Name: escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology
Uploaded: 2019-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Autoren möchten Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher, und Tony Turretto für den technischen Support, Wesley Kao, Layne Williams und Christopher Hight für hilfreiche Diskussionen anerkennen. Autoren erkennen auch finanzielle Unterstützung von Bill und Linda Frost Fonds, Zentrum für Anwendungen in der Biotechnologie Chevron Biotechnologie angewendet Endowment Forschungsstipendium, Cal Poly Forschung Scholarly und kreative Aktivitäten Grant Program (RSCA 2017), und die National Science Foundation (NSF-1708919). MZL erkennt an der California State University Graduate Grant. MCJ der Army Research Office W911NF-16-1-0372 anerkennt, National Science Foundation gewährt, MCB 1413563 MCB-1716766 und der Luftwaffe Forschung Labor Center of Excellence Grant FA8650-15-2-5518, die Verteidigung Bedrohung Reduktion Agentur Grant HDTRA1-15-10052/P00001, der David and Lucile Packard Foundation, die Camille Dreyfus Lehrer-Scholar Program, die Abteilung von Energie BER Grant DE-SC0018249, die menschliche Frontiers Science Program (RGP0015/2017), DOE Joint Genome Institute ETOP Grant, und das Chicago biomedizinische Konsortium mit Unterstützung der Searle-Fonds auf der Chicago Community Trust für Unterstützung.

(1) Media-Vorbereitung und Zellwachstum
<ol><li>
Tag1
	<ol>
<li>Streifen BL21*(DE3) E. Coli Zellen aus einem Glycerin auf eine LB-Agar-Platte auf Lager und mindestens 18 h bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Bereiten Sie 50 mL LB Medien und Autoklaven die Lösung auf einem flüssigen Zyklus für 30 min bei 121 ° C. Bei Raumtemperatur lagern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tag2
	<ol>
<li>Bereiten Sie 750 mL 2 X YTP Medien und 250 mL 0,4 M D-Glucose-Lösung, wie in die ergänzenden Info...

Zellfreie Proteinsynthese ist eine leistungsfähige und förderlichen Technologie für eine Vielzahl von Anwendungen von Biomanufacturing bis hin zu rapid Prototyping von biochemischen Systemen entstanden. Die Bandbreite der Anwendungen stützt sich auf die Fähigkeit zu überwachen, zu manipulieren und zellulären Maschinerie in Echtzeit zu erweitern. Trotz der wachsenden Auswirkungen dieser Plattform-Technologie, breiten Anpassung blieb langsam durch technische Feinheiten bei der Umsetzung der Methoden. Durch diese Bem...

Zellfreien Protein Synthese (GFP) hat eine Technologie entwickelt, die eine Reihe von neuen Möglichkeiten für die Proteinproduktion, funktionelle Genomik, metabolische Technik und mehr innerhalb der letzten 50 Jahre1,2freigeschaltet hat. Im Vergleich zu standard in Vivo Protein Ausdruck Plattformen, GFP bietet drei entscheidende Vorteile: 1) die zellfreie Natur der Plattform ermöglicht die Produktion von Proteinen, die potenziell toxischen oder die Zelle3,4 fremd wäre ,5,6; (2) Inaktivierung von genomischer DNA und die Einführung einer Vorlage DNA Kodierung der DNA des Interesses Kanal aller die systemische Energie in die Reaktion auf die Produktion von der Aktivit‰tderzur von Interesse; und 3) der offene Charakter der Plattform ermöglicht dem Benutzer, ändern und überwachen die Reaktionsbedingungen und Zusammensetzung in Echtzeit7,8. Dieser direkte Zugang zur Reaktion unterstützt die Vermehrung von biologischen Systemen mit erweiterten Chemikalien und Redox-Bedingungen für die Produktion von neuartigen Proteinen und der Abstimmung des metabolischen Prozesse2,9, 10. direkter Zugriff erlaubt auch dem Benutzer, die GFP-Reaktion mit Aktivität Assays in einem Single-Topf-System zu verbinden, für mehr Design-Build-Schnelltest11Zyklen. Die Kapazität die GFP-Reaktion in kleinen Tröpfchen oder auf Papier-basierten Geräten weiter unterstützt Hochdurchsatz-Entdeckung Bemühungen und rapid-Prototyping12,13,14,15 ,16. Durch diese Vorteile und die Plug & Play-Natur des Systems ist GFP hat eindeutig ermöglicht eine Vielzahl von Biotechnologieanwendungen wie die Produktion von Proteinen, die schwer zu Schwermetallspuren express- in Vivo17, 18,19,20, Erkennung der Krankheit21,22,23, auf Nachfrage Biomanufacturing18,24 ,25,26,27und Bildung28,29, die zeigen die Flexibilität und den Nutzen der zellfreien Plattform.
GFP-Systeme können aus einer Vielzahl von Rohöl Lysates von beiden prokaryotischen und eukaryotischen Zelle Linien erzeugt werden. Dies ermöglicht vielfältige Möglichkeiten in das System der Wahl, die jeweils vor- und Nachteile je nach Anwendung von Interesse haben. GFP-Systeme sind sehr unterschiedlich in Vorbereitungszeit, Kosten und Produktivität. Am meisten verwendet häufig Zelle, die Extrakte aus Weizenkeimen, Kaninchen Retikulozytenzahl und Insektenzellen Escherichia coli Zellen, wobei letztere die kostengünstigste bisher beim produzieren höchste volumetrische Erträge des Proteins30 hergestellt werden . Während andere GFP-Systeme für ihre angeborene Post-translationale Modifikation Maschinen vorteilhaft sein können, neue Anwendungen mithilfe der E. Coli-basierte Maschinen sind in der Lage, die Lücke durch die Generierung von ortspezifisch phosphorylierten und glykosylierten Proteinen auf Nachfrage31,32,33,34,35.
GFP-Reaktionen können in entweder Charge, kontinuierlichen Austausch zellfreie (CECF) oder kontinuierlichen Fluss zellfreie (CFCF) Formate ausgeführt werden. Das Batch-Format ist ein geschlossenes System, deren Reaktion Lebensdauer aufgrund der abnehmenden Mengen der Reaktionspartner und die Anhäufung von hemmenden Nebenprodukte der Reaktion beschränkt. CECF und CFCF Methoden erhöhen die Lebensdauer der Reaktion und damit höhere volumetrische Protein Renditen im Vergleich zu den Batch-Reaktion führen. Dies geschieht dadurch, dass die Nebenprodukte der Proteinsynthese den Reaktionsbehälter entfernt werden, während neue Reaktionspartner im Laufe der Reaktion2geliefert werden. Bei CFCF kann das Protein des Interesses auch aus der Reaktionskammer, während in CECF, das Protein des Interesses bleibt in der Reaktionskammer, bestehend aus einer halbdurchlässigen Membran36,37entfernt werden. Diese Methoden sind besonders wertvoll bei der Überwindung der schlechten volumetrische Erträge schwer Express Proteine des Interesses38,39,40,41,42, 43. Die Herausforderungen bei der Umsetzung der CECF und CFCF Ansätze sind, dass (1) während sie eine effizientere Nutzung der Bio-Maschinen verantwortlich für Transkription und Translation führen, benötigen sie vor allem größere Mengen an Reagenzien, die Gesamtkosten und 2 erhöht) Sie erfordern komplexere Reaktion Setups und spezialisierte Ausrüstung im Vergleich zu den Batch-Format-44. Um Barrierefreiheit für neue Benutzer zu gewährleisten, beschriebenen die Protokolle hier Fokus auf dem Batch-Format bei Reaktion Volumen von 15 µL mit konkreten Empfehlungen für die Erhöhung des Volumens der Reaktion auf die Milliliter-Skala.
Die hier vorgestellten Methoden ermöglichen Laien mit grundlegenden Labor Fähigkeiten (z. B. Studenten) implementieren Zellwachstum, Vorbereitung zu extrahieren und batch-Format Reaktion Setup für eine E. Coli-basiertes GFP-System. Dieser Ansatz ist kostengünstig im Vergleich zu handelsüblichen Kits ohne Einbußen bei der Einfachheit der Installation Kit-basierte Reaktion. Darüber hinaus ermöglicht dieser Ansatz Anwendungen im Labor und im Feld. Bei der Entscheidung zur Umsetzung der GFP, sollten neue Benutzer die Wirksamkeit der konventionellen Protein Expressionssysteme für Start-up-Investitionen, gründlich auswerten, wie GFP möglicherweise nicht in jedem Fall überlegen. Die hier beschriebenen Methoden GFP ermöglichen dem Benutzer direkt implementieren eine Reihe von Anwendungen, einschließlich der funktionellen Genomik, Hochdurchsatz-Tests, die Produktion von Proteinen, die unlösbar für in Vivo Ausdruck sowie Feld Anwendungen, einschließlich Biosensoren und Bildungs-Kits für synthetische Biologie. Zusätzliche Anwendungen wie z. B. metabolische Technik, Abstimmung von Protein Ausdruck Bedingungen, Krankheit Erkennung, und skalieren mit CECF oder CFCF Methoden sind immer noch möglich, aber erfordern Erfahrung mit der GFP-Plattform für weitere Modifikation der Reaktion Bedingungen. Unsere Methoden kombinieren Wachstum in angereicherten Medien und ratlos Fläschchen mit relativ schnelle und reproduzierbare Methoden der Lyse der Zelle durch Beschallung, gefolgt von einem vereinfachten GFP Reaktion-Setup, das optimierte Vormischungen45nutzt. Während die Zellwachstum Methoden etwas in diesem Bereich standardisiert werden, unterschiedlich Methoden zur Lyse der Zelle. Gemeinsamen Lyse Methoden gehören neben Beschallung Auslastung der französischen Presse, ein Homogenisator, Wulst Schläger, oder Lysozym und anderen Störungen der biochemischen und physikalischen Methoden46,47,48, 49. mit unserer Methode, ca. 2 mL Rohöl Zelle Extrakt pro 1 L Zellen stammen. Diese Menge von Zelle-Extrakt unterstützen vierhundert 15 µL GFP Reaktionen, jedes produzierenden ~ 900 µg/mL Reporter SfGFP Eiweiß aus der Vorlage Plasmid pJL1-SfGFP. Diese Methode kostet $ 0,021/µg von SfGFP hergestellt ($.019/µL Reaktion), ausgenommen die Kosten für die Arbeit und Ausrüstung (ergänzende Abbildung1). Ausgehend von der Pike auf, diese Methode kann von einer einzelnen Person in 4 Tagen umgesetzt werden und wiederholen Sie GFP Reaktionen innerhalb von Stunden (Abbildung 1) abgeschlossen werden können. Darüber hinaus kann das Protokoll in Volumen für größere Chargen von Reagenz Vorbereitung entsprechend den Bedürfnissen des Benutzers skaliert. Wichtig ist, kann die hier vorgestellten Protokoll von Labor ausgebildete Laien wie Studenten, implementiert werden, wie es nur grundlegende Labor Fähigkeiten erfordert. Der nachstehend beschriebenen Verfahren und das dazugehörige Video wurden speziell entwickelt, um die Zugänglichkeit der E. Coli -GFP-Plattform für den breiten Einsatz zu verbessern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">12795027</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60353-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P9791-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">KOH</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IPTG</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(OAc)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tris(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DTT</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">tRNA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Folinic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NTPs</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Oxalic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NAD</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CoA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PEP</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NH4(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">02180595.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(Glu)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Spermidine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Molecular Grade Water</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Aspartic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Valine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Alanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Arginine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Asparagine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Glycine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Histadine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Proline</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Serine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tyrosine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ultrasonic Processor</td>
			<td style="width:145px;">QSonica</td>
			<td style="width:123px;">Q125-230V/50Hz</td>
			<td>3.175 mm diameter probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1L Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microfuge 20</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cytation 5</td>
			<td style="width:145px;">BioTek</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Strep-Tactin XT Starter Kit</td>
			<td style="width:145px;">IBA</td>
			<td style="width:123px;">2-4998-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">pJL1-sfGFP</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:145px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

In den letzten 50 Jahren entstanden zellfreien Protein Synthese (GFP) als eine leistungsstarke Technologie, die transkriptionelle und translationale Kapazität von Zellen in einem Reagenzglas nutzbar zu machen. Durch die Notwendigkeit, die Lebensfähigkeit der Zelle vermieden und durch den Wegfall der zellulären Barriere wurde GFP grundlegend für neue Anwendungen in Biomanufacturing traditionell anspruchsvolle Proteine sowie Anwendungen im rapid Prototyping für Metabolic Engineering und funktionelle Genomik. Unsere Methoden für die Umsetzung einer E. Coli-basierten GFP-Plattform ermöglichen neue viele dieser Anwendungen Zugriff auf. Hier beschreiben wir Methoden um Extrakt durch angereicherte Medien, verblüfft Fläschchen und eine reproduzierbare Methode der einstellbaren Ultraschall-basierte Zelle Lysis vorzubereiten. Dieser Extrakt kann dann für Protein-Expression in der Lage 900 µg/mL oder mehr super Ordner grün fluoreszierenden Proteins (SfGFP) in nur 5 h vom Versuchsaufbau zur Datenanalyse, verwendet werden, angesichts der Tatsache, dass entsprechende Reagenz Bestände im Voraus vorbereitet worden sind. Voraussichtliche Inbetriebnahme kostet Reagenzien zu erhalten $4.500, die Tausende von Reaktionen mit geschätzten Kosten von $0,021 pro µg Protein produziert oder $0,019 pro Mikroliter Reaktion aufrechterhalten wird. Darüber hinaus spiegeln die Protein-Ausdruck-Methoden die Leichtigkeit der Reaktion Installation in marktübliche Systeme durch Optimierung des Reagenz Vormischungen, zu einem Bruchteil der Kosten gesehen. Damit den Benutzer die flexible Art der GFP-Plattform für breite Anwendungen nutzen kann, haben wir eine Vielzahl von Aspekten der Plattform identifiziert, die abgestimmt und je nach den verfügbaren Ressourcen und die Protein Ausdruck Ergebnisse optimiert werden können auf Wunsch.

Wir haben ein Ultraschall-basierte E. Coli Extrakt präsentiert Vorbereitung-Protokoll, das über einen Zeitraum von vier Tagen mit Abbildung 1 zeigt die verfahrensrechtliche Aufschlüsselung über jeden Tag abgeschlossen werden kann. Gibt es Formbarkeit zu den Schritten, die jeden Tag mit verschiedenen anhalten Punkten abgeschlossen werden können, aber wir haben festgestellt, dass dieses Workflows, die effektivste ausgeführt werden. Darüber hinau...

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Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-basierte zellfreie Proteinsynthese: Protokolle für eine robuste, flexible und zugängliche Plattform-Technologie

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die Kosten und die notwendige Ausrüstung für E. Colizu generieren-basierte Zellextrakte und in-vitro- Protein Synthesereaktionen innerhalb von 4 Tagen oder weniger zu implementieren. Um die flexiblen Charakter dieser Plattform für breite Anwendungen nutzen zu können, diskutieren wir Reaktionsbedingungen, die angepasst und optimiert werden können.

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Dieses Protokoll vereinfacht und klärt die Methoden zur Implementierung der Selbst-Re-Protein-Synthese durch Nicht-Experten. Ein verbesserter Zugriff auf diese Methoden wird dazu beitragen, die Plattform und die breite Palette von Anwendungen, die sie ermöglicht, zu entvermarkten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die Geschwindigkeit, Wirtschaftlichkeit und die Leichtigkeit der Reaktion im Vergleich zu anderen Selbst-Re-Protein-Synthese-Plattformen eingerichtet.Unsere Plattform kann eine Reihe von Anwendungen ermöglichen, einschließlich funktioneller Genomik, Hythopertesting, Biosensoren, Bildungskits und mit geringfügigen Modifikationen, metabolischer Technik und genetischer Codeerweiterung. Während diese Technik nur grundlegende Laborschulungen erfordert, sollten neue Benutzer planen, sich mit Techniken wie Beschallung für die erfolgreiche Ausführung des Protokolls vertraut zu machen. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie alle Medien und Kultur E.coli-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben vorbereitet.Legen Sie eine Ein-Liter-Zentrifugenflasche in ein Eiswasserbad. Sobald die Kulturen OD600 3.0 erreicht, gießen Sie die Zellkultur in die gekühlte Flasche. Mit einem Doppelstrahl-Balance, fügen Sie Wasser zu einer zweiten Ein-Liter-Zentrifugenflasche, bis es wiegt das gleiche wie die erste, um ein Gleichgewicht für die Zentrifuge zu schaffen.Nach dem Vorkühlen der Zentrifuge auf vier Grad Celsius zentrieren Sie die Flaschen bei 5.000 g und bei 10 Grad Celsius für 10 Minuten, um die Zellen zu pellet. Danach langsam abgießen und den Überstand entsorgen. Legen Sie das Zellpellet auf Eis.Mit einem sterilen Spachtel kratzen Sie das Zellpellet aus der Zentrifugenflasche und geben es in ein kaltes, 50 Milliliter konisches Rohr. Fügen Sie 30 Milliliter kalten S30 Puffer mit zwei Millimolar DTT ergänzt und das Pellet durch Wirbeln in kurzen Ausbrüchen mit Ruhezeiten auf Eis, bis das Pellet vollständig ohne Brocken resuspendiert wird. Danach verwenden Sie ein weiteres 50 Millimeter konisches Rohr mit Wasser gefüllt als Balance, um die Probe bei 5, 000 g und 10 Grad Celsius für 10 Minuten zentrifugieren.Gießen Sie den Überstand ab und entsorgen Sie ihn. Das Pellet mit 20 bis 25 Milliliterkaltem S30-Puffer wieder aufhängen. Zentrifuge bei 5.000 g und bei 10 Grad Celsius für 10 Minuten.Gießen Und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie dann 30 Milliliter S30-Puffer hinzu und setzen Sie das Pellet mit einem Wirbel wie zuvor beschrieben wieder auf. Legen Sie drei vorgewogene, kalte, 50 Milliliter konische Röhren auf.Mit einem serologischen Pipettenfüller mit einer sterilen Pipette, aliquot zehn 10 Milliliter PelletSuspension in jedes Rohr. Zentrifugieren Sie alle Rohre mit geeigneten Waagen bei 5 000 g und 10 Grad Celsius für 10 Minuten. Danach die Überräube ausgießen und entsorgen.Wischen Sie vorsichtig das Innere jedes Rohres und jeder Kappe mit einem sauberen Gewebe ab, um den Zugangspuffer zu entfernen, und stellen Sie sicher, dass sie das Pellet nicht berühren. Mit hilfe einer analytischen Waage die Rohre nachwägen und das endgültige Pelletgewicht für jedes Rohr melden. Zunächst fügen Sie jedem Pellet einen Milliliter kalten S30-Puffer mit 2 Millimolar DTT pro Gramm Zellmasse hinzu.Verwenden Sie einen Wirbel, um die Pellets wie zuvor beschrieben wieder auszusetzen. Dann 1,4 Milliliter jedes resuspendierten Pellets in separate 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohre geben. Legen Sie eine Röhre in ein Eiswasserbad in ein Becherglas und positionieren Sie die Beschallungssonde so, dass sie die Böden oder Seiten des Rohres nicht berührt.Sonicate das Rohr mit der Amplitude auf 50% für 45 Sekunden, gefolgt von 59 Sekunden Ruhe. Achten Sie darauf, die Rohre während der Auszeiten zu schließen und umzukehren. Unmittelbar nach Der Beschallung 4,5 Mikroliter eines Molaren DTT in das Lysat geben.Invertieren Sie die Röhre mehrmals zu mischen und dann auf Eis legen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, beschallen und fügen Sie DTT für jede Röhre von resuspendierten Zellen hinzu. Zentrifugieren Sie die Proben bei 18 000 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten.Danach pipette jeder Überstand in einem neuen 1,5 Milliliter Microcentrifuge Rohr, so dass einige Überstand zurücklassen, um sicherzustellen, dass das Pellet nicht gestört wird. Nehmen Sie die Röhren des Überstandes auf die Schüttelplattform eines Inkubators und bebrüten sie bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 250 U/min für 60 Minuten. Das ist die Ablaufreaktion.Dann zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie jeden Überstand, ohne das Pellet zu stören, das sie in neue Schläuche überträgt. Erstellen Sie viele 100 Mikroliter Aliquots des Extraktes für die Lagerung.Erstens Taulösung A, Lösung B, die DNA-Vorlage, der BL21DE3-Extrakt, T7-RNA-Polymerase und ein Aliquot aus molekularem Wasser auf Eis. Als nächstes beschriften Sie die notwendige Menge an Mikrozentrifugenrohren, die für die CFPS-Reaktion benötigt werden. Mischen Sie jedes Reagenz durch Pipettieren oder Wirbeln, dann fügen Sie die Lösung auf die beschriftete Reaktionsröhre, um sicherzustellen, dass nicht Wirbel die Zelle Extrakt, sondern invertieren das Rohr zu mischen.Stellen Sie sicher, dass die Endreaktion gut gemischt ist und in einer einzigen 15-Mikroliter-Perle an der Unterseite jedes Rohres kombiniert wird. Jede Reaktion ohne Schütteln bei 37 Grad Celsius vier Stunden oder über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubieren. Zu Beginn erhalten Sie eine 96-Well-Platte und laden Sie 48 Mikroliter von 0,05 Molaren-HEPES bei pH 8 in jeden Brunnen, der für die Quantifizierung benötigt wird.Entfernen Sie anschließend die Reaktionsrohre aus dem Inkubator. Mischen Sie jede Reaktion, indem Sie nach oben und unten pfeifen und zwei Mikroliter jeder Reaktion in die Brunnen übertragen, die HEPES enthalten. Mischen Sie jeden gut, indem Sie nach oben und unten.Nachdem alle Reaktionen geladen und gemischt sind, laden Sie die Platte in ein Fluorometer und messen die SFGFP-Endpunktleuchtstoffröhren mit einer Anregungswellenlänge von 485 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 510 Nanometern. Verwenden Sie eine zuvor generierte Standardkurve, um die Konzentration des superfaltierten GFP aus dem erhaltenen Fluoreszenzwertwert zu bestimmen. In dieser Studie wird eine auf Beschallung basierende E.coli-Extraktpräparation untersucht.Zellpellets und Zellextrakt sind mindestens ein Jahr lang bei minus 80 Grad Celsius stabil. Darüber hinaus kann der Zellextrakt mindestens fünf Frost-Tau-Zyklen ohne signifikanten Produktivitätsverlust durchlaufen. Einige Schritte innerhalb dieses Protokolls können geändert werden, ohne die Gesamtproduktivität des Systems zu beeinträchtigen.Vor allem können Zellen im Bereich von 2,7 bis 4,0 optischen Dichte bei 600 Nanometern geerntet werden, ohne dass dies einen signifikanten Einfluss auf die Produktivität des Zellextrakts hat. Die DNA-Qualität von Vorlagen ist jedoch eine Quelle der Batch-zu-Batch-Variabilität, die sich auf die volumetrischen Erträge der CFPS-Reaktion auswirkt. Dies wird durch die Reinigung der DNA über einen Midi oder Maxiprep gefolgt von einem zusätzlichen DNA-Reinigungsschritt gelöst.Das Reaktionsgefäß wirkt sich auch auf die volumetrischen Erträge der CFPS-Reaktion aus. Eine Erhöhung des Flächen-Volumen-Verhältnisses führt zu höheren volumentrumigen Erträgen. Um die volumetrischen Erträge der CFPS-Reaktion zu optimieren und die Zellextrakt-Batch-zu-Charge-Variabilität zu reduzieren, sollte für jede neue Extraktzubereitung eine Magnesiumtitration durchgeführt werden.Bei Zellextrakten, die aus 30 Milligramm pro Milliliter Gesamtprotein bestehen, beträgt die optimale Magnesiumkonzentration und das Extraktvolumen zur Minimierung des Reagenzverbrauchs und zur Maximierung der Volumenausbeute 10 Millimolar bzw. fünf Mikroliter. Durch Variation der Reaktionsskala können Anwender Methoden verfolgen, die vom Hochdurchsatz-Screening bis hin zu größeren Ausdrücken eines Zielproteins reichen. Diese Technik bietet zwei wesentliche Vorteile: Erstens werden Proteinprodukte schneller überprüft, und zweitens synthetisiert sie schwer, Proteine auszudrücken.Beispiele sind Proteine, die zytotoxisch sind oder oxidationsmittelierende Bedingungen für ihre Funktion erfordern. Wie bei jedem Laborverfahren sollten alle Reagenzien mit Vorsicht behandelt werden. Darüber hinaus sollten Zentrifugen immer ausgewogen sein und Der Gehörschutz sollte während der Beschallung verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Particles without a Box: Brush-first Synthesis of Photodegradable PEG Star Polymers under Ambient Conditions

Partikel ohne Box: Bürsten erste Synthese von Photochemisch PEG-Sterne-Polymers unter Umgebungsbedingungen

Convenient methods for the rapid, parallel synthesis of diversely functionalized nanoparticles will enable discovery of novel formulations for drug ...

Forschung

Chemie

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Synthese und Charakterisierung von funktionalisierten Metall-organische Gerüste

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis of Poly(N-isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Synthesis of PolyN-isopropylacrylamide Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Synthese von Poly (<em&gt; N</em&gt; Isopropylacrylamid) Janus Microhydrogels für anisotroper Thermo-Ansprechempfindlichkeit und organophiler / Hydrophilie Belastbarkeit

Janus microparticles are compartmentalized particles with differing molecular structures and/or functionality on each of their two sides. Because of this ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Synthese und Charakterisierung von supramolekularen Kolloid-

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthese von Protein Biokonjugate<em&gt; über</em&gt; Cystein-maleimid Chemie

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

NMR-Spektroskopie als robustes Werkzeug für die schnelle Bewertung des Lipidprofil von Fischöl

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Synthese von Kern-Schale Lanthanid-dotierte Großbildschirmen Nanokristallen für mobile Anwendungen

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

Chemical Synthesis of Porous Barium Titanate Thin Film and Thermal Stabilization of Ferroelectric Phase by Porosity-Induced Strain

Chemische Synthese von porösen Barium-Titanat Dünnschicht und thermische Stabilisierung der ferroelektrischen Phase von Porosität-induzierten Belastung

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

Synthese von Thiol Baustein für die Kristallisation eines halbleitenden Gyroidal Metall-Schwefel-Rahmens

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Vorbereitung der Poly(pentafluorophenyl acrylate) funktionalisiert SiO2 Perlen Proteinreinigung

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...