Name: escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology
Uploaded: 2019-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

المؤلف تود أن تقر الدكتورة جنيفر فانديركيلين، أندريا لوبسشير، وتوني تارتو للدعم التقني ويسلي كاو، لين وليامز وهايت كريستوفر لإجراء مناقشات مفيدة. المؤلف يعترفون أيضا بدعم تمويلي من بيل وليندا الصقيع الصندوق، مركز التطبيقات في شركة شيفرون التكنولوجيا الحيوية تطبيق البحوث الهبات المنح للتكنولوجيا الحيوية والبحوث بولي كال، علمية وبرنامج منح الأنشطة الإبداعية (رسكا 2017)، ومؤسسة العلوم الوطنية (NSF-1708919). [مزل] تسلم "المنحة خريج جامعة كاليفورنيا الدولة". MCJ يعترف الجيش بحوث مكتب W911NF-16-1-0372، تمنح "المؤسسة الوطنية للعلوم" 1413563 المجلس والمجلس-1716766، والقوة الجوية البحوث مختبر مركز التميز منحة FA8650-15-2-5518، "منحة وكالة الحد من تهديد الدفاع" HDTRA1-15-10052/P00001، وديفيد ولوسيل باكارد، البرنامج المعلم-الباحث كاميل دريفوس، الإدارة للطاقة البر المنح دي-SC0018249، برنامج العلوم البشرية الحدود (RGP0015/2017)، منحة أتوب معهد الجينوم المشترك الفلاني، و شيكاغو الكونسورتيوم الطبية بدعم من "أموال سيرل" في "ثقة المجتمع شيكاغو" للدعم.

1-وسائل الإعلام إعداد ونمو الخلايا
<ol><li>
1 يوم
	<ol>
<li>خلايا BL21*(DE3) كولاي متواصلة من والغليسيرول الأسهم على صفيحة أجار رطل واحتضانها لمالا يقل عن 18 ح عند 37 درجة مئوية.</li>
		<li>إعداد 50 مل الإعلام رطل والاوتوكلاف الحل على أساس دورة سائل لمدة 30 دقيقة في 121 درجة مئوية. تخزين في درجة حرار?...

تخليق البروتين الخلية الحرة برز كتقنية قوية وملائمة لمجموعة متنوعة من التطبيقات تتراوح التحويلية سريع نموذجي الأنظمة البيوكيميائية. ويدعم القدرة على رصد ومعالجة وزيادة الأجهزة الخلوية في الوقت الحقيقي إلى اتساع نطاق التطبيقات. وعلى الرغم من تأثير هذه التكنولوجيا منصة الآخذة في التوسع،...

وبرز توليف بروتين الخلية الحرة (الحراجية) تكنولوجيا التي قد مقفلة عددا من الفرص الجديدة لإنتاج البروتين والجينوم الوظيفي والهندسة الأيضية وأكثر في غضون 50 عاماً الماضية1،2. بالمقارنة مع القياسية في فيفو منابر التعبير البروتين، الحراجية توفر ثلاث مزايا رئيسية: 1) طبيعة الخلية خالية من المنصة تتيح إنتاج البروتينات التي يحتمل أن تكون السمية أو الخارجية ل الخلية3،4 ،،من56؛ 2) المنظمة للحمض النووي والأخذ بقالب الحمض النووي ترميز gene(s) لمصلحة قناة كل الطاقة الشاملة في رد فعل لإنتاج protein(s) الفائدة؛ و 3) الطبيعة المفتوحة للمنصة تمكن المستخدم من تعديل ورصد رد فعل الظروف والتكوين في الوقت الحقيقي7،8. يدعم هذا الوصول المباشر إلى رد فعل زيادة النظم البيولوجية مع كيمياء الموسعة وظروف الأكسدة والاختزال لإنتاج البروتينات رواية وضبط العمليات الأيضية2،9، 10-توجيه الوصول كما يسمح للمستخدم بالجمع بين فعل الحراجية مع فحوصات النشاط في نظام واحد-وعاء لزيادة سرعة التصميم-البناء-اختبار دورات11. القدرة على القيام برد فعل الحراجية في قطيرات صغيرة الحجم أو على الأجهزة المستندة إلى الورق كذلك يدعم جهود الاكتشاف الفائق والنماذج الأولية السريعة12،،من1314،15 ،16. ونتيجة لهذه المزايا وطبيعة النظام التوصيل والتشغيل، مكن الحراجية فريد مجموعة متنوعة من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية مثل إنتاج البروتينات التي يصعب على التعبير عن سلوبلي في فيفو17، 19،،من 1820، والكشف عن المرض21،،من2223، على الطلب التحويلية18،24 ،25،،من2627، والتعليم28،29، كل منها التحلي بالمرونة وفائدة من منصة خالية من الخلية.
يمكن إنشاء النظم الحراجية من مجموعة متنوعة من ليساتيس الخام من كلا خطوط الخلية بدائية النواة وحقيقية النواة. يسمح هذا للحصول على خيارات متنوعة في النظام للاختيار، وكل منها لديها مزايا وعيوب اعتماداً على التطبيق للفائدة. كما تتفاوت النظم الحراجية في إعداد الوقت والتكلفة والإنتاجية. الأكثر شيوعاً المستخدمة خلية تنتج مقتطفات من جرثومة القمح وارنب خلية شبكية وخلايا الحشرات وخلايا الإشريكيّة القولونية ، مع كونه الأخير الأكثر فعالية من حيث التكلفة حتى الآن بينما تنتج غلات الحجمي أعلى من البروتين30 . بينما النظم الحراجية الأخرى يمكن أن يكون مفيداً لجهازهم التعديل بوستترانسلاشونال الفطرية، التطبيقات استخدام كولايالناشئة-استناداً إلى الآلية قادرة على سد الفجوة عن طريق توليد سيتيسبيسيفيكالي فوسفوريلاتيد و الغليكوزيلاتي البروتينات على الطلب31،،من3233،،من3435.
يمكن تشغيل الحراجية ردود الفعل أما دفعة واحدة، التبادل المستمر خلية خالية (سيكف) أو تنسيقات (CFCF) الخلية الحرة تدفق مستمر. تنسيق دفعة هو نظام مغلق عمر رد الفعل الذي محدود بسبب تناقص كميات كواشف مختبر وتراكم تركات المثبطة لرد الفعل. أساليب سيكف و CFCF زيادة العمر من رد فعل، ومما يسفر عن البروتين الحجمي زيادة غلة مقارنة برد فعل المجموعة. يتم ذلك عن طريق السماح للمنتجات الثانوية تخليق البروتين المراد إزالتها من وعاء التفاعل في حين يتم توفيره كواشف مختبر جديد طوال فترة رد الفعل2. في حالة CFCF، يمكن أيضا إزالة بروتين الفائدة من دائرة رد الفعل، بينما في سيكف، البروتينات تظل الفائدة في دائرة رد الفعل تتألف من36،شبه نفاذية الأغشية37. هذه الأساليب ذات قيمة خاصة في التغلب على ضعف غلة الحجمي البروتينات للتعبير عن اهتمام38،39،،من4041،42، 43. التحديات التي يواجهها تنفيذ النهج سيكف و CFCF هي 1) في حين أنها تسفر عن استخدام أكثر كفاءة للآلية البيولوجية المسؤولة عن النسخ والترجمة، أنها تتطلب كميات أكبر لا سيما من الكواشف التي تزيد من التكلفة الإجمالية و 2) وهي تتطلب أكثر تعقيداً رد فعل الأجهزة والمعدات المتخصصة مقارنة ب تنسيق دفعة44. من أجل ضمان إمكانية الوصول للمستخدمين الجدد، توضحها البروتوكولات التركيز على شكل دفعة في مجلدات رد فعل من 15 ميليلتر مع توصيات محددة من أجل زيادة حجم رد فعل لمقياس المليلتر.
الأساليب المقدمة هنا تمكين غير الخبراء ذوي المهارات المختبرية الأساسية (مثل طلاب المرحلة الجامعية) تنفيذ نمو الخلايا واستخراج إعداد الدفعة تنسيق إعداد رد فعل كولاي-استناداً إلى نظام الحراجية. وهذا النهج فعالة من حيث التكلفة مقارنة بمجموعات المتاحة تجارياً دون التضحية بالسهولة لإعداد رد فعل يستند إلى مجموعة. وعلاوة على ذلك، يمكن هذا النهج التطبيقات في المختبر وفي الميدان. المستخدمين الجدد تماما عند اتخاذ قرار لتنفيذ الحراجية، ينبغي تقييم فعالية أنظمة تعبير البروتين التقليدية للاستثمار بدء التشغيل، الحراجية قد لا تكون متفوقة في كل حالة. الطرق الحراجية الموضحة هنا تمكين المستخدم لمباشرة تنفيذ مجموعة متنوعة من التطبيقات، بما في ذلك الجينوم الوظيفي، الاختبار، وإنتاج البروتينات التي مستعصية على الحل للتعبير في فيفو ، فضلا عن الحقل الفائق التطبيقات بما في ذلك أجهزة استشعار العوامل البيولوجية ومواد تعليمية للبيولوجيا التركيبية. تطبيقات إضافية مثل الهندسة الأيضية وضبط شروط التعبير البروتين والكشف عن المرض، والارتقاء باستخدام أساليب سيكف أو CFCF لا تزال ممكنة ولكن قد تتطلب خبرة مع منصة الحراجية لمزيد من التعديل من رد فعل شروط. لدينا طرق الجمع بين النمو في وسائل الإعلام المخصب وقوارير حيرة، مع طرق سريعة نسبيا واستنساخه من تحلل الخلية عن طريق سونيكيشن، متبوعاً بإعداد رد فعل الحراجية مبسطة التي تستخدم قبل المزيج الأمثل45. بينما قد تصبح أساليب النمو الخلوي موحدة إلى حد ما داخل هذا الحقل، طرق لتحلل الخلية تختلف على نطاق واسع. بالإضافة إلى سونيكيشن، وتشمل المشتركة تحلل أساليب الاستفادة من صحافة فرنسية والخالطون، وحبه المضارب، أو lysozyme وأخرى تعطل البيوكيميائية والفيزيائية أساليب46،47،48، 49-استخدام أساليب عملنا، ويتم الحصول على حوالي 2 مل استخراج النفط الخام الخلية الواحدة 1 لتر خلايا. ويمكن دعم هذه الكمية من استخراج خلية أربعمائة 15 ميليلتر الحراجية من ردود الفعل، وكل إنتاج ~ 900 ميكروغرام/مل من البروتين سفجفب مراسل من قالب بلازميد pJL1-سفجفب. هذا الأسلوب يكلف $0.021/ميكروغرام سفجفب المنتجة ($.019/ميليلتر من رد الفعل)، باستثناء تكلفة العمالة والمعدات (تكميلية الشكل 1). ابتداء من الصفر، هذا الأسلوب يمكن تنفيذها في 4 أيام في شخص واحد، وكرر الحراجية ردود فعل يمكن أن تنجز في غضون ساعات (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، يمكن الارتقاء بالبروتوكول في تخزين لدفعات أكبر من إعداد كاشف لتناسب احتياجات المستخدم. الأهم من ذلك، يمكن تنفيذ البروتوكول المعروضة هنا غير مختبر تدريب الخبراء مثل طلاب المرحلة الجامعية، كما أنه يتطلب فقط المهارات المختبرية الأساسية. قد وضعت خصيصا لتحسين إمكانية الحصول على منصة الحراجية كولاي للاستخدام الواسع الإجراءات الواردة أدناه، والفيديو المصاحبة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">12795027</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60353-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P9791-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">KOH</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IPTG</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(OAc)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tris(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DTT</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">tRNA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Folinic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NTPs</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Oxalic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NAD</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CoA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PEP</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NH4(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">02180595.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(Glu)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Spermidine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Molecular Grade Water</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Aspartic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Valine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Alanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Arginine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Asparagine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Glycine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Histadine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Proline</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Serine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tyrosine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ultrasonic Processor</td>
			<td style="width:145px;">QSonica</td>
			<td style="width:123px;">Q125-230V/50Hz</td>
			<td>3.175 mm diameter probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1L Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microfuge 20</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cytation 5</td>
			<td style="width:145px;">BioTek</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Strep-Tactin XT Starter Kit</td>
			<td style="width:145px;">IBA</td>
			<td style="width:123px;">2-4998-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">pJL1-sfGFP</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:145px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

على مدى السنوات الخمسين الماضية، برز توليف بروتين الخلية الحرة (الحراجية) كتقنية قوية لتسخير قدرات الخلايا داخل أنبوب اختبار النسخي ومتعدية الجنسيات. تنتفي الحاجة إلى الحفاظ على بقاء الخلية، وإزالة الجدار الخلوي، الحراجية كانت التأسيسية للتطبيقات المستجدة في التحويلية بروتينات الصعبة تقليديا، فضلا عن التطبيقات في النماذج الأولية السريعة الهندسة الأيضية، وعلم الجينوم الوظيفي. لدينا الوسائل لتنفيذ كولاي-أساس الحراجية منصة تسمح للمستخدمين الجدد الوصول إلى العديد من هذه التطبيقات. هنا، نحن تصف أساليب إعداد مقتطف من خلال استخدام وسائل الإعلام المخصب وقوارير حيرة واستنساخه بطريقة تحلل الخلية على أساس sonication الانضباطي. يمكن ثم استخدام هذا المقتطف للتعبير البروتين قادرة على إنتاج 900 ميكروغرام/مل أو أكثر من مجلد سوبر أخضر نيون البروتين (سفجفب) في ح 5 فقط من الإعداد التجريبية لتحليل البيانات، ونظرا لأن مخزون الكاشف المناسب قد أعدت مسبقاً. بدء التشغيل المقدرة تكلفة الحصول على الكواشف هو $4,500 الذي سيتم الحفاظ على الآلاف من ردود أفعال بتكلفة تقدر دولار 0.021 الواحدة ميكروغرام بروتين التي تنتجها أو $0.019 كل ميليلتر من رد الفعل. بالإضافة إلى ذلك، تعكس أساليب التعبير البروتين سهولة الإعداد رد فعل ينظر في النظم المتاحة تجارياً بسبب الاستغلال الأمثل يمزج قبل الكاشف، في جزء صغير من التكلفة. لتمكين المستخدم من الاستفادة من الطابع المرن لمنهاج تطبيقات واسعة الحراجية، حددنا مجموعة متنوعة من جوانب المنهاج التي يمكن ضبطها والأمثل اعتماداً على الموارد المتاحة ونتائج تعبير البروتين المرجوة.

وقد قدمنا على أساس سونيكيشن كولاي استخراج إعداد البروتوكول التي يمكن إنجازها على مدى أربعة أيام، مع الرقم 1 يدل انهيار الإجرائية أكثر من كل يوم. وهناك قابلية تطويع للخطوات التي يمكن أن تنجز في كل يوم مع مختلف نقاط التوقف، ولكن وجدنا سير العمل هذا لتكو...

Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

الإشريكيّة القولونية-"على أساس تخليق البروتين" الخلية الحرة: البروتوكولات لتكنولوجيا منصة قوية ومرنة، وموجودا

هذا البروتوكول بالتفصيل الخطوات، والتكاليف، والمعدات اللازمة لتوليد كولاي-على أساس مقتطفات الخلية وتنفذ في المختبر البروتين التوليف التفاعلات في غضون 4 أيام أو أقل. للاستفادة من الطابع المرن لهذا النظام الأساسي للتطبيقات الواسعة، ونحن نناقش رد فعل الظروف التي يمكن تكييفها والأمثل.

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

هذا البروتوكول يبسط ويوضح أساليب تنفيذ الذاتي إعادة البروتين التوليف من قبل غير الخبراء. وسيساعد الوصول المحسّن إلى هذه الأساليب على إلغاء تسويق المنصة ومجموعة التطبيقات الواسعة التي تتيحها. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي السرعة، والفعالية من حيث التكلفة، وسهولة التفاعل التي أنشئت مقارنة مع غيرها من منصات تخليق البروتين إعادة الذاتي.يمكن لمنصة لدينا تمكين عدد من التطبيقات بما في ذلك علم الجينوم الوظيفي، hythopertesting، أجهزة الاستشعار الحيوي، ومجموعات تعليمية، ومع تعديلات طفيفة، والهندسة الأيضية والتوسع في الشفرة الوراثية. في حين أن هذه التقنية تتطلب فقط التدريب المختبري الأساسي، يجب أن يخطط المستخدمون الجدد للتعرف على تقنيات مثل سونيكيشن للتنفيذ الناجح للبروتوكول. لبدء هذا الإجراء إعداد كافة الوسائط والخلايا e.coli الثقافة كما هو موضح في بروتوكول النص.ضع زجاجة طرد مركزي لتر واحد في حمام ماء جليدي. مرة واحدة في الثقافات OD600 تصل إلى 3.0، صب ثقافة الخلية في زجاجة مبردة. باستخدام توازن شعاع مزدوج، إضافة المياه إلى ثانية واحدة لتر الطرد المركزي زجاجة حتى يزن نفس الأولى لخلق التوازن للطرد المركزي.بعد ما قبل التبريد الطرد المركزي إلى أربع درجات مئوية، الطرد المركزي الزجاجات في 5، 000 غرام وعند 10 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ل بيليه الخلايا. بعد هذا، صب ببطء قبالة والتخلص من افرا. ضع بيليه الخلية على الجليد.باستخدام ملعقة معقمة كشط بيليه الخلية من زجاجة الطرد المركزي ونقلها إلى الباردة، 50 ملليلتر أنبوب مخروطي. إضافة 30 ملليلتر من المخزن المؤقت S30 الباردة تكمل مع اثنين من المليمولار DTT و resuspend بيليه من قبل دوامة في رشقات نارية قصيرة مع فترات الراحة على الجليد حتى يتم إعادة تعليق بيليه تماما مع عدم وجود قطع. بعد هذا، استخدام آخر 50 ملليمتر أنبوب مخروطية مليئة بالماء كتوازن للطرد المركزي العينة في 5، 000 غرام و 10 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.صب قبالة والتخلص من مُندفع. Resuspend بيليه مع 20 إلى 25 ملليلتر من المخزن المؤقت S30 الباردة. جهاز طرد مركزي في 5،000 غرام و 10 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.صب بها والتخلص من مُندفع. ثم، إضافة 30 ملليلتر من S30 العازلة وإعادة تعليق بيليه باستخدام دوامة كما هو موضح سابقا. حدد ثلاثة أنابيب مخروطية وزنها مسبقاً، باردة، 50 ملليلتر.باستخدام حشو ماصة المصلية مع ماصة معقمة، aliquot عشرة 10 ملليلتر من تعليق بيليه في كل أنبوب. أجهزة الطرد المركزي جميع الأنابيب باستخدام الأرصدة المناسبة حسب الحاجة في 5،000 غرام و 10 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد هذا، اسكبي واتخلص من المُنبتين الخارقين.مسح بعناية داخل كل أنبوب وقبعة مع الأنسجة النظيفة لإزالة العازلة الوصول، مع التأكد من تجنب لمس بيليه. باستخدام توازن تحليلي، reweigh الأنابيب والإبلاغ عن الوزن بيليه النهائي لكل أنبوب. للبدء، إضافة ملليلتر واحد من S30 الباردة العازلة مع 2 ملليمولار DTT لكل غرام واحد من كتلة الخلية إلى كل بيليه.استخدام دوامة لإعادة تعليق الكريات كما هو موضح سابقا. ثم نقل 1.4 ملليلتر من كل بيليه resuspended في منفصلة 1.5 ملليلتر Microcenter أنابيب. وضع أنبوب واحد في حمام الماء المثلج في منقار ووضع مسبار sonicator بحيث لا تلمس قيعان أو جانبي الأنبوب.سونيكات الأنبوب مع السعة تعيين في 50٪ لمدة 45 ثانية، تليها 59 ثانية من الراحة. التأكد من إغلاق وعكس الأنابيب خلال فترات الخروج. مباشرة بعد الانتهاء من سونيكيشن، إضافة 4.5 ميكرولترات من واحد دات مول في lysate.عكس أنبوب عدة مرات لخلط ومن ثم وضعه على الجليد. كرر هذه العملية، sonicating وإضافة DTT لكل أنبوب من الخلايا resuspended. أجهزة الطرد المركزي العينات في 18،000 ز و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.بعد هذا، ماصة كل مغرور في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر Microcentrifuge، وترك بعض supernatant وراء لضمان بيليه غير منزعج. خذ أنابيب المافق إلى منصة الهز من حاضنة واحتضان لهم في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة. هذا هو رد فعل الجريانة.ثم، الطرد المركزي العينات في 10،000 غرام و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة كل ناظر دون إزعاج بيليه نقلها إلى أنابيب جديدة. إنشاء العديد من 100 aliliter aliquots من استخراج للتخزين.أولا، ذوبان الحل A، الحل باء، قالب الحمض النووي، واستخراج BL21DE3، T7 RNA Polymerase، و aliquot من المياه الصف الجزيئية على الجليد. المقبل, تسمية الكمية اللازمة من أنابيب Microcentrifuge اللازمة لرد فعل CFPS. مزيج كل كاشف عن طريق الأنابيب أو دوامة، ثم إضافة الحل إلى أنبوب رد الفعل المسمى، والتأكد من عدم دوامة استخراج الخلية ولكن بدلا من ذلك عكس أنبوب لخلط.تأكد من أن التفاعل النهائي هو مختلطة بشكل جيد والجمع بين واحد 15 ميكروليتر حبة في الجزء السفلي من كل أنبوب. احتضان كل رد فعل دون اهتزاز في 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات، أو في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. للبدء، والحصول على 96 لوحة جيدا وتحميل 48 ميكرولترات من 0.05 الزرس الهيبس في 8 الحموضة في كل حاجة جيدة لتحديد كم.بعد ذلك، إزالة أنابيب التفاعل من الحاضنة. خلط كل رد فعل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ونقل اثنين microliters من كل رد فعل في الآبار التي تحتوي على HEPES. مزيج كل جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.بعد تحميل جميع ردود الفعل ومختلطة، تحميل لوحة في عداد الفلورا وقياس الفلورسنت نقطة نهاية SFGFP باستخدام موجة الإثارة طول 485 نانومتر وطول موجة الانبعاثات من 510 نانومتر. استخدم منحنى قياسي تم إنشاؤه مسبقًا لتحديد تركيز GFP فائقة المجلد من قراءة الفلورسنتات التي تم الحصول عليها. في هذه الدراسة، يتم التحقيق في إعداد استخراج E.coli المستندة إلى sonication.كريات الخلية واستخراج الخلية مستقرة في درجة مئوية 80 السلبية لمدة عام على الأقل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخراج الخلية الخضوع على الأقل خمس دورات تجميد ذوبان دون خسارة كبيرة في الإنتاجية. ويمكن أن تتنوع بعض الخطوات في إطار هذا البروتوكول دون الإضرار بالإنتاجية الإجمالية للنظام.وأبرزها، يمكن حصاد الخلايا ضمن نطاق 2.7 إلى 4.0 كثافة بصرية في 600 نانومتر دون تأثير كبير على إنتاجية استخراج الخلية. ومع ذلك ، فإن جودة الحمض النووي القالب هو مصدر للتباين من دفعة إلى دفعة يؤثر على الغلة الحجمية لرد فعل CFPS. يتم حل هذا عن طريق تنقية الحمض النووي عن طريق ميدي أو Maxiprep تليها خطوة إضافية لتنظيف الحمض النووي.كما تؤثر وعاء التفاعل على الغلة الحجمية لرد فعل CFPS. زيادة في مساحة السطح إلى نسبة حجم، يؤدي إلى زيادة الغلة الحجمية. لتحسين الغلة الحجمية من رد فعل CFPS والحد من الخلايا استخراج مجموعة إلى دفعة تقلب، ينبغي إجراء المعايرة المغنيسيوم لكل إعداد استخراج جديد.بالنسبة لمستخرجات الخلايا المكونة من 30 ملليغرام لكل ملليلتر من البروتين الكلي، فإن تركيز المغنيسيوم الأمثل وحجم استخراجه لتقليل استخدام الكاشف وتعظيم العائد الحجمي هو 10 ملليمولار وخمسة ميكرولترات على التوالي. من خلال تغيير مقياس التفاعل ، يمكن للمستخدمين متابعة طرق تتراوح بين فحص الإنتاجية العالية إلى تعبيرات أوسع نطاقًا للبروتين المستهدف. هذه التقنية توفر اثنين من المزايا الرئيسية، أولا أنه شاشات منتجات البروتين بسرعة أكبر، والثانية، فإنه يجمع من الصعب التعبير عن البروتينات.وتشمل الأمثلة البروتينات التي هي السامة للخلايا أو تتطلب ظروف المؤكدة لوظيفتها. كما هو الحال مع أي إجراء مختبري، ينبغي التعامل مع جميع الكواشف بحذر. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون أجهزة الطرد المركزي دائما متوازنة وينبغي استخدام حماية الأذن أثناء سونيكيشن.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Particles without a Box: Brush-first Synthesis of Photodegradable PEG Star Polymers under Ambient Conditions

الجسيمات دون مربع: التجميعي فرشاة والعشرين من Photodegradable PEG البوليمرات ستار في ظل الظروف المحيطة

Convenient methods for the rapid, parallel synthesis of diversely functionalized nanoparticles will enable discovery of novel formulations for drug ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

أطر توليف وتوصيف بين functionalized المعدنية العضوية

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis of Poly(N-isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Synthesis of PolyN-isopropylacrylamide Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

توليف بولي (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) يانوس Microhydrogels لمتباين الخواص الحرارية الاستجابة وأليف العضو / ماء جاري تحميل القدرة

Janus microparticles are compartmentalized particles with differing molecular structures and/or functionality on each of their two sides. Because of this ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

توليف وتوصيف المواد الغروية Supramolecular

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

تخليق البروتين Bioconjugates<em&gt; عبر</em&gt; سيستين-maleimide الكيمياء

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

NMR الطيفي كأداة قوية لتقييم السريع من الدهون الملف من السمك ملاحق النفط

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

توليف لشل الأساسية لانثانيدات يخدر نانوكريستالس Upconversion لتطبيقات الهاتف الخلوي

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

Chemical Synthesis of Porous Barium Titanate Thin Film and Thermal Stabilization of Ferroelectric Phase by Porosity-Induced Strain

التوليف الكيميائي الفيلم رقيقة تيتانات باريوم المسامية والاستقرار الحراري للمرحلة فيرويليكتريك من الإجهاد الناجم عن المسامية

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

توليف لكتلة الإنشاء ثيول لبلورة إطار جيرويدال معدن الكبريت انتشارية

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

إعداد Poly(pentafluorophenyl acrylate) فونكتيوناليزيد SiO2 حبات "تنقية البروتين"

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...