Name: novel sequence discovery by subtractive genomics
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

Yazarlar Michelle Biederman, Alyssa Pedersen ve Colin J. Saldanha çeşitli aşamalarında zebra finch genomik proje ile onların yardımını kabul edersiniz. Ayrıca Evgeny Bisk küme sistem yönetimi ve NIH grant 1K22CA184297 (için J.R.B.) ve NIH NS 042767 (C.J.S için) bilgi işlem için kabul.

1. de novo araya başlayarak sırası
Not: derleme bu verilerden üretilebilir sürece herhangi bir yeni nesil sıralı (NGS) verileri, kullanılabilir. Illumina, PacBio, uygun giriş verileri içerir veya Oxford Nanopore bir fasta dosyaya monte okur. Concreteness için bu bölümde açıklanmaktadır bir Illumina tabanlı transcriptomic derleme belirli zebra finch bir çalışma biz gerçekleştirilen7; Ancak ayrıntıları projeye göre değişir unutmayın. Bi...

<ol>
	<li>Barh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Comparative+Genomics+Analysis+for+Common+Drug+and+Vaccine+Targets+in+Corynebacterium+pseudotuberculosis+and+other+CMN+Group+of+Human+Pathogens.">A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).</li><li>Sarangi, A. N., Aggarwal, R., Rahman, Q., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtractive+Genomics+Approach+for+in+Silico+Identification+and+Characterization+of+Novel+Drug+Targets+in+Neisseria+Meningitides+Serogroup+B.">Subtractive Genomics Approach for in Silico Identification and Characterization of Novel Drug Targets in Neisseria Meningitides Serogroup B.</a> Journal of Computer Science &amp; Systems Biology. 2 (5), (2009).</li><li>Kaur, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Druggable+Targets+for+Acinetobacter+baumannii+Via+Subtractive+Genomics+and+Plausible+Inhibitors+for+MurA+and+MurB.">Identification of Druggable Targets for Acinetobacter baumannii Via Subtractive Genomics and Plausible Inhibitors for MurA and MurB.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 171 (2), 417-436 (2013).</li><li>Rathi, B., Sarangi, A. N., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+subtraction+for+novel+target+definition+in+Salmonella+typhi.">Genome subtraction for novel target definition in Salmonella typhi.</a> Bioinformation. 4 (4), 143-150 (2009).</li><li>Epstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+GBV-D,+a+Novel+GB-like+Flavivirus+from+Old+World+Frugivorous+Bats+(Pteropus+giganteus)+in+Bangladesh.">Identification of GBV-D, a Novel GB-like Flavivirus from Old World Frugivorous Bats (Pteropus giganteus) in Bangladesh.</a> PLoS Pathogens. 6 (7), (2010).</li><li>Kapoor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Rodent+Homologs+of+Hepatitis+C+Virus+and+Pegiviruses.">Identification of Rodent Homologs of Hepatitis C Virus and Pegiviruses.</a> MBio. 4 (2), (2013).</li><li>Biederman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+First+Germline-Restricted+Gene+by+Subtractive+Transcriptomic+Analysis+in+the+Zebra+Finch,+Taeniopygia+guttata.">Discovery of the First Germline-Restricted Gene by Subtractive Transcriptomic Analysis in the Zebra Finch, Taeniopygia guttata.</a> Current Biology. 28 (10), 1620-1627 (2018).</li><li>Readhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Analysis+of+Independent+Alzheimer's+Cohorts+Finds+Disruption+of+Molecular,+Genetic,+and+Clinical+Networks+by+Human+Herpesvirus.">Multiscale Analysis of Independent Alzheimer's Cohorts Finds Disruption of Molecular, Genetic, and Clinical Networks by Human Herpesvirus.</a> Neuron. 99, 1-19 (2018).</li><li>Carroll, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+virome+project.">The global virome project.</a> Science. 359 (6378), 872-874 (2016).</li><li>Pigozzi, M. I., Solari, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+restriction+and+regular+transmission+of+an+accessory+chromosome+that+mimics+a+sex+body+in+the+zebra+finch.+Taeniopygia+guttata.">Germ cell restriction and regular transmission of an accessory chromosome that mimics a sex body in the zebra finch. Taeniopygia guttata.</a> Chromosome Research. 6, 105-113 (1998).</li><li>Itoh, Y., Kampf, K., Pigozzi, M. I., Arnold, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+characterization+of+the+germline-restricted+chromosome+sequence+in+the+zebra+finch.">Molecular cloning and characterization of the germline-restricted chromosome sequence in the zebra finch.</a> Chromosoma. 118, 527-536 (2009).</li><li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+a+songbird.">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li><li>Balakrishnan, C. N., Lin, Y. C., London, S. E., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+transcriptome+analysis+of+male+and+female+zebra+finch+cell+lines.">RNAseq transcriptome analysis of male and female zebra finch cell lines.</a> Genomics. 100, 363-369 (2012).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAR:+a+fast+and+accurate+Illumina+Paired-End+reAd+mergeR.">PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR.</a> Bioinformatics. 30, 614-620 (2014).</li><li>Yang, X., Dorman, K. S., Aluru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reptile:+representative+tiling+for+short+read+error+correction.">Reptile: representative tiling for short read error correction.</a> Bioinformatics. 26, 2526-2533 (2010).</li><li>MacManes, M. D., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+transcriptome+assembly+through+error+correction+of+high-throughput+sequence+reads.">Improving transcriptome assembly through error correction of high-throughput sequence reads.</a> PeerJ. 1 (113), (2013).</li><li>Grabherr, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+transcriptome+assembly+from+RNA-seq+data+without+a+reference+genome.">Full-length transcriptome assembly from RNA-seq data without a reference genome.</a> Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).</li><li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+sequence+reads,+clone+sequences+and+assembly+contigs+with+BWA-MEM.">Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM.</a> arXiv. , (2013).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357-359 (2012).</li><li>Kearse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geneious+Basic:+an+integrated+and+extendable+desktop+software+platform+for+the+organization+and+analysis+of+sequence+data.">Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data.</a> Bioinformatics. 28 (12), 1647-1649 (2012).</li><li>Peirson, S. N., Butler, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+polymerase+chain+reaction.">Quantitative polymerase chain reaction.</a> Methods in Molecular Biology. 362, 349-362 (2007).</li><li>Hunt, M., Kikuchi, T., Sanders, M., Newbold, C., Berriman, M., Otto, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAPR+citation:+REAPR:+a+universal+tool+for+genome+assembly+evaluation.">REAPR citation: REAPR: a universal tool for genome assembly evaluation.</a> Genome Biology. 14 (5), (2013).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mitochondrial+genome+sequence+of+a+hominin+from+Sima+de+los+Huesos.">A mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos.</a> Nature. 505 (7483), 403-406 (2013).</li><li>Gunnarsd&#243;ttir, E. D., Li, M., Bauchet, M., Finstermeier, K., Stoneking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+complete+human+mtDNA+genomes+from+the+Philippines.">High-throughput sequencing of complete human mtDNA genomes from the Philippines.</a> Genome Research. 21 (1), 1-11 (2010).</li><li>King, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+and+high-throughput+massively+parallel+sequencing+of+the+human+mitochondrial+genome+using+the+Illumina+MiSeq.">High-quality and high-throughput massively parallel sequencing of the human mitochondrial genome using the Illumina MiSeq.</a> Forensic Science International: Genetics. 12, 128-135 (2014).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+in+Actinidiaceae:+Genome+Structure+and+Comparative+Analysis.">The First Complete Chloroplast Genome Sequences in Actinidiaceae: Genome Structure and Comparative Analysis.</a> Plos One. 10 (6), (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+of+Five+Epimedium+Species:+Lights+into+Phylogenetic+and+Taxonomic+Analyses.">The Complete Chloroplast Genome Sequences of Five Epimedium Species: Lights into Phylogenetic and Taxonomic Analyses.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oxytricha+trifallax+Mitochondrial+Genome.">The Oxytricha trifallax Mitochondrial Genome.</a> Genome Biologyogy and Evolution. 4 (2), 136-154 (2011).</li><li>Barth, D., Berendonk, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome+sequence+of+the+ciliate+Paramecium+caudatum+reveals+a+shift+in+nucleotide+composition+and+codon+usage+within+the+genus+Paramecium.">The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium.</a> BMC Genomics. 12 (1), (2011).</li><li>Coombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Complete+Sitka+Spruce+Chloroplast+Genome+Using+10X+Genomics'+GemCode+Sequencing+Data.">Assembly of the Complete Sitka Spruce Chloroplast Genome Using 10X Genomics' GemCode Sequencing Data.</a> Plos One. 11 (9), (2016).</li><li>Herschleb, J., Ananiev, G., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis.">Pulsed-field gel electrophoresis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).</li></ol>

Eksiltici genomik güçlü olmakla birlikte, özelleştirme birkaç önemli adımlar ve başvuru dizileri ve test örnekleri dikkatli seçimi gerektiren bir çerez kesici yaklaşım değildir. Sorgu derleme kalitesiz ise, adımları süzme yalnızca derleme eserler izole. Bu nedenle, iyice belirli proje için bir uygun doğrulama protokolü kullanılarak de novo derleme doğrulanması önemlidir. RNA-seq için yönergeleri Tarih teslis Web sitesi18 ve DNA'ın, REAPR23</s...

Bu yöntemin amacı bir roman hedef (T) genomik serisinden, DNA veya RNA, genomik bağlam veya başvuru (R) (resim 1) belirlemektir. Hedef fiziksel olarak ayrı tutulamaz veya bunu yapmak için pahalı olacağını, yöntem en yararlı olur. Yani bizim Yöntem önemli bir yenilik içine referans kusurlu olduğunda hedef sıraları ayırmak araştırmacılar etkinleştirme bir döngüsü, ya da bir taslak tezgah yöntemleri ve hesaplama birleşimi yalnızca birkaç organizmaların mükemmel genleri çıkarma için bitirdikten bir sigara modeli organizmadan genom. Bir döngü sonunda, qPCR sınama daha fazla çıkarma gerekip gerekmediğini belirlemek için kullanılır. Doğrulanmış aday T sıra istatistiksel olarak daha büyük algılama qPCR tarafından bilinen T-pozitif örnekleri gösterir.
Ana bilgisayar homologs1,2,3,4 var mı yeni bakteri uyuşturucu hedefler keşfi ve kimliği roman virüslerden virüslü bilgisayarlardan yöntemi enkarnasyonları uygulanmıştır 5,6. T kimlik ek olarak, yöntem yöntem zebra finch başvuru genom 936 eksik genler ve salt germline kromozom (T)7yeni bir gen tanımlamak için son kullanılan R: artırabilirsiniz. Eksiltici genomik T bilinen dizileri son derece farklı olma olasılığı veya olduğu gibi zebra finch germline tarafından kısıtlanmış kromozom7T kimliğini geniş tanımsızdır özellikle değerlidir.
Önceden T olumlu tanımlaması gerektirmeyen bir anahtar Eksiltici genomik tarafsız avantajdır. Bir son çalışmada, Readhead ve ark. Alzheimer hastalığı ve viral bolluk içinde dört beyin bölgeleri arasındaki ilişki incelenmiştir. İçin viral tanımlama, Readhead ve ark. 515 virüs8ağır sınırlama yaptıkları çalışmada teşhis edebilir viral ajanlar, bir veritabanı oluşturdu. Eksiltici genomik sağlıklı ve Alzheimer genleri karşılaştırmak için ne olursa olsun onların benzerlik bilinen bulaşıcı hastalığı ile ilişkili olası roman virüslerden yalıtmak için kullanılabilirdi. 263 bilinen virüsler insan hedefleme iken, bu yaklaşık 1.67 milyon keşfedilmemiş viral tür var, 631,000-827,000 insanlar9bulaştırmak için bir potansiyele sahip biri ile tahmin edilmektedir.
Roman virüslerden işlemleri olan bir alandır hangi Eksiltici genomik özellikle etkilidir, ancak bazı çalışmalarda sıkı bir yöntem gerekmeyebilir. Örneğin, tanımlayıcı roman virüslerden ayıklamak ve ters ters transkripsiyon ve BLASTx için viral dizileri5 ardından tarafsız yüksek üretilen iş sıralama veya viral nükleik asitleri zenginleştirici kullanmış çalışmalar viral dizileri uyarlamak 6. bu çalışmalar de novo sıralama ve derleme ediyor hedef sıraları olumlu aracılığıyla patlama tespit edilmiştir çünkü çıkarma kullanılmadı. Eğer belgili tanımlık virüs tamamen Roman ve ilişkili olmayan (veya uzaktan ilgili) diğer virüs, Eksiltici genomik yararlı bir yöntem olurdu. Eksiltici genomik yararı tamamen yeni dizileri elde edilebilir olmasıdır. Canlı genomunun büyüklüğü biliniyorsa, o dışarı herhangi bir viral dizileri bırakmak düşülen. Örneğin, bizim orijinal niyet7değildi ama bizim yayınlanan çalışmada biz zebra finch Eksiltici genomik, üzerinden viral bir roman serisinden izole.
Eksiltici genomik da yararlı bakteri aşısı hedefleri, antibiyotik direnci1,2,3,4dramatik artış tarafından motive tanımlaması içinde kanıtlamıştır. Otoimmün reaksiyon riski en aza indirmek için homologs içinde insan sahibi herhangi bir protein çıkararak araştırmacılar potansiyel aşı hedefleri daralmış. Uyuşturucu hedefleri proteinler yan etkileri için önde gelen ana bilgisayarlar arasında etkilemeyeceği emin olmak için birkaç bakteriyel genom üzerinden çıkarma omurgalı ana bilgisayar genleri Corynebacterium pseudotuberculosis, arıyorum bir belirli çalışmada gerçekleştirilen 1. bu çalışmaların temel iş akışı bakteriyel Proteom indir, hayati proteinler belirlemek, gereksiz proteinler kaldırmak için gerekli proteinler yalıtmak için BLASTp ve BLASTp ana bilgisayar Proteom karşı herhangi bir protein ile ev sahibi homologs kaldırmak için kullanın etmektir 1 , 2 , 3 , 4. Bu durumda, Eksiltici genomik geliştirilen aşı ana bilgisayar1,2,3,4' te herhangi bir hedef kapalı etkisi olmayacaktır emin olun.
Biz Eksiltici genomik ilk protein kodlayıcı gen germlines içinde bulunan bir germline tarafından kısıtlanmış kromozom üzerinde (GRC) (Bu durumda, T), tanımlamak için kullanılan ancak ikisinden de değil somatik doku10cinsiyette. Bu çalışmada önce GRC hakkında bilinen sadece genomik bilgi bir yinelenen bölge11oldu. De novo derleme yumurtalık ve teste dokulardan (R + T) Yetişkin zebra finches üzerinden sıralı RNA üzerinde gerçekleştirildi. Dizileri Hesaplamalı ortadan kaldırılması yayımlanmış somatik (kas) genom dizisi (R1)12kullanarak gerçekleştirilen, onun ham (Sanger) veri (R2) ve somatik (beyin) transcriptome (R3)13okuyun. Üç başvurular sıralı kullanımı ek filtreleme gerekli gösterilen adımında her döngüsü (Şekil 2A), 5 test qPCR tarafından tahrik edildi. Keşfedilen α-ek gen DNA ve RNA ve klonlama ve sıralamanın üzerinden qPCR üzerinden teyit edildi. Biz örneğimizde bu yöntem esnektir gösterir: Bu çıkarma-ebilmek var olmak kılınmak ile başvuruları (R) bu derlemeleri veya ham okuma oluşmaktadır ve nükleik asit (DNA vs RNA) eşleşen üzerinde bağımlı değildir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:499px;" width="498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accustart II Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:65px;">Quanta Bio</td>
			<td align="right" style="width:52px;">95141</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST)</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Bowtie 2</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://www.python.org/download/releases/2.7/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">BWA-MEM v. 0.7.12</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geneious</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">PEAR v. 0.9.6</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Personal Computer</td>
			<td style="width:65px;">Biomatters</td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.geneious.com/</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:215px;">PowerSYBR qPCR mix</td>
			<td style="width:65px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:52px;">4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Python v. 2.7</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Reptile v.1.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">Stratagene Mx3005P</td>
			<td style="width:65px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:52px;">401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TransDecoder v. 3.0.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Trinity v. 2.4.0</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel sequence discovery by subtractive genomics

Eksiltici genomik hedefi gen, protein veya daha büyük bir genomik bağlamda katıştırılmış genel bölge sırasını tanımlamak için nerede herhangi bir araştırmada kullanılabilir. Eksiltici genomik faiz (T) bir hedef dizi kapsamlı sıralama ve bilinen genetik öğeleri (başvuru, R) çıkarılarak tarafından izole etmek bir araştırmacı sağlar. Yöntem mitokondri, kloroplast, virüs gibi roman serileri tanımlamak için kullanılan veya germline kromozomlar sınırlı ve T kapsamlı genomik veri ile (R + T), yöntem başlayan R. kolayca izole olamaz özellikle yararlıdır Temel yerel hizalama arama aracı (patlama) eşleşen bilinen dizileri (R), (T) hedef bırakarak kaldırmak için bir başvuru sırası veya dizileri, karşı kullanır. En iyi çalışacak şekilde çıkarma için R T. eksik nispeten tam bir taslak olmalıdır Çıkarma test sonra nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) aracılığıyla kalan dizileri beri R yöntemin işe yaraması için tamamlanmış olması gerekmez. Biz gerektiği gibi tekrarlanır bir döngü içine deneysel adımlarla Hesaplamalı adımları sırayla birden fazla başvuru dizileri kaldırma ve T. için arama rafine link burada Eksiltici genomik avantajı tamamen yeni hedef sıra fiziksel arıtma zor, imkansız ya da pahalı olduğu durumlarda bile belirlenebilir olması. Yöntemin bir dezavantajı uygun bir başvuru için çıkarma bulma ve T-pozitif alma ve negatif qPCR sınama örnekleri. Bizim zebra finch germline tarafından kısıtlanmış kromozom gelen ilk gen tanımlaması yönteminde uygulanması açıklanmaktadır. Bu durumda üç başvuruları (R), sırayla üç devir kaldırıldı Hesaplamalı filtreleme söz konusu: bir eksik genomik derleme, ham genomik veri ve transcriptomic veri.

PATLAMA çalıştırdıktan sonra çıktı dosyasını sorgudan veritabanıyla eşleşmesi sýra bir listesi olacak. Python çıkarma sonra nonmatching dizileri bir dizi elde edilen ve qPCR tarafından test edilmiştir. Bu sonuçlar ve sonraki adımlar, aşağıda ele alınmıştır.
Negatif sonuç. Patlamadan sonra başvuru sırasına görülebilir iki olası olumsuz sonuçları vardır. Toplam sıra herhangi b...

Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Eksiltici genomik tarafından roman sıra bulma

Bu iletişim kuralının amacı bilinen yalnızca kısmen bir ortak arındırıcı serisinden kolayca ayrılamayan roman dizileri bulamadı bir arada hesaplamalı ve tezgah araştırma kullanmaktır.

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Protokolümüz önemlidir, çünkü ortak arındırıcı dizilerden izole edilemeyen genomik dizileri tanımlamak için kullanılabilir, ki bu da kısmen bilinebilir. Bu tekniğin ana avantajları ucuz olmasıdır, hem de esnek indirilebilir çoğunlukla ücretsiz yazılım kullanarak. Birçok biyolojik soruya uygulayabilirsiniz.Potansiyel uygulamalar bakteriyel aşı hedeflerinin belirlenmesi ve dizileri bilinen mikroplardan son derece farklı olan virüslerin belirlenmesini içerir. Bu yöntem, genomik hedef olmadan referans sırası mevcut olduğu sürece, bilinmeyenin deneysel olarak ayrılamayacağı herhangi bir sisteme uygulanabilir. Bu teknik bazı deneme yanılma alır, bu yüzden sabır önemlidir.Programları çekmekte sorun yaşamanız gerekebilir. Burada tanımladıklarından farklı programlar kullanabilirsiniz. Kullanım kılavuzlarını mümkün olduğunca kullanın.Hesaplamalı çalışma komut satırı programlamanın nasıl yapılandırıldığına ilişkin temel bir anlayışa bağlı olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi yararlıdır. Başlamak için, illumina adaptörleri ve düşük kaliteli üsleri kaldırmak için Trimmomatic 0.32 kullanın. Varsayılan parametreleri kullanarak trimmomatic output eşleştirilmiş okumalardan yüksek kaliteli birleştirilmiş okumalar oluşturmak için Armut sürüm 0.9.11'i kullanın.Daha sonra Armut üzerinden üretilen okumaları düzeltmek için Sürüngen sürüm 1.1'i kullanın. Son olarak düzeltilmiş sıraları bir araya getirmek için varsayılan modda Trinity sürüm 2.4.0'ı kullanın. Strand belirli kitaplıklar için SS_lib_type parametresini kullanın.Çıktı, trinity_output adı verilen yeni bir dizine yerleştirilecek bir FASTA dosyasıdır. nucleotide_reference başvuru sırasının BLAST veritabanını yapın. komut satırında fasta.BLAST, biraraya getirilen sorguyu başvuru veritabanıyla eşleştirdi. Çıktı dosyası almak için BLAST_results kullanın. txt Python komut dosyaları ile alt sıra işleme adımları için gerekli tabular çıktı oluşturmak için, artan sıkılık için outfmt 6 kullanın, nükleotit veritabanının altı yönlü çevirisini gerçekleştiren çevrilmiş nükleotit BLAST ile BLAST sorgusu olarak montajdan protein dizilerini kullanın.Sorgu için protein dizileri elde etmek için TransDecoder'ı çalıştırın. Uzun0rfs komutu biraraya sorgu dizileri en uzun açık okuma kareleri tanımlamak için. Şimdi tblastn çalıştırın.Gerekirse, uygun kod seçeneği ile db_gencode kullanılarak incelenen organizma için doğru genetik kodun seçildiğinden emin olun. Yüksek kaliteli bir protein referansı varsa, tblastn yerine blastp ile eşleşen protein-protein kullanın Protein referansına ait blast veritabanını yapın. Sonucu akış aşağı işleme için bir dosya olarak kaydettiğinden emin olun ve Python komut dosyalarının bunları doğru şekilde ayrıştıradığından emin olmak için tabular çıktıkullanın.Şimdi, eşleşen dizileri kaldırmak için çıkarma Python komut dosyasını kullanın. Okumaları derlemeye eşlemek için, indirilen ham okumaların sorgu derlemesine eşlemi için BWA-MEM Sürüm 0.7.12 veya bowtie 2'yi kullanın. Önce derlemeyi dizine dizin, sonra okumaların haritasını göster.Çıktı SAM biçimi olacaktır. Python komut dosyası removeUnmapped çalıştırın. giriş olarak SAM dosyasını kullanarak py.Bu, eşleşen okumalar yapmadan sorgu dizilerinin adlarını tanımlar ve bunları yeni bir metin dosyasına kaydeder. Önceki adımın çıktısı, txt dosyasındaki dizi adlarının listesidir. Bu dizileri içeren bir FASTA dosyası ayıklayın.Çıktı bir fasta dosyası olacak. En iyi astar dizilerini el ile belirlemek için Genius'ı kullanın. Herhangi bir tabandan dört veya daha fazla sayıda çalıştırmayı önleyerek, ileri astar için 21 ila 28 baz çifti arasında bir aday sırasını vurgulayın.Tüm baz çiftleri oldukça düzgün bir kombinasyonu ile bir bölge hedef deneyin. Üç Prime End'de tek bir G veya C yararlıdır, astar çapa yardımcı olur. Adayın bölge olarak tahmin edilen erime sıcaklığının altını görmek için ekranın sağ tarafındaki İstatistikler sekmesine tıklayın.55 ve 60 santigrat derece arasında bir erime sıcaklığı hedefleyin, tekrarları kaçınarak, ve G C.Uzun çalışır aynı şekilde bir ters astar seçin, 150-250 baz çiftleri üç ileri astar üç astar yer. Astar uzunluklarının eşleşmesine gerek olmasa da, öngörülen erime sıcaklığı ileri astarınkine mümkün olduğunca yakın olmalıdır. Bir menü seçeneğinde bir sıra vurgulanırken Genius'da sağ tıklayarak sırayı tersine çevirdiğinden emin olun.Alternatif bir yöntem, Sıra penceresindeki üst araç çubuğunda bulunan Primer Design işlevini kullanmaktır. Hedef Bölge altında yükseltmek için bölgeyi yerleştirin. Özellikler sekmesinin altında, istenilen boyutu, erime sıcaklığını ve yüzde G C'yi ekleyin ve astarların oluşturulması için Tamam'ı tıklatın.Kalan dizinin nicel PCR doğrulaması gerçekleştirmek için, öncelikle sybr Green Master Mix, ileri ve ters astarlar ve su ile toplam 25 mikrolitre hacim için, triplicate her şablon için bir reaksiyon karışımı hazırlamak. Daha önce doğrulanmış sıcaklık ve uzatma süresi tarafından bilgilendirilmiş bir qPCR programı çalıştırın. Son denaturing eğrileri en azından ilk kez astarlar tek bir DNA ürünampampampifikasyon doğrulamak için qPCR istihdam oluşturulmalıdır.Tüm durumlar için Ct ile Actin'e göre qPCR SYBR Yeşil sinyallerini ölçün, Actin'e göre ct'ye göre iki sinin ortalamasını ve standart sapmasını hesaplayın. QPCR tarafından doğru ürün boyutu tespiti onaylamak için, uç nokta jel elektroforez gerçekleştirin. Burada, 20 dakika boyunca 200 voltta 2% TAE Agarose jel üzerinde 6X Glitterol boya beş mikrolitre ile karışık qPCR ürün 25 mikrolitre çalıştırın.QPCR'ınız hedef dizileri tanımlamadığınızı gösterirse, tüm döngüyü çevrimiçi bir veritabanından elde edilebilecek yeni bir başvuruyla yineleyin. Bu durumda subtraktif proje erkek ve kadın yetişkin zebra ispinoz mikrop kaplı doku Dan RNA dizilime ile başladı. Sonuç olarak, daha önce tüm genom ek açıklamalarında yer almayan 935 somatik gen tespit edildi.Hesaplamalı filtrelemeden sonra, kantitatif PCR kuş dokuları arasında algılamada bir fark olmadığı olumsuz bir sonuç verebilir. Tersine, genomik DNA qPCR referansgöre, ilgi dokusunda istatistiksel olarak daha fazla algılama gösterdiğinde, Gerçek Hedef Dizisi nin tanımlanmasını temsil eden olumlu bir sonuç doğrulanır. Burada, alfa snap geninin mikrop ile sınırlı olduğu doğrulandı çünkü somatik dokuda testees DNA'sına göre tükenmişti.Hesaplama adımlarının her birinde doğru girişleri kullanmayı unutmamak önemlidir. Hedef sırasını veya dizilerini elde etmek için döngü çıkarma dan birden çok kez geçmeniz gerekebilir. Keşfedilen genler üzerinde çeşitli filogenetik, yapısal ve fonksiyonel analizler yapılabilir.Bu ek yöntemler genlerin evrimsel ve işlevsel rolleri hakkında fikir verir. Mikrop ile sınırlı bir ötücü kuş kromozomundaki ilk geni belirledik, bu da bu şaşırtıcı genomik elemente olan ilgiyi genişletti. Sonraki çalışmalarda birçok ötücü kuş türünde benzer kromozomlar birçok ek genler içeren gösterdi.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

İn Vitro Transkripsiyon Tahliller ve İlaç Keşfi Onların Uygulama

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Yüksek yağlı diyet beslenme ve yüksek işlem hacmi Triacylglyceride tahlil Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Sıralı veri--dan toplu Maya 2-hibrid perde Bilişim Analizi

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

İnsan Genomik ve Model Organizma Genetiği Bilgilerini Entegre Eden Web Tabanlı Bir Araç olan MARRVEL'de Gezinme

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...