Name: novel sequence discovery by subtractive genomics
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00
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Los autores reconocen Michelle Biederman, Alyssa Pedersen y Colin J. Saldanha por su ayuda con el proyecto de genómica del pinzón cebra en diversas etapas. También reconocemos Evgeny Biisk informática administración de sistemas de cluster y NIH grant 1K22CA184297 (a J.R.B.) y NIH NS 042767 (a C.J.S).

1. de novo montar a partir de secuencia
Nota: Los datos de la secuencia de la próxima generación (NGS) pueden utilizarse, como un conjunto puede obtenerse de esos datos. Datos de entrada adecuados incluyen Illumina, PacBio, o Oxford Nanopore Lee montado en un archivo fasta. De concreción, esta sección describe un conjunto transcriptómicos Illumina-base específica para el estudio de Pinzón cebra realizamos7; sin embargo ten en cuenta que los detalles variar...

<ol>
	<li>Barh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Comparative+Genomics+Analysis+for+Common+Drug+and+Vaccine+Targets+in+Corynebacterium+pseudotuberculosis+and+other+CMN+Group+of+Human+Pathogens.">A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).</li><li>Sarangi, A. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis.">Pulsed-field gel electrophoresis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).</li></ol>

Aunque genómica sustractivo es potente, no es un enfoque de cortador de la galleta, que requieren personalización en varios pasos y una cuidadosa selección de secuencias de referencia y las muestras de prueba. Si la Asamblea de consulta es de mala calidad, filtrado de pasos podría aislar sólo artefactos de Asamblea. Por lo tanto, es importante validar completamente el conjunto de novo utilizando un protocolo de validación adecuado para el proyecto específico. Para RNA-seq, directrices se proporcionan en e...

El propósito de este método es identificar un nuevo destino (T) secuencia genomic, ya sea ADN o ARN, de un contexto genómico o de referencia (R) (figura 1). El método es más útil si el objetivo no se puede separar físicamente, o que sería costoso hacerlo. Solamente unos pocos organismos han terminado perfectamente genomas para sustracción, una innovación clave de nuestro método es la combinación de computacional y métodos del Banco en un ciclo, permitiendo a los investigadores aislar secuencias diana cuando la referencia es imperfecta, o un proyecto genoma de un organismo no modelo. Al final de un ciclo, ensayo qPCR se utiliza para determinar si es necesario restar más. Una secuencia del candidato validada T mostrará estadísticamente mayor detección en muestras de T-positivo conocidas por qPCR.
Encarnaciones del método han sido implementadas en el descubrimiento de nuevas dianas bacterianas drogas que no tienen host homólogos1,2,3,4 y la identificación de nuevos virus desde equipos infectados 5,6. Además de la identificación de T, el método puede mejorar R: recientemente utilizamos el método para identificar los genes que faltan 936 desde el genoma de referencia de Pinzón de la cebra y un nuevo gen de un cromosoma sólo del germline (T)7. Sustractivo genómica es particularmente valioso cuando T es probable que sea extremadamente divergentes de secuencias conocidas, o cuando la identidad de T es ampliamente definida, como en el pinzón cebra restringido del germline del cromosoma7.
Al no requerir previamente la identificación positiva de T, una ventaja clave de la genómica sustractivo es que es imparcial. En un estudio reciente, Readhead et al examinaron la relación entre la enfermedad de Alzheimer y abundancia viral en cuatro regiones del cerebro. Para la identificación viral, Readhead et al crearon una base de datos de 515 virus8, limitando seriamente los agentes virales que su estudio podría identificar. Sustractivo genómica podría se han utilizado para comparar los sanos y genomas de Alzheimer para aislar de posibles virus nuevos asociados a la enfermedad, independientemente de su semejanza a los agentes infecciosos conocidos. Si bien hay 263 virus dirigidos a humanos, se ha estimado que existen aproximadamente 1,67 millones por descubrir especies virales, con 631.000 827.000 de ellos con un potencial para infectar a los seres humanos9.
Aislamiento de virus nuevos es un área en la cual resta genómica es muy eficaz, pero algunos estudios pueden que no necesite un método riguroso. Por ejemplo, estudios de identificables nuevos virus han utilizado imparcial secuenciación de alto rendimiento seguido por transcripción reversa y BLASTx de secuencias virales5 o enriquecimiento de ácidos nucleicos virales para extraer e invertir transcriben secuencias virales 6. mientras estos estudios secuenciación de novo y Asamblea, resta no fue utilizada porque las secuencias blanco se identificaron positivamente a través de la explosión. Si los virus eran completamente nuevos y no relacionados con (o muy relacionados) a otros virus, genómica sustractivo habría sido una técnica útil. El beneficio de la genómica sustractivo es que se pueden obtener secuencias que son completamente nuevas. Si se conoce el genoma del organismo, puede restarse a dejar cualquier secuencia viral. Por ejemplo, en nuestro estudio publicado se aislaron una secuencia viral novela del pinzón de la cebra a través de la genómica sustractivo, aunque no era nuestra intención original7.
Sustractivo genómica también ha demostrado ser útil en la identificación de los objetivos de la vacuna bacteriana, motivados por el aumento dramático en la resistencia a los antibióticos1,2,3,4. Para minimizar el riesgo de reacción autoinmune, investigadores limitado los objetivos potenciales de la vacuna restando cualquier proteínas que tienen homólogos en el anfitrión humano. Un estudio particular, mirando la pseudotuberculosis del Corynebacterium, realiza sustracción de genoma hospedador vertebrado de varios genomas bacterianos para que objetivos de medicamentos posible no afectaría a las proteínas en los anfitriones llevando a efectos secundarios 1. el flujo de trabajo básico de estos estudios es para descargar el proteoma bacteriano, determinar proteínas vitales, quitar proteínas redundantes, usar BLASTp para aislar las proteínas esenciales y BLASTp contra host proteoma para quitar cualquier proteínas con homólogos de host 1 , 2 , 3 , 4. en este caso, genómica resta asegurar que las vacunas desarrolladas no tendrá efectos off-target en el host1,2,3,4.
Utilizamos sustractivo genómica para identificar el primer gen codificante de la proteína en un restringido del germline cromosoma (GRC) (en este caso, T), que se encuentra en germlines pero no somática tejido de ambos sexos de10. Antes de este estudio, la información solamente genomic que se sabía acerca de lo GRC fue una región repetitiva11. Asamblea de novo fue realizada en RNA secuenciado de tejidos de ovario y teste (T + R) de pinzones cebra adulto. La eliminación computacional de secuencias se realizó usando publicado somático (muscular) genoma secuencia (R1)12, su materia prima (Sanger) lee datos (R2) y somático (cerebro) transcriptoma (R3)13. El uso secuencial de tres referencias fue impulsado por qPCR en paso 5 de cada ciclo (figura 2A), mostrando que el filtrado adicional se requiere. El gen de la α-SNAP descubierto fue confirmado mediante qPCR de DNA y RNA, clonación y secuenciación. Mostramos en el ejemplo que este método es flexible: no es dependiente en las coincidencias con los ácidos nucleicos (ADN vs RNA) y que resta se puede realizar con referencias (R) que están compuestos por conjuntos o lee crudo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:499px;" width="498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accustart II Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:65px;">Quanta Bio</td>
			<td align="right" style="width:52px;">95141</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST)</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Bowtie 2</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://www.python.org/download/releases/2.7/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">BWA-MEM v. 0.7.12</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geneious</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">PEAR v. 0.9.6</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Personal Computer</td>
			<td style="width:65px;">Biomatters</td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.geneious.com/</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:215px;">PowerSYBR qPCR mix</td>
			<td style="width:65px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:52px;">4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Python v. 2.7</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Reptile v.1.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">Stratagene Mx3005P</td>
			<td style="width:65px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:52px;">401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TransDecoder v. 3.0.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Trinity v. 2.4.0</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel sequence discovery by subtractive genomics

Sustractivo genómica puede utilizarse en cualquier investigación donde el objetivo es identificar la secuencia de un gen, la proteína o región general que está incrustado en un contexto más amplio de la genómico. Sustractivo genómica permite a un investigador aislar una secuencia Diana de interés (T) por la secuencia completa y restando elementos genéticos conocidos (referencia R). El método puede utilizarse para identificar secuencias novedosas tales como mitocondrias, cloroplastos, virus, o línea germinal restringido los cromosomas y es particularmente útil cuando T no puede ser fácilmente aislado de R. a partir de los datos genomic integrales (R + T), el método utiliza básico Local herramienta alineación de la búsqueda (BLAST) contra una secuencia de referencia, o secuencias, para quitar las secuencias conocidas correspondientes (R), dejando detrás del objetivo (T). Resta trabajar mejor, R debe ser un proyecto relativamente completo que falta T. Desde secuencias queda después de restar se prueban a través cuantitativo reacción en cadena polimerasa (qPCR), R no necesita ser completa para el método de trabajo. Aquí enlazamos pasos computacionales con medidas experimentales en un ciclo que puede ser iterado según sea necesario, secuencialmente eliminando múltiples secuencias de referencia y refinar la búsqueda para T. La ventaja de la genómica sustractivo es que puede identificarse una secuencia de destino completamente novedoso incluso en los casos en que la purificación física es difícil, imposible o costoso. Un inconveniente del método es encontrar una referencia adecuada para la resta y la obtención de T-positivos y negativos de las muestras para ensayos de qPCR. Se describe la implementación del método en la identificación el primer gen del cromosoma del germline-restricta del pinzón de la cebra. En ese caso filtrado computacional involucrados tres referencias (R), eliminados secuencialmente en tres ciclos: un incompleto conjunto genómico datos genómicos y transcriptómicos datos.

Después de ejecutar el BLAST, el archivo de salida tendrá una lista de las secuencias de la consulta que coincida con la base de datos. Después resta de Python, un número de secuencias nonmatching obtenido y probado por qPCR. Los resultados de este y próximos pasos, se discuten a continuación.
Negativo resultado. Hay dos posibles resultados negativos que se observan después de la explosión a la secuencia...

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Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Nueva secuencia descubrimiento por la genómica sustractivo

El propósito de este protocolo es utilizar una combinación de computacional y de investigación del Banco para buscar nuevas secuencias que no se puede separar fácilmente de una secuencia Co purificador, que puede ser conocida sólo parcialmente.

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Nuestro protocolo es significativo porque se puede utilizar para identificar secuencias genómicas que no se pueden aislar de secuencias de co-purificación, que sólo pueden ser parcialmente conocidas. Las principales ventajas de esta técnica es que es barato, utilizando principalmente software libre que se puede descargar, así como flexible. Puede aplicarlo a muchas preguntas biológicas.Las aplicaciones potenciales incluyen la identificación de objetivos de vacunas bacterianas y la identificación de virus cuyas secuencias son extremadamente diferentes de los microbios conocidos. Este método se puede aplicar a cualquier sistema en el que lo desconocido no se pueda separar experimentalmente, siempre y cuando la secuencia de referencia sin el objetivo genómico esté disponible. Esta técnica requiere un poco de prueba y error, por lo que la paciencia es importante.Es posible que tenga problemas para filmar los programas. Puede utilizar programas diferentes de los que describimos aquí. Utilice los manuales de usuario tanto como sea posible.La demostración visual de este método es útil porque el trabajo computacional depende de una comprensión básica de cómo se estructura la programación de línea de comandos. Para empezar, utilice Trimmomatic 0.32 para eliminar adaptadores de illumina y bases de baja calidad. Utilice la versión 0.9.11 de Pera para crear lecturas combinadas de alta calidad a partir de lecturas emparejadas de salida trimmomática utilizando parámetros predeterminados.A continuación, utilice Reptile versión 1.1 para corregir errores las lecturas producidas a través de Pera. Por último, utilice la versión 2.4.0 de Trinity en el modo predeterminado para ensamblar las secuencias corregidas. Para bibliotecas específicas de hebras, utilice el parámetro SS_lib_type.La salida es un archivo FASTA que se colocará en un nuevo directorio llamado trinity_output. Haga una base de datos BLAST de la secuencia de referencia nucleotide_reference. fasta en la línea de comandos.BLAST emparejado la consulta ensamblada con la base de datos de referencia. Para obtener un archivo de salida, utilice BLAST_results. txt Para generar la salida tabular necesaria para los pasos de procesamiento de subsecuencia con scripts de Python, utilice outfmt 6 Para una mayor rigurosidad, utilice secuencias de proteínas del ensamblado como la consulta BLAST con NUCleótido BLAST traducido, que realiza la traducción de seis vías de la base de datos de nucleótidos.Para obtener secuencias de proteínas para la consulta, ejecute TransDecoder. Comando Long0rfs para identificar los fotogramas de lectura abiertos más largos de las secuencias de consulta ensambladas. Ahora ejecuta tblastn.Si es necesario, asegúrese de que se selecciona el código genético correcto para el organismo que se está estudiando utilizando la opción de código db_gencode con la opción de código adecuada. Si hay disponible una referencia proteica de alta calidad, utilice la coincidencia proteína-proteína con blastp en lugar de tblastn Make a BLAST database of the protein reference. Asegúrese de guardar el resultado como un archivo para el procesamiento de nivel inferior y utilice la salida tabular para asegurarse de que los scripts de Python pueden analizarlos correctamente.Ahora, utilice la secuencia de comandos de Python sustractiva para eliminar las secuencias coincidentes. Para asignar las lecturas al ensamblado, utilice BWA-MEM Versión 0.7.12 o bowtie 2 para asignar las lecturas sin procesar descargadas al ensamblado de consulta. En primer lugar, indexe el ensamblado y, a continuación, asigne las lecturas.La salida será el formato SAM. Ejecute la secuencia de comandos de Python removeUnmapped. py utilizando el archivo SAM como entrada.Esto identifica los nombres de las secuencias de consulta sin ninguna lectura coincidente y los guarda en un nuevo archivo de texto. La salida del paso anterior es una lista de nombres de secuencias en un archivo txt. Extraiga un archivo FASTA con estas secuencias.La salida será un archivo fasta. Utilice Genius para determinar manualmente las secuencias de imprimación óptimas. Resalte una secuencia candidata de 21 a 28 pares base para la imprimación delantera, evitando corridas de cuatro o más de cualquier base.Trate de apuntar a una región con una combinación bastante uniforme de todos los pares base. Un solo G o C en tres Prime End es beneficioso, ayudando a anclar la imprimación. Haga clic en la pestaña Estadísticas en el lado derecho de la pantalla para ver la temperatura de fusión estimada de esa secuencia a medida que se resalta la región candidata.Apunte a una temperatura de fusión entre 55 y 60 grados Celsius, evitando repeticiones, y largas corridas de G C.Elija una imprimación inversa de la misma manera, situada 150 a 250 pares base tres primos de la imprimación delantera. Mientras que las longitudes de imprimación no necesitan coincidir, la temperatura de fusión pronosticada debe ser lo más cercana posible a la de la imprimación delantera. Asegúrese de invertir el complemento de la secuencia haciendo clic con el botón derecho en Genius mientras una secuencia se resalta en una opción de menú.Un método alternativo es utilizar la función Primer Design, que se encuentra en la barra de herramientas superior de la ventana Secuencia. Inserte la región que desea amplificar en Región de destino. En la pestaña Características, inserte el tamaño deseado, la temperatura de fusión y, por ciento, G C y, a continuación, haga clic en Aceptar para generar imprimaciones.Para realizar la validación cuantitativa de PCR de la secuencia restante, primero prepare una mezcla de reacción para cada plantilla en triplicado, con nuestro SYBR Green Master Mix, imprimaciones hacia adelante y hacia atrás, y agua, para un volumen total de 25 microlitros. Ejecute un programa qPCR informado por la temperatura y el tiempo de extensión previamente validados. Las curvas de desnaturalizar finales deben generarse al menos la primera vez que se emplean las imprimaciones en qPCR para validar la amplificación de un solo producto de ADN.Mida las señales QPCR SYBR Verde en relación con Actin by Ct Para todos los casos, calcule el promedio y la desviación estándar de dos a la Ct en relación con Actin. Realice la electroforesis de gel de punto final, para confirmar la detección correcta del tamaño del producto por qPCR. Aquí, ejecute 25 microlitros del producto qPCR mezclados con cinco microlitros de tinte 6X Glitterol en un gel de agarosa 2%TAE a 200 voltios durante 20 minutos.Si su qPCR muestra que no ha identificado las secuencias de destino, repita todo el ciclo con una nueva referencia, que se puede obtener de una base de datos en línea. El proyecto sustractivo en este caso comenzó con la secuenciación del ARN del tejido forrado de gérmenes del pinzón cebra adulto macho y hembra. En última instancia, se identificaron 935 genes somáticos que no se incluyeron previamente en la anotación del genoma completo.Después del filtrado computacional, la PCR cuantitativa puede producir un resultado negativo en el que no hubo diferencia en la detección entre los tejidos de las aves. Por el contrario, se confirma un resultado positivo que representa la identificación de una secuencia de destino real cuando el qPCR del ADN genómico muestra una detección estadísticamente mayor en el tejido de interés, en relación con la referencia. Aquí, el gen alfa snap fue validado para ser restringido por la línea germinal porque se agotó en tejido somático en relación con el ADN de los testículos donde estaba presente que los niveles equivalentes a Actin.Es importante recordar utilizar las entradas correctas durante cada uno de los pasos computacionales. Es posible que tenga que pasar por la resta de ciclo varias veces para obtener la secuencia o secuencias de destino. Se puede realizar una variedad de análisis filogenéticos, estructurales y funcionales en los genes descubiertos.Estos métodos adicionales dan una idea de los roles evolutivos y funcionales de los genes. Identificamos el primer gen en un cromosoma de pájaros cantores restringido por germinales, que amplió el interés en este sorprendente elemento genómico. El trabajo posterior mostró cromosomas similares en muchas especies de pájaros cantores que contienen muchos genes adicionales.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Investigación

Genética

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