genômicos e transcriptomic dados.

Após a explosão de execução, o arquivo de saída terá uma lista de sequências de consulta que correspondem ao banco de dados. Após a subtração de Python, um número de sequências não correspondentes será obtido e testado por qPCR. Os resultados do presente e próximos passos, são discutidos abaixo.
Resultado negativo. Há dois possíveis resultados negativos que podem ser vistos depois da explosão ...

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Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Sequência de romance descoberta pela genômica subtrativa

O propósito do presente protocolo é usar uma combinação de computacional e pesquisa do banco para encontrar romance sequências que não podem ser separadas facilmente uma sequência co purificante, que pode ser apenas parcialmente conhecida.

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Nosso protocolo é significativo porque pode ser usado para identificar sequências genômicas que não podem ser isoladas de sequências de co-purificação, que podem ser apenas parcialmente conhecidas. As principais vantagens dessa técnica é que ela é barata, usando principalmente software livre que pode ser baixado, bem como flexível. Você pode aplicá-lo a muitas questões biológicas.As aplicações potenciais incluem identificar alvos de vacinas bacterianas e identificar vírus cujas sequências são extremamente diferentes dos micróbios conhecidos. Este método pode ser aplicado a qualquer sistema no qual o desconhecido não possa ser separado experimentalmente, desde que a sequência de referência sem o alvo genômico esteja disponível. Esta técnica requer alguma tentativa e erro, por isso a paciência é importante.Você pode precisar de problemas para filmar os programas. Você pode usar programas diferentes dos que descrevemos aqui. Use os manuais do usuário o máximo possível.A demonstração visual deste método é útil porque o trabalho computacional depende de uma compreensão básica de como a programação da linha de comando é estruturada. Para começar, use Trimmomatic 0.32 para remover adaptadores de illumina e bases de baixa qualidade. Use a versão Pear 0.9.11 para criar leituras mescladas de alta qualidade a partir de leituras emparelhadas de saída trimmomática usando parâmetros padrão.Em seguida, use a versão 1.1 do Réptil para corrigir as leituras produzidas através da Pera. Por fim, use a versão 2.4.0 do Trinity no modo padrão para montar as sequências corrigidas. Para bibliotecas específicas de fios, use o parâmetro SS_lib_type.A saída é um arquivo FASTA que será colocado em um novo diretório chamado trinity_output. Faça um banco de dados BLAST da sequência de referência nucleotide_reference. fasta na linha de comando.O BLAST correspondeu à consulta montada ao banco de dados de referência. Para obter um arquivo de saída, use BLAST_results. txt Para gerar saída tabular necessária para etapas de processamento de subsequence com scripts Python, use outfmt 6 Para aumentar a stringency, use sequências proteicas do conjunto como a consulta BLAST com blast nucleotídeo traduzido, que realiza a tradução de seis vias do banco de dados nucleotídeo.Para obter sequências proteicas para a consulta, execute o TransDecoder. Comando Long0rfs para identificar os quadros de leitura abertos mais longos de sequências de consulta montadas. Agora corra tblastn.Se necessário, certifique-se de que o código genético correto seja selecionado para o organismo que está sendo estudado usando o db_gencode com opção de código apropriada. Se houver uma referência proteica de alta qualidade disponível, use proteína-proteína correspondente com blastp em vez de tblastn Faça um banco de dados BLAST da referência à proteína. Certifique-se de salvar o resultado como um arquivo para processamento a jusante e use a saída tabular para garantir que os scripts Python possam analisá-los corretamente.Agora, use o script Python subtrativo para remover quaisquer sequências correspondentes. Para mapear as leituras no conjunto, use bwa-MEM Versão 0.7.12 ou bowtie 2 para mapear as leituras brutas baixadas no conjunto de consulta. Primeiro, indexe a montagem, depois mapeie as leituras.A saída será o formato SAM. Execute o script Python removendoInmapped. py usando o arquivo SAM como entrada.Isso identifica os nomes das sequências de consulta sem leituras correspondentes e as salva em um novo arquivo de texto. A saída da etapa anterior é uma lista de nomes de sequências em um arquivo txt. Extrair um arquivo FASTA com essas sequências.A saída será um arquivo fasta. Use genius para determinar sequências de primer ideais manualmente. Destaque uma sequência de candidatos de 21 a 28 pares de base para o primer dianteiro, evitando corridas de quatro ou mais de qualquer base.Tente atingir uma região com uma combinação bastante uniforme de todos os pares de base. Um único G ou C em três Prime End é benéfico, ajudando a ancorar o primer. Clique na guia Estatísticas no lado direito da tela para ver a temperatura estimada de fusão dessa sequência à medida que a região do candidato é destacada.Aponte para uma temperatura de fusão entre 55 e 60 graus Celsius, evitando repetições, e longas corridas de G C.Escolha uma cartilha reversa da mesma maneira, situada de 150 a 250 pares de base três prime da cartilha dianteira. Embora os comprimentos do primer não precisem coincidir, a temperatura de fusão prevista deve ser o mais próxima possível da do primer dianteiro. Certifique-se de reverter o complemento da sequência clicando com o botão direito do mouse em Genius enquanto uma sequência é destacada em uma opção de menu.Um método alternativo é usar a função Primer Design, que é encontrada na barra de ferramentas superior na janela Sequência. Insira a região para amplificar sob a Região Alvo. Sob a guia características, insira o tamanho desejado, a temperatura de fusão e por cento G C, em seguida, clique em OK para ter primers gerados.Para realizar a validação quantitativa do PCR da sequência restante, primeiro prepare uma mistura de reação para cada modelo em triplicado, com nosso SYBR Green Master Mix, primers avançados e reversos, e água, para um volume total de 25 microlitros. Execute um programa qPCR informado pelo tempo de temperatura e extensão previamente validado. As curvas finais de desnaturação devem ser geradas pelo menos na primeira vez que os primers são empregados em qPCR para validar a amplificação de um único produto de DNA.Meça os sinais qPCR SYBR Green relativos ao Actin por Ct Para todos os casos, calcule a média e o desvio padrão de dois para o TC relativo ao Actin. Realize a eletroforese de gel de ponto final, para confirmar a detecção correta do tamanho do produto por qPCR. Aqui, execute 25 microlitres do produto qPCR misturado com cinco microlitres de corante Glitterol 6X em um gel de 2%TAE Agarose a 200 volts por 20 minutos.Se o seu qPCR mostrar que você não identificou as sequências de destino, repita todo o ciclo com uma nova referência, que pode ser obtida a partir de um banco de dados on-line. O projeto subtrativo, neste caso, começou com o sequenciamento do RNA a partir de tecido forrado de germes de tentilhões de zebra adultos machos e fêmeas. Em última análise, foram identificados 935 genes somatics que não foram incluídos anteriormente em toda a anotação do genoma.Após a filtragem computacional, o PCR quantitativo pode produzir um resultado negativo no qual não houve diferença na detecção entre os tecidos das aves. Por outro lado, um resultado positivo representando a identificação de uma Sequência de Alvos Verdadeira é confirmado quando o DNA genômico qPCR mostra detecção estatisticamente maior no tecido de interesse, em relação à referência. Aqui, o gene alfa snap foi validado para ser restringido por ser esgotado em tecido somático em relação ao DNA de testes onde estava presente que os níveis equivalentes a Actin.É importante lembrar de usar as entradas corretas durante cada uma das etapas computacionais. Você pode ter que passar pela subtração do ciclo várias vezes para obter a sequência de destino ou sequências. Uma variedade de análises filogenéticas, estruturais e funcionais pode ser realizada nos genes descobertos.Esses métodos adicionais fornecem uma visão dos papéis evolutivos e funcionais dos genes. Identificamos o primeiro gene em um cromossomo de pássaro-canção restrito a germina, o que ampliou o interesse neste elemento genômico surpreendente. Trabalhos subsequentes mostraram cromossomos semelhantes em muitas espécies de pássaros-canção contendo muitos genes adicionais.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

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Transcrição in vitro Ensaios e sua aplicação em Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Genética

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

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Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

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Dieta de alta gordura alimentar e ensaio de triacilglicerol alto Throughput em Drosophila Melanogaster.

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Reconhecimento de sequência específica e seletivo de RNAs Double-stranded sobre Single-stranded RNA por modificados quimicamente ácidos nucleicos de peptídeo

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Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

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Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequenciamento de mRNA de sangue total usando sequenciamento de nanoporos

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Navegando no MARRVEL, uma ferramenta Web que integra informações da genômica humana e genética de organismos modelo

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Explorando o espaço de seqüência para identificar sites de vinculação para proteínas reguladoras de ligação de RNA

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...