Name: escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology
Uploaded: 2019-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Auteurs tient à remercier Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher et Tony Turretto pour le support technique, Wesley Kao, Layne Williams et Christopher Hight pour discussions utiles. Auteurs reconnaissent également de financement du projet de loi et Linda Frost fonds, centre pour les Applications de la biotechnologie Chevron biotechnologie appliquée recherche subvention de dotation, Cal Poly recherche, savantes, et programme de subvention des activités créatives (RSCA 2017), et la National Science Foundation (NSF-1708919). MZL reconnaît les subventions supérieures de l’Université California état. MCJ reconnaît l’Army Research Office W911NF-16-1-0372, National Science Foundation accorde MCB-1413563 et MCB-1716766, l’armée de l’Air recherche laboratoire centre d’Excellence Grant FA8650-15-2-5518, la subvention de l’agence défense menace la réduction HDTRA1-15-10052/P00001, la David and Lucile Packard Foundation, le programme d’enseignant-chercheur de Camille Dreyfus, le ministère de l’énergie BER Grant DE-SC0018249, le programme de sciences humaines de frontières (RGP0015/2017), la subvention ETOP DOE Joint Genome Institute, et le Consortium biomédicale de Chicago avec prise en charge par les fonds de Searle à la Chicago Community Trust pour la prise en charge.

1. médias préparation et croissance cellulaire
<ol><li>
Jour 1
	<ol>
<li>Cellules d’Escherichia coli BL21*(DE3) Streak d’un glycérol stock sur une gélose LB et incuber pendant au moins 18 h à 37 ° C.</li>
		<li>Préparer 50 mL de médias LB et stériliser la solution sur un cycle de liquid pendant 30 minutes à 121 ° C. Conserver à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Jour 2
	<ol>
<li>Préparer 750 mL de 2 x YTP médias et 250 mL de 0,4 M de D-Glucose sol...

La synthèse protéique acellulaire est devenue une technologie puissante et propice pour une variété d’applications allant de la biofabrication de prototypage rapide de systèmes biochimiques. L’ampleur des demandes est pris en charge par la capacité à contrôler, manipuler et d’augmenter la machinerie cellulaire en temps réel. En dépit de l’impact grandissant de cette technologie de plate-forme, adaptation large est restée lente en raison des nuances techniques dans la mise en œuvre des méthodes. Grâc...

Synthèse de protéine acellulaire (CFPS) a émergé comme une technologie qui a débloqué un certain nombre de nouvelles opportunités pour la production de protéines, génomique fonctionnelle, génie métabolique et plus encore dans les derniers 50 ans1,2. Par rapport à la norme en vivo plates-formes expression de protéine, CFPS offre trois avantages principaux : 1) la nature acellulaire de la plate-forme permet la production de protéines qui seraient potentiellement toxiques ou étrangers à la cellule3,4 ,5,6; 2) inactivation de l’ADN génomique et la mise en place d’un modèle d’ADN codant le gène d’intérêt canaliser toute l’énergie systémique au sein de la réaction à la production des ou des protéines d’intérêt ; et 3) la nature ouverte de la plate-forme permet à l’utilisateur de modifier et de surveiller les conditions de la réaction et la composition en temps réel7,8. Cet accès direct à la réaction prend en charge l’augmentation des systèmes biologiques avec des chimies élargis et conditions redox pour la production de nouvelles protéines et l’accordage des processus métaboliques2,9, 10. direct access permet également l’utilisateur de combiner la réaction de PFC avec tests d’activité dans un système single-pot des cycles de conception-construction-test plus rapide11. La capacité à effectuer la réaction de PFC dans les gouttelettes de faible volume ou sur appareils sur papier plus soutient les efforts de découverte de haut débit et de prototypage rapide12,13,14,15 ,,16. À la suite de ces avantages et de la nature de plug-and-play du système, CFPS unique a permis à une variété d’applications de biotechnologie telles que la production de protéines qui sont difficilement soluble express en vivo17, 18,19,20, détection des maladies21,22,23, sur demande la biofabrication18,24 ,25,26,27et l’éducation28,29, qui montrent la flexibilité et l’utilité de la plate-forme acellulaire.
Systèmes de PFC peuvent provenir d’une variété de lysats bruts de deux lignées de cellules procaryotes et eucaryotes. Cela permet diverses options dans le système de choix, chacun d'entre eux ont des avantages et inconvénients selon l’application des intérêts. Systèmes de CFPS varient également considérablement en productivité, coût et temps de préparation. Le plus couramment utilisé cellule extraits sont produites à partir de germe de blé, réticulocytes de lapin, des cellules d’insecte et cellules d’Escherichia coli , cette dernière étant la plus efficace à ce jour tout en produisant le meilleur rendement volumétrique de la protéine30 . Alors que les autres systèmes de PFC peuvent être avantageux pour leurs machines de modification post-traductionnelle innée, nouvelles applications à l’aide de l' e. coli-machines basé sont en mesure de combler le fossé en générant relativement phosphorylée et protéines glycosylées sur demande31,32,33,34,35.
Réactions de PFC peuvent être exécutées dans chaque lot, échange continu acellulaire (CECF) ou acellulaire (CFCF) formats de flux continu. Le format de lot est un système fermé, dont vie de réaction est limitée en raison de la diminution des quantités de réactifs et l’accumulation des sous-produits inhibiteurs de la réaction. Méthodes CECF et CFCF augmentent la durée de vie de la réaction et ainsi entraînent des rendements de protéine volumétrique accrue par rapport à la réaction de lot. Ceci est accompli en autorisant les sous-produits de la synthèse protéique à être retiré de la cuve de réaction alors que nouveaux réactifs sont fournis tout au long de la réaction2. Dans le cas de la CFCF, la protéine d’intérêt peut également être retirée de la chambre de réaction, tandis que dans la CECF, la protéine d’intérêt demeure dans la chambre de réaction, composé d’une membrane semi-perméable36,37. Ces méthodes sont particulièrement utiles pour surmonter les piètres rendements volumétriques de difficile-à-express des protéines d’intérêt38,39,40,41,42, 43. Les difficultés à mettre en œuvre les approches CECF et CFCF sont que 1) alors qu’ils se traduire par une utilisation plus efficace des machines bio responsable de la transcription et la traduction, ils exigent notamment de plus grandes quantités de réactifs, ce qui augmente le coût global et 2) ils nécessitent des configurations plus complexes de réaction et d’équipements spécialisés par rapport à la lot format44. Afin d’assurer l’accessibilité pour les nouveaux utilisateurs, les protocoles décrits se concentrer sur le format de traitement par lots à des volumes de réaction de 15 µL avec des recommandations précises pour augmenter le volume de réaction à l’échelle de millilitre.
Les méthodes présentées ici permettent profanes avec des compétences de laboratoire de base (telles que les étudiants de premier cycle) à mettre en œuvre la croissance cellulaire, extrait préparation et format réaction configuration de lot pour un e. coli-système de PFC. Cette approche est rentable par rapport aux kits disponibles dans le commerce sans sacrifier la facilité d’installation basé sur kit de réaction. En outre, cette approche permet aux applications en laboratoire et sur le terrain. Lorsque vous décidez de mettre en œuvre des produits forestiers certifiés, nouveaux utilisateurs devraient évaluer soigneusement l’efficacité des systèmes d’expression de protéine conventionnelle pour l’investissement de démarrage, comme le PFC n’est peut-être pas supérieure dans tous les cas. Les méthodes CFPS décrites ici permettent à l’utilisateur d’appliquer directement une variété d’applications, y compris la génomique fonctionnelle, haut débit stable, la production de protéines qui sont insolubles pour in vivo de l’expression, mais aussi de champ applications, y compris les biocapteurs et trousses pédagogiques pour la biologie synthétique. Des applications supplémentaires, tels que l’ingénierie métabolique, tuning des conditions d’expression de protéine, détection de la maladie et mesurent-vers le haut à l’aide des méthodes CECF ou CFCF sont toujours possibles mais peuvent exiger l’expérience avec la plateforme PFC pour une modification supplémentaire de la réaction conditions. Nos méthodes de conjuguer croissance en milieux enrichis et flacons déroutés, et des méthodes relativement rapides et reproductibles de la lyse cellulaire par le biais de la sonication, suivie d’une configuration de réaction CFPS simplifiée qui utilise des prémélanges optimisé45. Même si les méthodes de croissance cellulaire ont devenu quelque peu normalisées dans ce domaine, procédés de lyse cellulaire varient considérablement. En plus de la sonication, les méthodes de lyse courantes sont utilisation d’une presse Français, un homogénéisateur, batteurs de perle, ou lysozyme et autres perturbations biochimiques et physiques méthodes46,47,48, 49. à l’aide de nos méthodes, environ 2 mL d’extrait cellulaire brut sont obtenus par 1 L de cellules. Cette quantité d’extrait cellulaire peut prendre en charge quatre cents réactions de CFPS 15 µL, chaque producteur ~ 900 µg/mL de protéine sfGFP journaliste du plasmide de modèle pJL1-sfGFP. Cette méthode coûte $ 0,021/µg de sfGFP produit ($.019/µL de réaction), à l’exclusion du coût du travail et des équipements (la Figure 1). À partir de l’éraflure, cette méthode peut être implémentée en 4 jours par une seule personne et répétez les réactions PFC peuvent être complétées en heures (Figure 1). En outre, le protocole peut être transposé en volume pour les plus gros lots de préparation du réactif aux besoins de l’utilisateur. Ce qui est important, le protocole présenté ici peut être implémenté par laboratoire formé profanes tels que les étudiants de premier cycle, comme elle exige seulement des compétences du laboratoire de base. Les procédures décrites ci-dessous et la vidéo qui l’accompagne ont été spécifiquement développés pour améliorer l’accessibilité de la plate-forme de PFC d’e. coli pour une utilisation large.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">12795027</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60353-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P9791-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">KOH</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IPTG</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(OAc)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tris(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DTT</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">tRNA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Folinic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NTPs</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Oxalic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NAD</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CoA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PEP</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NH4(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">02180595.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(Glu)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Spermidine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Molecular Grade Water</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Aspartic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Valine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Alanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Arginine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Asparagine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Glycine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Histadine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Proline</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Serine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tyrosine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ultrasonic Processor</td>
			<td style="width:145px;">QSonica</td>
			<td style="width:123px;">Q125-230V/50Hz</td>
			<td>3.175 mm diameter probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1L Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microfuge 20</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cytation 5</td>
			<td style="width:145px;">BioTek</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Strep-Tactin XT Starter Kit</td>
			<td style="width:145px;">IBA</td>
			<td style="width:123px;">2-4998-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">pJL1-sfGFP</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:145px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
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escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Au cours des 50 dernières années, la synthèse de protéine acellulaire (CFPS) est devenue une technologie puissante pour exploiter la capacité transcriptionnelle et translationnelle des cellules dans un tube à essai. En évitant la nécessité de maintenir la viabilité de la cellule et en éliminant la barrière cellulaire, PFC a été fondamentale aux applications émergentes en biofabrication de protéines traditionnellement difficiles, ainsi que des applications de prototypage rapide pour génie métabolique et la génomique fonctionnelle. Nos méthodes de mise en œuvre d’un e. coli-plateforme PFC permettre à nouveau aux utilisateurs d’accéder à bon nombre de ces applications. Nous décrivons ici les méthodes pour préparer l’extrait par l’utilisation de milieux enrichis, flacons déroutés et une méthode reproductible de la lyse cellulaire de base sonication accordable. Cet extrait peut ensuite servir pour l’expression de la protéine capable de produire 900 µg/mL ou plus de la protéine fluorescente de super dossier vert (sfGFP) dans seulement 5 h de montage expérimental à l’analyse des données, étant donné que les stocks de réactifs appropriés ont été préparés préalablement. Le coût estimatif de démarrage d’obtenir des réactifs est $ 4 500 qui soutiendront des milliers de réactions à un coût estimatif de 0,021 $ par µg de protéines produites ou 0,019 $ par µL de réaction. En outre, les méthodes d’expression de protéine en miroir la facilité de l’installation de réaction vue dans les systèmes disponibles dans le commerce grâce à l’optimisation des mélanges réactifs, à une fraction du coût. Afin de permettre à l’utilisateur de tirer parti de la souplesse de la plate-forme de produits forestiers certifiés pour des applications larges, nous avons identifié les divers aspects de la plate-forme qui peut être à l’écoute et optimisé selon les ressources disponibles et des résultats d’expression de protéine vous le souhaitez.

Nous avons présenté une sonication basée sur e. coli extrait protocole de préparation qui peut être effectué sur une période de quatre jours, avec la Figure 1 montrant la ventilation procédurale au cours de chaque journée. Il n’y a malléabilité aux étapes qui peut être accomplie chaque jour avec différents points de suspension, mais nous avons trouvé ce flux de travail la plus efficace d’exécuter. En outre, les granules cellulaire...

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Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-base de la synthèse protéique acellulaire : protocoles pour une technologie de plate-forme robuste, flexible et accessible

Ce protocole détaille les étapes, les coûts et équipements nécessaires pour générer des e. coli-extraits cellulaires de base et mettre en œuvre en vitro réactions de synthèse de protéines dans les 4 jours ou moins. Pour tirer parti de la souplesse de cette plate-forme pour les applications larges, nous discutons des conditions de réaction qui peuvent être adaptées et optimisées.

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Ce protocole simplifie et clarifie les méthodes de mise en œuvre de la synthèse auto-protéine par des non-experts. Un meilleur accès à ces méthodes aidera à démarketiser la plate-forme et le large éventail d’applications qu’elle permet. Les principaux avantages de cette technique sont la vitesse, la rentabilité et la facilité de réaction mises en place par rapport à d’autres plates-formes de synthèse auto-protéine.Notre plate-forme peut permettre un certain nombre d’applications, y compris la génomique fonctionnelle, hythopertesting, biocapteurs, kits éducatifs, et avec des modifications mineures, le génie métabolique et l’expansion du code génétique. Bien que cette technique ne nécessite qu’une formation de laboratoire de base, les nouveaux utilisateurs devraient planifier de se familiariser avec des techniques comme la sonication pour l’exécution réussie du protocole. Pour commencer cette procédure préparer tous les médias et la culture des cellules E.coli comme décrit dans le protocole texte.Placer une bouteille de centrifugeuse d’un litre dans un bain d’eau glacée. Une fois que les cultures OD600 atteint 3.0, versez la culture cellulaire dans la bouteille réfrigérée. À l’aide d’un double équilibre de faisceau, ajouter de l’eau à une deuxième bouteille centrifugeuse d’un litre jusqu’à ce qu’elle pèse la même chose que la première pour créer un équilibre pour la centrifugeuse.Après avoir pré-refroidi la centrifugeuse à quatre degrés Celsius, centrifuger les bouteilles à 5000 g et à 10 degrés Celsius pendant 10 minutes pour pelleter les cellules. Après cela, versez lentement et jetez le surnatant. Placez la pastille cellulaire sur la glace.À l’aide d’une spatule stérile, racler la pastille de cellules de la bouteille de centrifugeuse et la transférer dans un tube conique froid de 50 millilitres. Ajouter 30 millilitres de tampon S30 froid complété par une TNT de deux millimolaires et résuspendre la pastille en tourbillonnant en rafales courtes avec des périodes de repos sur la glace jusqu’à ce que la pastille soit entièrement résuspendue sans morceaux. Après cela, utilisez un autre tube conique de 50 millimètres rempli d’eau comme un équilibre pour centrifuger l’échantillon à 5000 g et 10 degrés Celsius pendant 10 minutes.Verser et jeter le surnatant. Resuspendez la pastille avec 20 à 25 millilitres de tampon S30 froid. Centrifugeuse à 5000 g et à 10 degrés Celsius pendant 10 minutes.Verser et jeter le surnatant. Ensuite, ajoutez 30 millilitres de tampon S30 et réutilisez la pastille à l’aide d’un vortex tel qu’il a été décrit précédemment. Mettez en place trois tubes coniques pré-pesés, froids et de 50 millilitres.À l’aide d’un remplisseur de pipette sérologique avec une pipette stérile, aliquot dix 10 millilitres de suspension à granulés dans chaque tube. Centrifugeuse tous les tubes en utilisant des équilibres appropriés au besoin à 5000 g et 10 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après cela, versez et jetez les surnatants.Essuyez soigneusement l’intérieur de chaque tube et capuchon avec un tissu propre pour enlever le tampon d’accès, tout en vous assurant d’éviter de toucher la pastille. À l’aide d’un équilibre analytique, revérez les tubes et signalez le poids final des granulés pour chaque tube. Pour commencer, ajouter un millilitre de tampon S30 froid avec 2 millimolaires de TNT par gramme de masse cellulaire à chaque granulé.Utilisez un vortex pour réutiliser les granulés comme décrit précédemment. Transférer ensuite 1,4 millilitres de chaque granulé résuspendé dans des tubes de microcentrifugeuses séparés de 1,5 millilitre. Placez un tube dans un bain d’eau glacée dans un bécher et placez la sonde sonicateur de telle sorte qu’elle ne touche pas les fonds ou les côtés du tube.Sonicate le tube avec l’amplitude réglée à 50% pendant 45 secondes, suivie par 59 secondes de repos. S’assurer de fermer et d’inverser les tubes pendant les périodes de repos. Immédiatement après la fin de la sonication, ajouter 4,5 microlitres d’une TNT molaire dans le lysate.Inverser le tube plusieurs fois pour le mélanger, puis le placer sur la glace. Répétez ce processus, en sonnant et en ajoutant de la TNT pour chaque tube de cellules résuspendées. Centrifugeuse les échantillons à 18 000 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Après cela, pipette chaque supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre, laissant un certain supernatant derrière pour s’assurer que la pastille n’est pas dérangée. Prenez les tubes de supernatant à la plate-forme tremblante d’un incubateur et incubez-les à 37 degrés Celsius avec des secousses à 250 RPM pendant 60 minutes. C’est la réaction de ruissellement.Ensuite, centrifugez les échantillons à 10 000 g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez chaque supernatant sans déranger la pastille en les transférant dans de nouveaux tubes. Créer de nombreux aliquots de 100 microlitres de l’extrait pour le stockage.Tout d’abord, la solution de dégel A, la solution B, le modèle d’ADN, l’extrait BL21DE3, la polymése d’ARN T7 et un aliquot d’eau de qualité moléculaire sur la glace. Ensuite, étiquetez la quantité nécessaire de tubes de microcentrifugeuse nécessaires à la réaction du SCF. Mélanger chaque reagent par pipetting ou vortexing, puis ajouter la solution au tube de réaction étiqueté, en s’assurant de ne pas vortex l’extrait de la cellule, mais plutôt inverser le tube pour mélanger.Assurez-vous que la réaction finale est bien mélangée et combinez-la en une seule perle de 15 microlitres au bas de chaque tube. Incuber chaque réaction sans trembler à 37 degrés Celsius pendant quatre heures, ou à 30 degrés Celsius pendant la nuit. Pour commencer, obtenir une plaque de puits de 96 et charger 48 microlitres de 0,05 MOLAIRE HEPES au pH 8 dans chaque puits nécessaire à la quantification.Ensuite, retirez les tubes de réaction de l’incubateur. Mélanger chaque réaction en descendant de haut en bas et transférer deux microlitres de chaque réaction dans les puits contenant hepes. Mélangez chaque puits en faisant des tuyaux de haut en bas.Après que toutes les réactions soient chargées et mélangées, chargez la plaque dans un fluoromètre et mesurez les fluorescents de point final SFGFP à l’aide d’une longueur d’onde d’excitation de 485 nanomètres et d’une longueur d’onde d’émission de 510 nanomètres. Utilisez une courbe standard précédemment générée pour déterminer la concentration de GFP superfoldered à partir de la lecture fluorescente obtenue. Dans cette étude, une préparation à base d’extrait d’E.coli basée sur la sonication est étudiée.Les granulés cellulaires et l’extrait cellulaire sont stables à 80 degrés Celsius négatifs pendant au moins un an. En outre, l’extrait cellulaire peut subir au moins cinq cycles de gel-dégel sans perte significative de productivité. Certaines étapes de ce protocole peuvent être modifiées sans nuire à la productivité globale du système.Plus particulièrement, les cellules peuvent être récoltées dans la gamme de 2,7 à 4,0 densité optique à 600 nanomètres sans effet significatif sur la productivité de l’extrait cellulaire. Toutefois, la qualité de l’ADN modèle est une source de variabilité de lot à lot qui influe sur les rendements volumétriques de la réaction du SCF. Ceci est résolu en purifiant l’ADN via un Midi ou maxiprep suivi d’une étape supplémentaire de nettoyage de l’ADN.Le navire de réaction a également une incidence sur les rendements volumétriques de la réaction du SCF. Une augmentation du rapport surface/volume se traduit par des rendements volumétriques plus élevés. Afin d’optimiser les rendements volumétriques de la réaction cfps et de réduire la variabilité de l’extrait cellulaire par lot, une titration de magnésium doit être effectuée pour chaque nouvelle préparation d’extrait.Pour les extraits cellulaires composés de 30 milligrammes par millilitre de protéines totales, la concentration optimale de magnésium et le volume d’extrait pour minimiser l’utilisation des reagents et maximiser le rendement volumétrique est de 10 millimlaire et cinq microlitres respectivement. En variant l’échelle de réaction, les utilisateurs peuvent poursuivre des méthodes allant du criblage à haut débit aux expressions à plus grande échelle d’une protéine cible. Cette technique offre deux avantages clés, d’abord il filtre les produits protéiques plus rapidement, et deuxièmement, il synthétise difficile d’exprimer les protéines.Par exemple, les protéines cytotoxiques ou qui nécessitent des conditions oxydantes pour leur fonction. Comme pour toute procédure de laboratoire, tous les reagents doivent être traités avec prudence. En outre, les centrifugeuses doivent toujours être équilibrées et la protection de l’oreille doit être utilisée pendant la sonication.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Particles without a Box: Brush-first Synthesis of Photodegradable PEG Star Polymers under Ambient Conditions

Particules sans boîte: Brush-première synthèse de photodégradables PEG étoiles polymères dans des conditions ambiantes

Convenient methods for the rapid, parallel synthesis of diversely functionalized nanoparticles will enable discovery of novel formulations for drug ...

Recherche

Chimie

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Cadres de synthèse et la caractérisation de fonctionnalisé métal-organique

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis of Poly(N-isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Synthesis of PolyN-isopropylacrylamide Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Synthèse de la poly (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels pour Anisotropic Thermo-réactivité et organophile / Hydrophile Loading Capability

Janus microparticles are compartmentalized particles with differing molecular structures and/or functionality on each of their two sides. Because of this ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Synthèse et caractérisation de supramoléculaires Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

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Synthèse des bioconjugués protéiques<em&gt; via</em&gt; Cystéine-maléimide Chemistry

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