Name: novel sequence discovery by subtractive genomics
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

Авторы признают Мишель Бидерман, Alyssa Педерсен и Колин J. Saldanha, за их помощь в проекте геномики зебры Финч на различных этапах. Мы также признаем Евгений Bisk для вычисления Системное администрирование кластера и низ Грант 1K22CA184297 (для J.R.B.) и низ NS 042767 (для C.J.S).

1. de novo собрать начиная последовательности
Примечание: Любые данные следующего поколения последовательности (НГС) может использоваться, как сборки могут быть изготовлены из этих данных. Подходящие входные данные включают Illumina, PacBio, или Оксфорд Нанопор читает собранн?...

<ol>
	<li>Barh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Comparative+Genomics+Analysis+for+Common+Drug+and+Vaccine+Targets+in+Corynebacterium+pseudotuberculosis+and+other+CMN+Group+of+Human+Pathogens.">A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).</li><li>Sarangi, A. N., Aggarwal, R., Rahman, Q., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtractive+Genomics+Approach+for+in+Silico+Identification+and+Characterization+of+Novel+Drug+Targets+in+Neisseria+Meningitides+Serogroup+B.">Subtractive Genomics Approach for in Silico Identification and Characterization of Novel Drug Targets in Neisseria Meningitides Serogroup B.</a> Journal of Computer Science &amp; Systems Biology. 2 (5), (2009).</li><li>Kaur, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Druggable+Targets+for+Acinetobacter+baumannii+Via+Subtractive+Genomics+and+Plausible+Inhibitors+for+MurA+and+MurB.">Identification of Druggable Targets for Acinetobacter baumannii Via Subtractive Genomics and Plausible Inhibitors for MurA and MurB.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 171 (2), 417-436 (2013).</li><li>Rathi, B., Sarangi, A. N., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+subtraction+for+novel+target+definition+in+Salmonella+typhi.">Genome subtraction for novel target definition in Salmonella typhi.</a> Bioinformation. 4 (4), 143-150 (2009).</li><li>Epstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+GBV-D,+a+Novel+GB-like+Flavivirus+from+Old+World+Frugivorous+Bats+(Pteropus+giganteus)+in+Bangladesh.">Identification of GBV-D, a Novel GB-like Flavivirus from Old World Frugivorous Bats (Pteropus giganteus) in Bangladesh.</a> PLoS Pathogens. 6 (7), (2010).</li><li>Kapoor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Rodent+Homologs+of+Hepatitis+C+Virus+and+Pegiviruses.">Identification of Rodent Homologs of Hepatitis C Virus and Pegiviruses.</a> MBio. 4 (2), (2013).</li><li>Biederman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+First+Germline-Restricted+Gene+by+Subtractive+Transcriptomic+Analysis+in+the+Zebra+Finch,+Taeniopygia+guttata.">Discovery of the First Germline-Restricted Gene by Subtractive Transcriptomic Analysis in the Zebra Finch, Taeniopygia guttata.</a> Current Biology. 28 (10), 1620-1627 (2018).</li><li>Readhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Analysis+of+Independent+Alzheimer's+Cohorts+Finds+Disruption+of+Molecular,+Genetic,+and+Clinical+Networks+by+Human+Herpesvirus.">Multiscale Analysis of Independent Alzheimer's Cohorts Finds Disruption of Molecular, Genetic, and Clinical Networks by Human Herpesvirus.</a> Neuron. 99, 1-19 (2018).</li><li>Carroll, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+virome+project.">The global virome project.</a> Science. 359 (6378), 872-874 (2016).</li><li>Pigozzi, M. I., Solari, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+restriction+and+regular+transmission+of+an+accessory+chromosome+that+mimics+a+sex+body+in+the+zebra+finch.+Taeniopygia+guttata.">Germ cell restriction and regular transmission of an accessory chromosome that mimics a sex body in the zebra finch. Taeniopygia guttata.</a> Chromosome Research. 6, 105-113 (1998).</li><li>Itoh, Y., Kampf, K., Pigozzi, M. I., Arnold, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+characterization+of+the+germline-restricted+chromosome+sequence+in+the+zebra+finch.">Molecular cloning and characterization of the germline-restricted chromosome sequence in the zebra finch.</a> Chromosoma. 118, 527-536 (2009).</li><li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+a+songbird.">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li><li>Balakrishnan, C. N., Lin, Y. C., London, S. E., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+transcriptome+analysis+of+male+and+female+zebra+finch+cell+lines.">RNAseq transcriptome analysis of male and female zebra finch cell lines.</a> Genomics. 100, 363-369 (2012).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAR:+a+fast+and+accurate+Illumina+Paired-End+reAd+mergeR.">PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR.</a> Bioinformatics. 30, 614-620 (2014).</li><li>Yang, X., Dorman, K. S., Aluru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reptile:+representative+tiling+for+short+read+error+correction.">Reptile: representative tiling for short read error correction.</a> Bioinformatics. 26, 2526-2533 (2010).</li><li>MacManes, M. D., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+transcriptome+assembly+through+error+correction+of+high-throughput+sequence+reads.">Improving transcriptome assembly through error correction of high-throughput sequence reads.</a> PeerJ. 1 (113), (2013).</li><li>Grabherr, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+transcriptome+assembly+from+RNA-seq+data+without+a+reference+genome.">Full-length transcriptome assembly from RNA-seq data without a reference genome.</a> Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).</li><li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+sequence+reads,+clone+sequences+and+assembly+contigs+with+BWA-MEM.">Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM.</a> arXiv. , (2013).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357-359 (2012).</li><li>Kearse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geneious+Basic:+an+integrated+and+extendable+desktop+software+platform+for+the+organization+and+analysis+of+sequence+data.">Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data.</a> Bioinformatics. 28 (12), 1647-1649 (2012).</li><li>Peirson, S. N., Butler, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+polymerase+chain+reaction.">Quantitative polymerase chain reaction.</a> Methods in Molecular Biology. 362, 349-362 (2007).</li><li>Hunt, M., Kikuchi, T., Sanders, M., Newbold, C., Berriman, M., Otto, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAPR+citation:+REAPR:+a+universal+tool+for+genome+assembly+evaluation.">REAPR citation: REAPR: a universal tool for genome assembly evaluation.</a> Genome Biology. 14 (5), (2013).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mitochondrial+genome+sequence+of+a+hominin+from+Sima+de+los+Huesos.">A mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos.</a> Nature. 505 (7483), 403-406 (2013).</li><li>Gunnarsd&#243;ttir, E. D., Li, M., Bauchet, M., Finstermeier, K., Stoneking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+complete+human+mtDNA+genomes+from+the+Philippines.">High-throughput sequencing of complete human mtDNA genomes from the Philippines.</a> Genome Research. 21 (1), 1-11 (2010).</li><li>King, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+and+high-throughput+massively+parallel+sequencing+of+the+human+mitochondrial+genome+using+the+Illumina+MiSeq.">High-quality and high-throughput massively parallel sequencing of the human mitochondrial genome using the Illumina MiSeq.</a> Forensic Science International: Genetics. 12, 128-135 (2014).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+in+Actinidiaceae:+Genome+Structure+and+Comparative+Analysis.">The First Complete Chloroplast Genome Sequences in Actinidiaceae: Genome Structure and Comparative Analysis.</a> Plos One. 10 (6), (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+of+Five+Epimedium+Species:+Lights+into+Phylogenetic+and+Taxonomic+Analyses.">The Complete Chloroplast Genome Sequences of Five Epimedium Species: Lights into Phylogenetic and Taxonomic Analyses.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oxytricha+trifallax+Mitochondrial+Genome.">The Oxytricha trifallax Mitochondrial Genome.</a> Genome Biologyogy and Evolution. 4 (2), 136-154 (2011).</li><li>Barth, D., Berendonk, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome+sequence+of+the+ciliate+Paramecium+caudatum+reveals+a+shift+in+nucleotide+composition+and+codon+usage+within+the+genus+Paramecium.">The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium.</a> BMC Genomics. 12 (1), (2011).</li><li>Coombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Complete+Sitka+Spruce+Chloroplast+Genome+Using+10X+Genomics'+GemCode+Sequencing+Data.">Assembly of the Complete Sitka Spruce Chloroplast Genome Using 10X Genomics' GemCode Sequencing Data.</a> Plos One. 11 (9), (2016).</li><li>Herschleb, J., Ananiev, G., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis.">Pulsed-field gel electrophoresis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).</li></ol>

Хотя субтрактивный геномики является мощным, это не печенье резец подход, требующий настройки на нескольких ключевых шагов и тщательный отбор ссылка последовательности и испытательных образцов. Если запрос Ассамблея имеет низкое качество, фильтрация шаги только изолировать Ассамбле...

Этот метод предназначен для выявления роман целевой (T) геномной последовательности, ДНК или РНК, от геномной контекста, или ссылку (R) (рис. 1). Этот метод наиболее полезен, если цель не может быть разделены физически, или это будет дорого делать это. Только в нескольких организмов прекрасно закончили геномов для вычитания, поэтому ключевых инноваций нашего метода является сочетание вычислительных и методы скамейке в цикл позволяет исследователям изолировать последовательности, когда ссылка является несовершенным, или проект геном-модель организма. В конце цикла ПЦР тестирование используется для определения того, требуются ли дополнительные вычитание. Проверенных кандидатов T последовательности покажет статистически более обнаружения в известных T-позитивных образцов, ПЦР.
Воплощений метода были реализованы в открытие новых целей бактериального препарата, которые не имеют хост гомолог1,2,3,4 и идентификации новых вирусов из зараженных узлов 5,6. Помимо идентификации T метод может улучшить R: мы недавно использовали метод для идентификации 936 отсутствует генов генома ссылка зебры Финч и новый ген хромосомы (T) микрофлорой только7. Субтрактивный геномики особенно ценно, когда T-видимому, очень отличается от известных последовательностей, или когда личность T не определен широко, как зебры Финч ограничено микрофлорой хромосома7.
Не требуя позитивное определение T заранее, основным преимуществом субтрактивный геномики, что это беспристрастной. В недавнем исследовании Readhead et al. рассмотрел взаимосвязь между вирусной изобилия в четырех регионах мозга и болезни Альцгеймера. Для вирусный идентификации Readhead et al. создал базу данных 515 вирусов8, серьезно ограничивая вирусных агентов, которые могут определить их исследование. Субтрактивный геномики можно было используется для сравнения здоровых и Альцгеймера геномов для того, чтобы изолировать возможные Роман вирусы, связанные с болезнью, независимо от их сходство с известных инфекционных агентов. Хотя есть 263 известных вирусов, ориентация человека, было подсчитано, что примерно 1,67 млн неоткрытых вирусный видов существуют, с 631,000-827,000 из них имеют потенциал, чтобы заразить людей9.
Изоляция Роман вирусы — это область, в которой субтрактивный геномики является особенно эффективным, но некоторые исследования может не такой строгий метод. Например исследования, выявления роман вирусы использовали беспристрастной высок объём последовательности следуют обратной транскрипции и BLASTx для вирусных последовательности5 или обогащения вирусных нуклеиновых кислот для извлечения и обратить вспять транскрибировать вирусный последовательности 6. Хотя эти исследования использовали секвенирование de novo и Ассамблеи, вычитания не использовалось, потому что последовательности были идентифицированы путем взрыва. Если вирусы были полностью Роман и не связанные с (или отдаленно связанные) для других вирусов, субтрактивный геномики была бы полезной техникой. Преимуществом субтрактивный геномики является, что последовательности, которые являются совершенно новыми могут быть получены. Если известен геном организма, он может быть вычтен из оставить любой вирусный последовательности. Например в нашем опубликованном исследовании мы изолированы Роман вирусный последовательность от зебры Финч посредством субтрактивного геномики, хотя он был не наш оригинальный намерения7.
Субтрактивный геномики также оказался полезным в определении целей бактериальные вакцины, мотивированные резкий рост антибиотикорезистентности1,2,3,4. Чтобы свести к минимуму риск аутоиммунные реакции, исследователи сузили потенциальных целей вакцины, вычитая любые белки, которые имеют гомолог в человека-хозяина. Одно исследование, глядя на Corynebacterium pseudotuberculosis, выполняется вычитание позвоночных хост геномов из нескольких бактериальных геномов обеспечить, что возможно наркотиков цели не будет затрагивать белков в узлы, ведущие к побочные эффекты 1. основной рабочий поток этих исследований является скачать бактериальных протеом, определить жизненно важных белков, удаления избыточных белков, использовать BLASTp для изоляции эфироносных протеинов и BLASTp против принимающей протеома удалить любые белки с принимающей гомолог 1 , 2 , 3 , 4. В этом случае субтрактивный геномики убедиться, что вакцин разработал не будет иметь каких-либо эффектов пробить в узел1,2,3,4.
Мы использовали субтрактивный геномика для идентификации первого белка кодирование гена ограничено микрофлорой хромосоме (GRC) (в данном случае, T), который находится в germlines, но не соматических ткани обоих полов10. До этого исследования только геномной информации, что было известно о GRC был повторяющихся региона11. De novo Ассамблея была исполнена на РНК последовательности из яичника и Тэст тканей (R + T) от взрослых Зебра зябликов. Вычислительных ликвидации последовательностей была выполнена с использованием опубликованных соматические (мышцы) геном последовательности (Р1)12, ее сырье (Сэнгер) чтения данных (R2) и соматические (мозга) транскриптом (R3)13. Последовательное использование трех ссылок был обусловлен ПЦР, тестирование на шаге 5 каждого цикла (рисA), показаны, что требуется дополнительная фильтрация. Обнаружили ген α-SNAP было подтверждено путем ПЦР ДНК и РНК и клонирование и секвенирование. Мы покажем в нашем примере, что этот метод является гибким: это не зависит от соответствия нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), и что вычитание могут быть выполнены с ссылками (R), которые состоят из сборки или сырые читает.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:499px;" width="498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accustart II Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:65px;">Quanta Bio</td>
			<td align="right" style="width:52px;">95141</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST)</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Bowtie 2</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://www.python.org/download/releases/2.7/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">BWA-MEM v. 0.7.12</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geneious</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">PEAR v. 0.9.6</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Personal Computer</td>
			<td style="width:65px;">Biomatters</td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.geneious.com/</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:215px;">PowerSYBR qPCR mix</td>
			<td style="width:65px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:52px;">4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Python v. 2.7</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Reptile v.1.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">Stratagene Mx3005P</td>
			<td style="width:65px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:52px;">401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TransDecoder v. 3.0.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Trinity v. 2.4.0</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel sequence discovery by subtractive genomics

Субтрактивный геномики может использоваться в любых исследований, где цель заключается в том, чтобы определить последовательность генов, белка, или общего региона, который встроен в более широком контексте геномной. Субтрактивный геномики позволяет исследователю изолировать последовательности целевых объектов, представляющих интерес (T), всеобъемлющей последовательности и вычитая из известных генетических элементов (ссылка, R). Этот метод может использоваться для выявления роман последовательности, например митохондрий, хлоропласты, вирусы, или микрофлорой ограничено хромосом и особенно полезен, когда T не может быть легко изолированы от р., начиная с всеобъемлющей геномных данных (R + T), метод использует основной инструмент поиска местных выравнивание (взрыв) против ссылка последовательности или последовательности, чтобы удалить сопоставления известных последовательностей (R), оставив позади цели (T). Для вычитания работать лучше R должно быть относительно полный проект, который отсутствует т. Начиная с последовательностями, оставшиеся после вычитания проверяются через количественные полимеразной цепной реакции (ПЦР) R не нужно быть полным для работы метода. Здесь мы связываем вычислительных шагов с экспериментальной шаги в цикл, который может быть итерация по мере необходимости, последовательно удаление нескольких ссылка последовательности и уточнения поиска для T. Преимуществом субтрактивный геномики является, что полностью Роман последовательности могут быть определены даже в тех случаях, в которых физической очистки является трудным, невозможно или дорого. Недостатком метода найти подходящую ссылку для вычитания и получение T-положительные и отрицательные образцов для испытаний ПЦР. Мы описываем нашу реализацию метода в определении первый ген от ограничено микрофлорой хромосома зебры Финч. В этом случае вычислительная фильтрации участвуют три ссылки (R), последовательно удалены более трех циклов: неполная геномной Ассамблеи, сырые геномных данных и транскриптомики данных.

После запуска BLAST, выходной файл будет иметь список последовательностей из запроса, которые соответствуют базе данных. После вычитания Python количество несовпадающих последовательностей будет получен и проверены ПЦР. Результаты этого и последующие шаги, обсуждаются н?...

Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Роман последовательности открытия субтрактивный геномика

Целью настоящего Протокола является использование комбинации вычислительной и коллегия исследовательской найти Роман последовательностей, которые нельзя легко отделяться от совместно очищения последовательность, которая может быть лишь частично известна.

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Наш протокол имеет важное значение, поскольку он может быть использован для определения геномных последовательностей, которые не могут быть изолированы от соочищающих последовательностей, которые сами по себе могут быть известны лишь частично. Основными преимуществами этой техники является то, что она недорогая, используя в основном свободные программы, которые могут быть загружены, а также гибкие. Вы можете применить его ко многим биологическим вопросам.Потенциальные применения включают выявление целей бактериальной вакцины и выявление вирусов, последовательности которых чрезвычайно отличаются от известных микробов. Этот метод может быть применен к любой системе, в которой неизвестное не может быть экспериментально разделено, до тех пор, пока доступна эталонная последовательность без геномной цели. Этот метод требует некоторых проб и ошибок, поэтому терпение имеет важное значение.Возможно, вам придется беспокоить стрелять программ. Вы можете использовать программы, отличается от тех, которые мы описываем здесь. Используйте руководства пользователя как можно больше.Визуальная демонстрация этого метода полезна, поскольку вычислительная работа зависит от базового понимания структуры программирования командной строки. Для начала используйте Trimmomatic 0.32 для удаления адаптеров illumina и низкого качества оснований. Используйте грушевую версию 0.9.11 для создания высококачественных объединенных считывает из тримоматических выходных парных считых с помощью параметров по умолчанию.Затем используйте рептилий версия 1.1, чтобы исправить ошибку читает производится через грушу. Наконец, используйте версию 2.4.0 Trinity в режиме по умолчанию для сборки исправленных последовательностей. Для конкретных библиотек для нитей используйте SS_lib_type параметры.Выходом является файл FASTA, который будет помещен в новый каталог под названием trinity_output. Сделайте базу данных BLAST эталонной последовательности nucleotide_reference. поста на командной линии.BLAST соответствует запросу, собранного в справочную базу данных. Чтобы получить выходной файл, используйте BLAST_results. txt Для генерации табликулярного вывода, необходимого для подсекции этапов обработки скриптов Python, используйте outfmt 6 Для увеличения строки, используйте белковые последовательности из сборки в качестве запроса BLAST с переведенным нуклеотидом BLAST, который выполняет шестигорный перевод нуклеотидной базы данных.Чтобы получить белковые последовательности для запроса, запустите TransDecoder. Команда Long0rfs определяет самые длинные открытые кадры чтения из собранных последовательностей запросов. Теперь запустите tblastn.При необходимости убедитесь, что правильный генетический код выбран для изучаемого организма с помощью db_gencode с соответствующим вариантом кода. Если высокое качество белка ссылка доступна, используйте белок-белок соответствия с бласп, а не tblastn Сделать BLAST базы данных белка ссылки. Убедитесь в том, чтобы сохранить результат в качестве файла для обработки вниз по течению, и использовать таблейный выход для обеспечения Python скрипты могут разобрать их правильно.Теперь используйте скрипт вычитания Python, чтобы удалить все соответствующие последовательности. Чтобы сопоставить считываемые на сборку, используйте BWA-MEM Версию 0.7.12 или bowtie 2 для карты загруженных необработанных считываемых на сборку запросов. Сначала индексировать сборку, а затем картировать чтения.Выход будет форматом SAM. Вы запустите скрипт Python removeUnmapped. py с использованием файла SAM в качестве ввода.Это определяет имена последовательностей запросов без соответствующих считывай и сохраняет их в новом текстовом файле. Выходом предыдущего шага является список имен последовательностей в файле txt. Извлекайте файл FASTA с помощью этих последовательностей.Выход будет файлом fasta. Используйте Genius для определения оптимальных последовательностей грунтовки вручную. Выделите последовательность кандидатов от 21 до 28 базовых пар для форварда грунтовка, избегая пробегов из четырех или более любой базы.Попробуйте нацелиться на регион с достаточно равномерной комбинацией всех базовых пар. Один G или C в трех Prime End является полезным, помогая якорь грунтовка. Нажмите на вкладку Статистика на правой стороне экрана, чтобы просмотреть предполагаемую температуру плавления этой последовательности по мере выделения региона-кандидата.Цель для плавления температуры между 55 и 60 градусов по Цельсию, избегая при этом повторов, и длинные пробеги G C.Выберите обратный грунтовка таким же образом, расположенный от 150 до 250 базовых пар три премьер вперед грунтовки. В то время как длины грунтовки не должны соответствовать, прогнозируемая температура плавления должна быть как можно ближе к температуре вперед грунтовки. Не забудьте обратить вспять дополнение последовательности правого нажатия в Genius в то время как последовательность выделена в варианте меню.Альтернативным методом является использование функции Primer Design, которая находится в верхней панели инструментов в окне последовательности. Вставьте область для усиления в рамках Целевого региона. В соответствии с вкладкой характеристики, вставьте желаемый размер, температуру плавления, и процент G C, а затем нажмите OK, чтобы иметь грунтовки генерируется.Для выполнения количественной проверки ПЦР оставшейся последовательности, сначала подготовьте смесь реакции для каждого шаблона в тройном, с нашим SYBR Green Master Mix, вперед и обратной грунтовки, и воды, для общего объема 25 микролитров. Запустите программу qPCR, проинформированную о ранее проверенном времени температуры и продления. Окончательные кривые денатурации должны быть созданы по крайней мере в первый раз праймеры используются в qPCR для проверки усиления одного продукта ДНК.Измерьте qPCR SYBR Зеленые сигналы по отношению к Actin Ct Для всех случаев, рассчитать среднее, и стандартное отклонение от двух Ct по отношению к Actin. Выполните электрофорез геля конечной точки, чтобы подтвердить правильное обнаружение размера продукта с помощью qPCR. Здесь, запустить 25 микролитров продукта qPCR смешивается с пятью микролитров 6X Glitterol красителя на 2%TAE агарозный гель на 200 вольт в течение 20 минут.Если ваш qPCR показывает, что вы не определили целевые последовательности, повторите весь цикл с новой ссылкой, которая может быть получена из онлайн-базы данных. Вычитательный проект в данном случае начался с секвенирования РНК из зародышевой ткани самца и самки взрослого зяблика зебры. В конечном счете, было выявлено 935 соматических генов, которые ранее не были включены во всю аннотацию генома.После вычислительной фильтрации количественный ПЦР может дать отрицательный результат, при котором не было никакой разницы в обнаружении тканей птиц. И наоборот, положительный результат, представляющий идентификацию True Target Sequence, подтверждается, когда геномная ДНК qPCR показывает статистически большее обнаружение в ткани, представляющей интерес, по отношению к ссылке. Здесь ген альфа-оснастки был проверен на зародышевой ограничен, потому что он был истощен в соматической ткани по отношению к тестируемой ДНК, где он присутствовал, что уровни, эквивалентные Actin.Важно помнить, чтобы использовать правильные входы во время каждого из вычислительных шагов. Возможно, вам придется пройти через цикл вычитания несколько раз для того, чтобы получить целевую последовательность или последовательности. Разнообразие филогенетического, структурного и функционального анализа может быть выполнено на обнаруженных генах.Эти дополнительные методы дают представление об эволюционной и функциональной роли генов. Мы определили первый ген на хромосоме, ограниченной зародышами, которая расширила интерес к этому удивительному геномного элемента. Последующая работа показала аналогичные хромосомы во многих видах певчих птиц, содержащих много дополнительных генов.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Транскрипция Анализы и их применение в Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Novel Выделение РНК-связывающих белков Стремительное Методология

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Конъюгативных Спаривание Анализы для последовательности конкретного анализа переноса белков, участвующих в конъюгации бактерий

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Определение оптимального расположения хромосомных ДНК элемента в Escherichia coli с помощью Роман Transposon опосредованный подход

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Высоким содержанием жиров питание и высокая пропускная способность Triacylglyceride Assay в Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Последовательность конкретных и избирательное признание двуцепочечной РНК над одноцепочечной РНК, химически изменены пептид нуклеиновых кислот

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Информатики анализ последовательности данных из пакетного дрожжи 2-гибрид экраны

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Секвенирование мРНК из цельной крови с использованием секвенирования Наноруды

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Навигация MARRVEL, веб-инструмент, который интегрирует геномику человека и модель генетики организма информации

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Изучение пространства последовательности для определения связывающих сайтов для регулятивных РНК-связывающих белков

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...