Name: escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology
Uploaded: 2019-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Auteurs wil erkennen van Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher, en Tony Turretto voor technische ondersteuning, Wesley Kao, Layne Williams en Christopher Hight voor nuttige discussies. Auteurs erkennen ook financiering van de steun van de Bill en Linda Frost Fonds, Center for Applications in biotechnologie van Chevron biotechnologie toegepast onderzoek Endowment Grant, Cal Poly onderzoek Scholarly en creatieve activiteiten Grant programma (RSCA 2017), en de National Science Foundation (NSF-1708919). MZL erkent de California State University Graduate Grant. MCJ erkent het leger onderzoek Office W911NF-16-1-0372, verleent National Science Foundation MCB-1413563 en MCB-1716766, de Air Force Research Laboratorium Center van Excellence Grant FA8650-15-2-5518, de Defense bedreiging vermindering Agentschap subsidie HDTRA1-15-10052/P00001, de David en Lucile Packard Foundation, het programma van de leraar-Scholar Camille Dreyfus, het departement van energie BER Grant DE-SC0018249, de menselijke grenzen Science Program (RGP0015/2017), de DAMHINDE gezamenlijk genoom Instituut ETOP Grant, en het Chicago biomedische Consortium met steun uit de fondsen Searle op de Chicago Gemeenschap Trust voor steun.

1. Media voorbereiding en celgroei
<ol><li>
Dag 1
	<ol>
<li>Streak E. coli BL21*(DE3) cellen uit een glycerol voorraad op een bord van de agar LB en incubeer gedurende ten minste 18 uur bij 37 ° C.</li>
		<li>50 mL van LB-media en autoclaaf de oplossing voor te bereiden op een vloeibare cyclus gedurende 30 minuten bij 121 ° C. Bewaren bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dag 2
	<ol>
<li>750 mL 2 x YTP media en 250 mL 0,4 M D-Glucose-oplossing te bereiden zoals besch...

Cel-vrije eiwitsynthese heeft ontpopt als een krachtige en activerende technologie voor een verscheidenheid van toepassingen variërend van biomanufacturing tot rapid prototyping van biochemische systemen. De breedte van de toepassingen wordt ondersteund door de capaciteit te controleren, manipuleren, en vergroten van cellulaire machines in real-time. Ondanks de groeiende impact van deze platformtechnologie, brede aanpassing gebleven traag als gevolg van technische nuances bij de uitvoering van de methoden. Door middel v...

Cel-vrij proteïne synthese (GVB) heeft ontpopt als een technologie die heeft een aantal nieuwe mogelijkheden voor de productie van eiwitten, functionele genomica, Metabole engineering en meer in de laatste 50 jaar1,2ontgrendeld. In vergelijking met standaard in vivo eiwit expressie platformen, GVB biedt drie belangrijke voordelen: 1) de cel-vrije aard van het platform mogelijk maakt de productie van eiwitten dat zou potentieel giftige of vreemd aan de cel3,4 ,5,6; 2) inactivatie van genomic DNA en de invoering van een sjabloon DNA codering van de gene(s) van belang kanaal alle systemische energie binnen de reactie op de productie van de expressie gebrachte eiwitten van belang; en 3) het open karakter van het platform kan de gebruiker wijzigen en controleren van de omstandigheden en de samenstelling in real-time7,8. Deze directe toegang tot de reactie ondersteunt de vergroting van biologische systemen met uitgebreide oplossingen en redox voorwaarden voor de productie van nieuwe eiwitten en de afstemming van metabole processen2,9, 10. directe toegang maakt het ook mogelijk de gebruiker aan het combineren van de GVB-reactie met activiteit testen in een één-pot-systeem voor een snellere design-build-test cycli11. De capaciteit om te voeren van de GVB-reactie in klein volume druppels of op papier gebaseerde apparaten verder ondersteunt high-throughput ontdekking inspanningen en snelle prototyping12,13,14,15 ,16. Als gevolg van deze voordelen en de plug en play-aard van het systeem, GVB uniek heeft een scala aan biotechnologische toepassingen zoals de productie van eiwitten die moeilijk te solubly snel in vivo17, 18,19,20, opsporing van ziekte21,22,23, op vraag biomanufacturing18,24 ,25,26,27, en onderwijs28,29, die allemaal Toon de flexibiliteit en bruikbaarheid van de cel-vrije platform.
GVB systemen kunnen worden gegenereerd uit een verscheidenheid van ruwe lysates van beide cellijnen prokaryote en eukaryote. Dit zorgt voor diverse opties in het systeem van keuze, die elk voor- en nadelen, afhankelijk van de toepassing van belang zijn. GVB systemen ook variëren sterk in voorbereidingstijd, kosten en productiviteit. De meeste vaak gebruikt cel extracten worden geproduceerd van tarwekiemen, konijn Retikulocyt, insect cellen en Escherichia coli cellen, met de laatste is de meest kosteneffectieve tot nu toe terwijl de productie van de hoogste volumetrische opbrengst van eiwit30 . Terwijl andere systemen GVB kunnen nuttig zijn voor hun aangeboren posttranslationele wijziging-machinery, opkomende toepassingen met behulp van de E. coli-gebaseerde machines zijn in staat de kloof te overbruggen door het genereren van site-specifically gefosforyleerd en geglycosyleerde eiwitten op vraag31,32,33,34,35.
GVB reacties kunnen worden uitgevoerd in een batch, continu-uitwisseling cel-vrij (CECF) of continue-stroom cel-vrij (CFCF) formaten. De batch-indeling is een gesloten systeem waarvan reactie levensduur beperkt als gevolg van de afnemende hoeveelheid reactanten en de accumulatie van remmende bijproduct van de reactie is. CECF en CFCF methoden verhogen de levensduur van de reactie, en daardoor leiden tot verhoogde volumetrische eiwit rendementen ten opzichte van de batch-reactie. Dit wordt bereikt doordat de bijproducten van de eiwitsynthese te worden verwijderd uit het reactievat, terwijl nieuwe reactanten worden geleverd in de loop van de reactie2. In het geval van CFCF, kan de proteïne van belang ook worden verwijderd uit de zaal reactie, terwijl in de CECF, de proteïne van belang blijft in de zaal van de reactie van een semi-permeabel membraan36,37samengesteld. Deze methoden zijn vooral waardevol zijn bij het overwinnen van arme volumetrische opbrengst van moeilijk-aan-express proteïnen van belang38,39,40,41,42, 43. De uitdagingen bij de uitvoering van de CECF en CFCF benaderingen zijn dat 1) terwijl ze leiden een efficiënter gebruik van de bio-machine verantwoordelijk voor transcriptie en vertaling tot, zij vereisen met name grotere hoeveelheden van reagentia die een toename van de totale kosten en 2) ze vereisen meer complexe reactie opstellingen en gespecialiseerde apparatuur ten opzichte van de batch formaat44. Met het oog op toegankelijkheid voor nieuwe gebruikers, beschreven de protocollen hierin focus op het formaat van de partij bij reactie volumes van 15 µL met specifieke aanbevelingen voor het verhogen van het volume van de reactie op de schaal van de milliliter.
De hier vermelde methoden niet-deskundigen met basic Labor vaardigheden (zoals studenten) inschakelen voor de uitvoering van de celgroei, uitpakken van de voorbereiding en batch formaat reactie setup voor een e-coli-gebaseerde systeem van het GVB. Deze aanpak is rendabel commercieel beschikbare kits t.o.v. zonder in te boeten op het gemak van kit gebaseerde reactie setup. Deze aanpak maakt bovendien toepassingen in het laboratorium en in het veld. Bij de beslissing om de implementatie van GVB, moeten nieuwe gebruikers grondig evalueren de werkzaamheid van conventionele eiwit expressiesystemen voor opstarten investeringen, zoals GVB niet kan superieur in ieder geval. De hier beschreven methoden voor het GVB zodat de gebruiker direct om een verscheidenheid van toepassingen, met inbegrip van functionele genomica, high-throughput testen, de productie van eiwitten die hardnekkige voor in vivo expressie, evenals veld zijn toepassingen met inbegrip van biosensoren en educatieve kits voor synthetische biologie. Extra toepassingen zoals Metabole engineering, afstemming van eiwit expressie voorwaarden, opsporing van de ziekte, en schaal-up met behulp van CECF of CFCF methoden zijn nog steeds mogelijk, maar wellicht ervaring met het GVB-platform voor de verdere wijziging van de reactie voorwaarden. Onze methoden combineren groei in de verrijkte media en verbijsterd kolven, met relatief snelle en reproduceerbare methoden van lysis van de cel via ultrasoonapparaat, gevolgd door een vereenvoudigde GVB reactie setup dat gebruik maakt van geoptimaliseerde premixen45. Terwijl de cellulaire groei methoden hebben enigszins worden gestandaardiseerd op dit gebied, lopen methoden voor lysis van de cel sterk uiteen. Naast ultrasoonapparaat omvatten gemeenschappelijke lysis methodes gebruik van een Franse pers, een homogenizer, kraal drijvers, of lysozym en andere verstoring van de biochemische en fysische methoden46,47,48, 49. met behulp van onze methoden ongeveer 2 mL van ruwe cel extract worden verkregen per 1 liter van cellen. Deze hoeveelheid cel extract kan steunen vier honderd 15 µL GVB reacties, elke producerende ~ 900 µg/mL verslaggever sfGFP eiwit uit de sjabloon plasmide pJL1-sfGFP. Deze methode kost $0.021/µg sfGFP geproduceerd ($.019/µL van reactie), exclusief de kosten van arbeid en uitrusting (aanvullende figuur 1). Vanaf de nul, deze methode toegepast kunnen worden in 4 dagen door een enkele persoon en herhaal GVB reacties kunnen worden voltooid binnen uur (Figuur 1). Bovendien kan het protocol worden opgeschaald in volume voor grotere partijen reagens voorbereiding aan de behoeften van de gebruiker. Nog belangrijker is, kan het protocol gepresenteerd hier toegepast worden door laboratorium opgeleid niet-deskundigen zoals Voorgraadse studente, zoals zij alleen basic Labor vaardigheden vereist. De hieronder beschreven procedures, en de begeleidende video zijn specifiek ontwikkeld ter verbetering van de toegankelijkheid van de E. coli GVB platform voor breed gebruik.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">12795027</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60353-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P9791-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">KOH</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IPTG</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(OAc)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tris(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DTT</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">tRNA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Folinic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NTPs</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Oxalic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NAD</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CoA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PEP</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NH4(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">02180595.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(Glu)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Spermidine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Molecular Grade Water</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Aspartic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Valine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Alanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Arginine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Asparagine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Glycine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Histadine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Proline</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Serine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tyrosine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ultrasonic Processor</td>
			<td style="width:145px;">QSonica</td>
			<td style="width:123px;">Q125-230V/50Hz</td>
			<td>3.175 mm diameter probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1L Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microfuge 20</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cytation 5</td>
			<td style="width:145px;">BioTek</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Strep-Tactin XT Starter Kit</td>
			<td style="width:145px;">IBA</td>
			<td style="width:123px;">2-4998-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">pJL1-sfGFP</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:145px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

In de afgelopen 50 jaar, heeft cel-vrij proteïne synthese (GVB) ontpopt als een krachtige technologie om uit te rusten van de transcriptionele en translationele capaciteit van cellen in een reageerbuis. Door het wegnemen van de noodzaak om de levensvatbaarheid van de cel, en door het wegnemen van de cellulaire barrière, is GVB fundamenteel aan opkomende toepassingen in de biomanufacturing van oudsher uitdagende eiwitten, evenals toepassingen, in snelle prototyping voor Metabole engineering en functionele genomica. Onze methoden voor de uitvoering van een e-coli-gebaseerde GVB platform dat nieuwe gebruikers toegang tot veel van deze toepassingen. We beschrijven hier, methoden om te bereiden extract door middel van verrijkte media, verbijsterd kolven en een reproduceerbare methode van afstembare ultrasoonapparaat gebaseerde cellysis. Dit extract kan vervolgens worden gebruikt voor eiwit expressie geschikt voor het produceren van 900 µg/mL of meer van de super map groen fluorescent proteïne (sfGFP) in enkel 5 h van experimentele opstelling van data-analyse, gezien het feit dat geschikt reagens voorraden zijn vooraf opgesteld. De kosten van de geschatte opstarten voor het verkrijgen van reagentia is $4,500 die duizenden reacties op een geraamde kostprijs van $0.021 per µg eiwit geproduceerd of $0.019 per µL van reactie zal ondersteunen. De eiwit expressie methoden spiegel daarnaast het gemak van de setup van de reactie in de verkrijgbare systemen als gevolg van optimalisatie van reagens voormengsels, tegen een fractie van de kosten gezien. Zodat de gebruiker om de invloed van de flexibele aard van het GVB platform voor brede toepassingen, hebben we geconstateerd dat een aantal aspecten van het platform dat kan worden afgestemd en geoptimaliseerd afhankelijk van de beschikbare middelen en de eiwit expressie resultaten gewenste.

Wij hebben voorgesteld een ultrasoonapparaat gebaseerde E. coli extract voorbereiding protocol die met cijfer 1 demonstreren de procedurele verdeling over elke dag gedurende een vier-daagse span, kan worden voltooid. Er is buigbaarheid naar de stappen die in elke dag met diverse onderbreken punten kan worden voltooid, maar we hebben gevonden deze werkstroom het meest effectief uit te voeren. Bovendien zijn zowel de cel pellets (stap 1.3.18) en volled...

Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-cel-Free eiwitsynthese gebaseerd: protocollen voor een robuuste, flexibele en toegankelijk platformtechnologie

Dit protocol detailleert de stappen, kosten, en apparatuur die nodig is voor het genereren van E. coli-op basis van cel extracten en uit te voeren in vitro eiwit synthese reacties binnen 4 dagen of minder. Om de invloed van de flexibele aard van dit platform voor brede toepassingen, bespreken we reactie voorwaarden die kunnen worden aangepast en geoptimaliseerd.

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Dit protocol vereenvoudigt en verduidelijkt de methoden voor de implementatie van zelfhereiïteïnesynthese door niet-deskundigen. Verbeterde toegang tot deze methoden zal helpen bij het ontmarkten van het platform en de brede set van toepassingen die het mogelijk maakt. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de snelheid, kosteneffectiviteit, en het gemak van reactie opgezet in vergelijking met andere zelf re-eiwit synthese platforms.Ons platform kan een aantal toepassingen mogelijk maken, waaronder functionele genomics, hythopertesting, biosensoren, educatieve kits, en met kleine wijzigingen, metabole manipulatie en genetische code uitbreiding. Hoewel deze techniek alleen basistraining voor laboratorium vereist, moeten nieuwe gebruikers van plan zijn om vertrouwd te raken met technieken zoals sonicatie voor een succesvolle uitvoering van het protocol. Om te beginnen met deze procedure voor te bereiden alle media en cultuur E.coli cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.Plaats een een liter centrifuge fles in een ijswaterbad. Zodra de culturen OD600 bereikt 3.0, giet de cel cultuur in de gekoelde fles. Met behulp van een dubbele bundel balans, voeg water toe aan een tweede een liter centrifuge fles totdat het weegt hetzelfde als de eerste om een evenwicht voor de centrifuge te creëren.Na het voorkoelen van de centrifuge tot vier graden Celsius, centrifugeren de flessen op 5,000 g en op 10 graden Celsius gedurende 10 minuten om de cellen pellet. Giet hierna langzaam af en gooi de supernatant weg. Plaats de celkorrel op ijs.Met behulp van een steriele spatel schraap de celpellet uit de centrifugefles en breng deze over naar een koude, 50 milliliter conische buis. Voeg 30 milliliter koude S30 buffer aangevuld met twee millimolar DTT en resuspend de pellet door vortexing in korte uitbarstingen met rustperioden op ijs totdat de pellet volledig is opnieuw opgebouwd met geen brokken. Gebruik hierna nog een conische buis van 50 millimeter gevuld met water als balans om het monster gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 5, 000 g en 10 graden Celsius.Giet af en gooi de supernatant weg. Resuspend de pellet met 20 tot 25 milliliter koude S30 buffer. Centrifuge op 5.000 g en bij 10 graden Celsius gedurende 10 minuten.Giet uit en gooi de supernatant weg. Voeg vervolgens 30 milliliter S30-buffer toe en versef de pellet met behulp van een vortex zoals eerder beschreven. Zet drie voorgewogen, koude, 50 milliliter conische buizen.Met behulp van een serologische pipetvuller met een steriele pipet, aliquot tien 10 milliliter pellet suspensie in elke buis. Centrifugeren alle buizen met behulp van de juiste saldi als dat nodig is op 5, 000 g en 10 graden Celsius gedurende 10 minuten. Giet hierna uit en gooi de supernatants weg.Veeg voorzichtig de binnenkant van elke buis en dop met een schoon weefsel om de toegangsbuffer te verwijderen, terwijl u ervoor zorgt dat u de pellet niet aanraakt. Met behulp van een analytische balans, herwegen de buizen en het verslag van de uiteindelijke pellet gewicht voor elke buis. Om te beginnen, voeg een milliliter koude S30 buffer met 2 millimolar DTT per een gram celmassa aan elke pellet.Gebruik een vortex om de pellets opnieuw op te lichten zoals eerder beschreven. Breng vervolgens 1,4 milliliter van elke geresuspended pellet over in afzonderlijke 1,5 milliliter Microcentrifugebuizen. Plaats een buis in een ijswaterbad in een beker en plaats de sonicator sonde zodanig dat het niet de bodem of zijkanten van de buis raken.Soniceer de buis met de amplitude set op 50%gedurende 45 seconden, gevolgd door 59 seconden rust. Zorg ervoor dat de buizen te sluiten en omkeren tijdens de uitperiodes. Direct na de sonicatie, voeg 4,5 microliter van een molaire DTT in het lysaat.Keer de buis meerdere malen om te mengen en plaats het vervolgens op ijs. Herhaal dit proces, sonicating en het toevoegen van DTT voor elke buis van geresuspended cellen. Centrifugeren de monsters op 18, 000 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Na deze, pipette elk supernatant in een nieuwe 1,5 milliliter Microcentrifuge buis, waardoor sommige supernatant achter om ervoor te zorgen de pellet niet wordt verstoord. Neem de buizen van supernatant naar het schudden platform van een incubator en incubeer ze op 37 graden Celsius met schudden op 250 RPM gedurende 60 minuten. Dit is de reactie.Vervolgens centrifugeren de monsters op 10,000 g en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder elke supernatant zonder verstoring van de pellet overbrengen ze naar nieuwe buizen. Maak veel 100 microliter aliquots van het extract voor opslag.Ten eerste dooioplossing A, oplossing B, de DNA-sjabloon, het BL21DE3-extract, T7 RNA Polymerase en een aliquot van moleculair water op ijs. Label vervolgens de benodigde hoeveelheid microcentrifugebuizen die nodig zijn voor de CFPS-reactie. Meng elk reagens door pipetting of vortexing, voeg dan de oplossing aan de gelabelde reactiebuis, zorg ervoor dat niet vortex de cel extract, maar in plaats daarvan omkeren de buis te mengen.Zorg ervoor dat de uiteindelijke reactie goed wordt gemengd en combineer tot een enkele 15 microliter kraal aan de onderkant van elke buis. Broed elke reactie zonder te schudden op 37 graden Celsius voor vier uur, of op 30 graden Celsius 's nachts. Om te beginnen, het verkrijgen van een 96 put plaat en belasting 48 microliters van 0,05 molaire HEPES op pH 8 in elk goed nodig voor kwantificering.Verwijder vervolgens de reactiebuizen uit de couveuse. Meng elke reactie door pipetting op en neer en breng twee microliters van elke reactie in de putten met HEPES. Meng elk goed door pipetting op en neer.Nadat alle reacties zijn geladen en gemengd, laadt u de plaat in een fluorometer en meet u de SFGFP-eindpuntfluorescerende tl met behulp van een excitatiegolflengte van 485 nanometer en een emissiegolflengte van 510 nanometer. Gebruik een eerder gegenereerde standaardcurve om de concentratie van superfoldered GFP te bepalen uit de verkregen fluorescerende metingen. In deze studie wordt een op sonicatie gebaseerd e.coli extractpreparaat onderzocht.Celpellets en celextract zijn stabiel bij negatieve 80 graden Celsius gedurende ten minste een jaar. Bovendien kan het celextract ten minste vijf vriesdooicycli ondergaan zonder een aanzienlijk verlies van productiviteit. Sommige stappen binnen dit protocol kunnen worden gevarieerd zonder afbreuk te doen aan de algehele productiviteit van het systeem.Het meest in het bijzonder kunnen cellen worden geoogst binnen het bereik van 2,7 tot 4,0 optische dichtheid op 600 nanometer zonder een significant effect op de productiviteit van het celextract. De kwaliteit van sjabloon-DNA is echter een bron van batch-to-batch variabiliteit die van invloed is op de volumetrische opbrengsten van de CFPS-reactie. Dit wordt opgelost door het DNA te zuiveren via een Midi of Maxiprep gevolgd door een extra DNA-opruimingsstap.Het reactievat heeft ook invloed op de volumetrische opbrengsten van de CFPS-reactie. Een toename van oppervlakte-volumeverhouding resulteert in hogere volumetrische opbrengsten. Om de volumetrische opbrengsten van de CFPS-reactie te optimaliseren en de variabiliteit van het celextract batch-to-batch te verminderen, moet voor elk nieuw extractpreparaat een magnesiumtitritie worden uitgevoerd.Voor celextracten bestaande uit 30 milligram per milliliter totaal eiwit, is de optimale magnesiumconcentratie en het extractvolume om het gebruik van reagens te minimaliseren en de volumetrische opbrengst te maximaliseren respectievelijk 10 millimolar en vijf microliter. Door de reactieschaal te variëren, kunnen gebruikers methoden nastreven variërend van hoge doorvoerscreening tot grootschaligere expressies van een doeleiwit. Deze techniek biedt twee belangrijke voordelen, ten eerste het schermen eiwitproducten sneller, en ten tweede, het synthetiseert moeilijk om eiwitten uit te drukken.Voorbeelden hiervan zijn eiwitten die cytotoxisch zijn of oxiderende omstandigheden vereisen voor hun functie. Zoals bij elke laboratoriumprocedure moeten alle reagentia met de nodige voorzichtigheid worden behandeld. Bovendien moeten centrifuges altijd in balans zijn en moet oorbescherming worden gebruikt tijdens de sonicatie.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Particles without a Box: Brush-first Synthesis of Photodegradable PEG Star Polymers under Ambient Conditions

Deeltjes zonder een doos: Brush-eerste Synthese van afbreekbaar PEG sterpolymeren onder omgevingsomstandigheden

Convenient methods for the rapid, parallel synthesis of diversely functionalized nanoparticles will enable discovery of novel formulations for drug ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Synthese en karakterisering van gefunctionaliseerde metaal-organische roosters

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis of Poly(N-isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Synthesis of PolyN-isopropylacrylamide Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Synthese van poly (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels voor Anisotropisch Thermo-responsiviteit en Organofiele / Hydrofiel Loading Capability

Janus microparticles are compartmentalized particles with differing molecular structures and/or functionality on each of their two sides. Because of this ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Synthese en karakterisering van Supramoleculaire colloïden

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Eiwitsynthese Bioconjugaten<em&gt; via</em&gt; Cysteïne-maleïmide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

NMR-spectroscopie als een robuust hulpmiddel voor de snelle evaluatie van het lipidenprofiel van visolie supplementen

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Synthese van de Core-shell Lanthanide-doped Upconversion nanokristallen voor mobiele toepassingen

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

Chemical Synthesis of Porous Barium Titanate Thin Film and Thermal Stabilization of Ferroelectric Phase by Porosity-Induced Strain

Chemische synthese van poreuze Barium Titanate dunne Film en thermische stabilisatie van ferroelektrische fase door porositeit-geïnduceerde stam

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

Synthese van een Thiol bouwsteen voor de kristallisatie van een halfgeleidende Gyroidal metaal-zwavel-kader

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Voorbereiding van Poly(pentafluorophenyl acrylate) matiemaatschappij SiO2 parels eiwitreiniging

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...