Name: escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology
Uploaded: 2019-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Gli autori si desidera ringraziare Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher e Tony Turretto per il supporto tecnico, Wesley Kao, Layne Williams e Christopher Hight per utili discussioni. Autori riconoscono anche finanziamento da Bill e Linda Frost Fund, centro per le applicazioni in Chevron biotecnologia applicata ricerca Endowment Grant di biotecnologia, Cal Poly ricerca, da studioso e Creative attività Grant Program (RSCA 2017), e la National Science Foundation (NSF-1708919). MZL riconosce la California State University Graduate Grant. MCJ riconosce l'esercito ricerca ufficio W911NF-16-1-0372, National Science Foundation concede MCB-1413563 e MCB-1716766, l'Air Force Research laboratorio centro di eccellenza Grant FA8650-15-2-5518, la concessione di agenzia di difesa minaccia riduzione HDTRA1-15-10052/P00001, il David e Lucile Packard Foundation, il programma di Camille Dreyfus Teacher-Scholar, il dipartimento di energia BER Grant DE-SC0018249, il programma di scienza umana frontiere (RGP0015/2017), la concessione ETOP DOE Joint Genome Institute, e il Consorzio biomedica di Chicago con il sostegno dei fondi di Searle presso la comunità di Chicago Trust per il supporto.

1. Media preparazione e crescita cellulare
<ol><li>
1 ° giorno
	<ol>
<li>Le cellule di e. coli BL21*(DE3) striscia da un glicerolo stock su una piastra di agar LB e incubare per almeno 18 ore a 37 ° C.</li>
		<li>Preparare 50 mL di LB media e autoclave la soluzione su un ciclo liquido per 30 min a 121 ° C. Conservare a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 ° giorno
	<ol>
<li>Preparare 750 mL di 2 x YTP media e 250 mL di soluzione di 0,4 M D-glucosio come descritt...

Sintesi proteica senza cellula è emerso come una tecnologia potente e abilitazione per una varietà di applicazioni che vanno dalla bioproduzione di prototipazione rapida di sistemi biochimici. L'ampiezza delle applicazioni è supportato dalla capacità di monitorare, modificare e aumentare il macchinario cellulare in tempo reale. Nonostante l'impatto di espansione di questa tecnologia di piattaforma, è rimasto ampio adattamento lento a causa di sfumature tecniche nell'implementazione dei metodi. Grazie a questo sforzo...

Sintesi di proteine senza cellula (CFPS) è emerso come una tecnologia che ha sbloccato una serie di nuove opportunità per la produzione di proteine, genomica funzionale, ingegneria metabolica e più entro gli ultimi 50 anni1,2. Rispetto alla standard in vivo piattaforme di espressione di proteine, CFPS offre tre vantaggi principali: 1) la natura senza cellula della piattaforma consente la produzione di proteine che sarebbe potenzialmente tossici o stranieri per la cella3,4 ,5,6; 2) inattivazione di DNA genomic e l'introduzione di un modello di DNA codificante il gene di interesse canale tutta l'energia sistemica all'interno della reazione per la produzione della proteina di interesse; e 3) la natura aperta della piattaforma consente all'utente di modificare e monitorare le condizioni di reazione e la composizione in tempo reale7,8. Questo accesso diretto alla reazione supporta l'incremento dei sistemi biologici con composizioni chimiche espanse e condizioni redox per la produzione di nuove proteine e la messa a punto di processi metabolici2,9, 10. diretto accesso consente inoltre all'utente di combinare la reazione CFPS con analisi di attività in un sistema singolo-pot per cicli di test per la compilazione di una progettazione più rapida11. La capacità di eseguire la reazione CFPS nelle goccioline di piccolo volume o su dispositivi basati su carta maggiori azioni di alto-rendimento individuazione di supporti e prototipazione rapida12,13,14,15 ,16. A seguito di questi vantaggi e la natura di plug and play del sistema, CFPS ha permesso in modo univoco una varietà di applicazioni della biotecnologia come la produzione di proteine che sono difficilmente solubile veloce in vivo17, 18,19,20, rilevamento di22,21,malattia23, sulla domanda bioproduzione18,24 ,25,26,27e formazione28,29, i quali mostrano la flessibilità e l'utilità della piattaforma senza cellula.
Sistemi di CFPS possono essere generati da una varietà di greggio lisati da entrambe le linee cellulari procarioti ed eucarioti. Questo permette diverse opzioni nel sistema di scelta, ciascuno dei quali hanno vantaggi e svantaggi a seconda dell'applicazione di interesse. CFPS sistemi variano anche notevolmente in produttività, costi e tempi di preparazione. La maggior parte utilizzati comunemente cella estratti sono prodotti da germe di grano, dei reticolociti di coniglio, cellule di insetto e cellule di Escherichia coli , con quest'ultimo è il più redditizio per data, producendo il massimo rendimento volumetrico della proteina30 . Mentre altri sistemi CFPS possono essere vantaggiosi per le loro macchine di modificazione post-traduzionale innata, emergendo applicazioni utilizzando il e. coli-base macchine sono in grado di colmare il divario generando site-specifically fosforilato e proteine glicosilate su domanda31,32,33,34,35.
Le reazioni CFPS possono essere eseguite in entrambi batch, scambio continuo senza cellula (CECF) o flusso continuo senza cellula (CFCF) formati. Il formato di batch è un sistema chiuso in cui durata di reazione è limitata a causa della diminuzione quantità di reagenti e l'accumulazione dei sottoprodotti inibitori della reazione. Metodi CECF e CFCF aumentano la durata della reazione e quindi causare rendimenti volumetrici aumentata della proteina rispetto alla reazione batch. Questa operazione viene eseguita consentendo i sottoprodotti della sintesi proteica per essere rimosso dal recipiente di reazione, mentre nuovi reagenti sono forniti nel corso della reazione2. Nel caso di CFCF, la proteina di interesse può essere rimosso anche dalla camera di reazione, mentre in CECF, la proteina di interesse rimane nella camera di reazione, costituito da una membrana semi-permeabile36,37. Questi metodi sono particolarmente preziosi nel superare la scarsa resa volumetrica di difficile--express proteine di interesse38,39,40,41,42, 43. Le sfide nell'attuazione degli approcci CECF e CFCF sono che 1) mentre risultano in un uso più efficiente dell'apparato bio responsabile della trascrizione e traduzione, richiedono in particolare più grandi quantità di reagenti che aumenta il costo complessivo e 2) Essi richiedono configurazioni più complesse di reazione e attrezzature specializzate rispetto al lotto formato44. Al fine di garantire l'accessibilità per i nuovi utenti, i protocolli descritti qui messa a fuoco sul formato batch a volumi di reazione di 15 µ l con raccomandazioni specifiche per aumentare il volume di reazione per la scala di millilitro.
I metodi presentati qui abilitare non esperti con competenze di base di laboratorio (ad esempio studenti universitari) per implementare la crescita delle cellule, estrarre preparazione e installazione di reazione formato in batch per un e. coli-CFPS sistema basato. Questo approccio è conveniente rispetto ai kit disponibili in commercio senza sacrificare la facilità di installazione basato su kit di reazione. Inoltre, questo approccio consente alle applicazioni in laboratorio e in campo. Quando si decide di implementare CFPS, nuovi utenti dovrebbero valutare attentamente l'efficacia di sistemi di espressione di proteine convenzionali per investimento per l'avvio, come CFPS non può essere superiore in ogni caso. I metodi CFPS qui descritti consentono all'utente di implementare direttamente una varietà di applicazioni, tra cui la genomica funzionale, test, la produzione di proteine che sono insolubili per espressione in vivo , come pure il campo ad alta velocità applicazioni tra cui biosensori e kit didattici per biologia sintetica. Le applicazioni aggiuntive come ingegneria metabolica, ottimizzazione delle condizioni di espressione della proteina, individuazione della malattia e scalabilità utilizzando metodi CECF o CFCF sono ancora possibili ma possono richiedere l'esperienza con la piattaforma CFPS per ulteriori modifiche della reazione condizioni. I nostri metodi di combinano una crescita in media arricchita e boccette sconcertati, con metodi relativamente rapidi e riproducibili di lisi cellulare mediante sonicazione, seguita da un'installazione di reazione CFPS semplificata che utilizza ottimizzato premiscele45. Mentre i metodi di crescita cellulare sono diventati un po' standardizzati all'interno di questo campo, metodi per lisi cellulare variano ampiamente. Oltre a sonicazione, metodi di lisi comuni includono l'utilizzo di una pressa francese, un omogeneizzatore, battitori della perla, o lisozima e altri disagi fisici e biochimici metodi46,47,48, 49. usando i nostri metodi, circa 2 mL di estratto grezzo delle cellule sono ottenute per 1 L di cellule. Questa quantità di Estratto di cellule in grado di supportare quattro cento 15 µ l CFPS reazioni, ogni produzione ~ 900 µ g/mL di proteina sfGFP reporter dal plasmide modello pJL1-sfGFP. Questo metodo costa $0,021 / µ g di prodotto sfGFP ($.019/microlitro di reazione), escluso il costo della manodopera e le attrezzature (Supplemental figura 1). A partire da zero, questo metodo può essere implementato in 4 giorni da una sola persona e ripetere le reazioni CFPS possono essere completate entro le ore (Figura 1). Inoltre, il protocollo può essere scalato in volume per grandi lotti di preparazione dei reagenti in base alle esigenze dell'utente. D'importanza, il protocollo qui presentato può essere implementato da laboratorio addestrato non-esperti quali studenti universitari, come richiede solo la capacità di laboratorio di base. Le procedure descritte di seguito e il video di accompagnamento sono stati specificamente sviluppati per migliorare l'accessibilità della piattaforma CFPS Escherichia coli per l'ampio utilizzo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">12795027</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60353-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P9791-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">KOH</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IPTG</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(OAc)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tris(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DTT</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">tRNA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Folinic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NTPs</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Oxalic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NAD</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CoA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PEP</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NH4(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">02180595.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(Glu)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Spermidine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Molecular Grade Water</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Aspartic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Valine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Alanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Arginine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Asparagine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Glycine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Histadine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Proline</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Serine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tyrosine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ultrasonic Processor</td>
			<td style="width:145px;">QSonica</td>
			<td style="width:123px;">Q125-230V/50Hz</td>
			<td>3.175 mm diameter probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1L Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microfuge 20</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cytation 5</td>
			<td style="width:145px;">BioTek</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Strep-Tactin XT Starter Kit</td>
			<td style="width:145px;">IBA</td>
			<td style="width:123px;">2-4998-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">pJL1-sfGFP</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:145px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Negli ultimi 50 anni, sintesi di proteina Cell-Free (CFPS) è emerso come una potente tecnologia per sfruttare la capacità trascrizionale e traslazionale delle cellule all'interno di una provetta. Eliminando la necessità di mantenere la vitalità della cellula ed eliminando la barriera cellulare, CFPS è stato fondamentale per le applicazioni emergenti in bioproduzione di proteine tradizionalmente difficili, nonché applicazioni nella prototipazione rapida per Ingegneria metabolica e genomica funzionale. I nostri metodi per l'implementazione di un e. coli-piattaforma basato su CFPS ai nuovi utenti di accedere a molte di queste applicazioni. Qui, descriviamo i metodi per preparare l'estratto attraverso l'uso di media arricchita, boccette sconcertati e un metodo riproducibile di lisi cellulare basato su sonicazione sintonizzabile. Questo estratto quindi può essere utilizzato per l'espressione della proteina in grado di produrre 900 µ g/mL o più di proteina fluorescente verde super cartella (sfGFP) in appena 5 ore dalla messa a punto sperimentale all'analisi dei dati, dato che le scorte di reattivo appropriato sono state preparate in anticipo. Il costo stimato avvio di ottenere reagenti è $4.500 che sosterrà migliaia di reazioni ad un costo stimato di $0,021 per µ g di proteina prodotta o $0,019 per µ l di reazione. Inoltre, i metodi di espressione della proteina specchio la facilità dell'installazione reazione visto nei sistemi disponibili in commercio a causa dell'ottimizzazione di reagente premiscelati, ad una frazione del costo. Al fine di consentire all'utente di sfruttare la natura flessibile della piattaforma CFPS per vaste applicazioni, abbiamo identificato una varietà di aspetti della piattaforma che possono essere ottimizzate e ottimizzato a seconda delle risorse disponibili e gli esiti di espressione della proteina desiderato.

Abbiamo presentato una base di sonicazione Escherichia coli Estratto protocollo di preparazione che può essere completato in un arco di quattro giorni, con Figura 1 dimostrando la ripartizione procedurale sopra ogni giorno. C'è malleabilità ai passaggi che possono essere completati in ogni giorno con vari punti di sospensione dell'esecuzione, ma abbiamo trovato questo flusso di lavoro per essere il più efficace eseguire. Inoltre, sia il pellet ce...

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Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-base della sintesi proteica Cell-Free: protocolli per la tecnologia della piattaforma robusta, flessibile e accessibile

Questo protocollo dettaglia i passaggi, i costi e attrezzature necessarie per generare e. coli-base di estratti cellulari e implementare in vitro reazioni di sintesi di proteine entro 4 giorni o meno. Per sfruttare la natura flessibile di questa piattaforma per vaste applicazioni, discutiamo le condizioni di reazione che possono essere adattate e ottimizzate.

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Questo protocollo semplifica e chiarisce i metodi per implementare la sintesi auto-proteina da parte di non esperti. Un migliore accesso a questi metodi aiuterà a demarketizzare la piattaforma e l'ampio set di applicazioni che abilita. I principali vantaggi di questa tecnica sono la velocità, il rapporto costo/efficacia e la facilità di reazione impostata rispetto ad altre piattaforme di sintesi auto-proteina.La nostra piattaforma può abilitare una serie di applicazioni tra cui genomica funzionale, hythopertesting, biosensori, kit educativi e con piccole modifiche, ingegneria metabolica ed espansione del codice genetico. Mentre questa tecnica richiede solo formazione di laboratorio di base, i nuovi utenti dovrebbero pianificare di familiarizzare con tecniche come la sonicazione per un'esecuzione riuscita del protocollo. Per iniziare questa procedura, preparare tutte le celle E.coli dei supporti e delle impostazioni cultura come indicato nel protocollo di testo.Mettere una bottiglia di centrifuga da un litro in un bagno d'acqua ghiacciata. Una volta che le colture OD600 raggiungono 3.0, versare la coltura cellulare nella bottiglia refrigerata. Utilizzando un bilanciere a doppio fascio, aggiungere acqua a un secondo flacone di centrifuga da un litro fino a quando non pesa lo stesso del primo per creare un equilibrio per la centrifuga.Dopo aver preraffreddato la centrifuga a quattro gradi Celsius, centrifugare le bottiglie a 5.000 g e a 10 gradi Celsius per 10 minuti per pellettare le celle. Dopo questo, versare lentamente e smaltire il supernatante. Posizionare il pellet di cella sul ghiaccio.Utilizzando una spatola sterile raschiare il pellet cellulare dalla bottiglia di centrifuga e trasferirlo in un tubo conico freddo da 50 millilitri. Aggiungere 30 millilitri di tampone S30 freddo integrato con due DTT millimolare e rimorsi il pellet a vortice in brevi raffiche con periodi di riposo sul ghiaccio fino a quando il pellet non viene completamente rimorsinato senza pezzi. Successivamente, utilizzare un altro tubo conico di 50 millimetri riempito con acqua come equilibrio per centrifugare il campione a 5.000 g e 10 gradi Celsius per 10 minuti.Versare e smaltire il supernatante. Resuspend il pellet con tampone S30 freddo da 20 a 25 millilitri. Centrifuga a 5.000 g e a 10 gradi Celsius per 10 minuti.Versare e smaltire il supernatante. Quindi, aggiungere 30 millilitri di tampone S30 e rimosogliere il pellet utilizzando un vortice come descritto in precedenza. Impostare tre tubi conici pre-pesati, freddi e da 50 millilitri.Utilizzando un riempitivo sierologico pipetta con pipetta sterile, aliquota dieci 10 millilitri di sospensione pellet in ogni tubo. Centrifugare tutti i tubi utilizzando bilanci appropriati in base alle esigenze a 5.000 g e 10 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo questo, versare e smaltire i supernatanti.Pulire con cura l'interno di ogni tubo e cappuccio con un tessuto pulito per rimuovere il buffer di accesso, assicurandosi di evitare di toccare il pellet. Utilizzando un bilanciere analitico, riaspesti i tubi e segnala il peso finale del pellet per ogni tubo. Per iniziare, aggiungere un millilitro di tampone S30 freddo con 2 DTT millimolare per grammo di massa cellulare ad ogni pellet.Utilizzare un vortice per rimospendare i pellet come descritto in precedenza. Quindi trasferire 1,4 millilitri di ogni pellet rimescolato in tubi microcentrifugi separati da 1,5 millilitri. Posizionare un tubo in un bagno d'acqua ghiacciata in un becher e posizionare la sonda sonicatore in modo che non tocchi i fondi o i lati del tubo.Sonicare il tubo con l'ampiezza impostata al 50% per 45 secondi, seguita da 59 secondi di riposo. Assicurarsi di chiudere e invertire i tubi durante i periodi di spegnimento. Subito dopo il completamento della sonicazione, aggiungere 4,5 microlitri di un DTT molare nel litorato.Invertire il tubo più volte per mescolare e quindi posizionarlo sul ghiaccio. Ripetere questo processo, sonicando e aggiungendo DTT per ogni tubo di celle rimontente. Centrifugare i campioni a 18.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti.Successivamente, pipettare ogni supernatante in un nuovo tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri, lasciandosi alle spalle un supernatante per assicurarsi che il pellet non sia disturbato. Portare i tubi di supernatante sulla piattaforma di scuotimento di un incubatore e incubarli a 37 gradi Celsius con tremori a 250 giri/min per 60 minuti. Questa è la reazione al ballottaggio.Quindi, centrifugare i campioni a 10.000 g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere ogni supernatante senza disturbare il pellet trasferendoli in nuovi tubi. Creare molte aliquote da 100 microliter dell'estratto per la conservazione.In primo luogo, la soluzione di disgelo A, la soluzione B, il modello di DNA, l'estratto BL21DE3, la T7 RNA Polimerasi e un'aliquota di acqua di grado molecolare sul ghiaccio. In secondo luogo, etichettare la quantità necessaria di tubi di microcentrifugo necessari per la reazione CFPS. Mescolare ogni reagente pipettando o vortexing, quindi aggiungere la soluzione al tubo di reazione etichettato, assicurandosi di non vortice l'estratto di cella ma invece invertire il tubo per mescolare.Assicurarsi che la reazione finale sia ben miscelata e combinarsi in un'unica perla da 15 microliter nella parte inferiore di ogni tubo. Incubare ogni reazione senza tremare a 37 gradi Celsius per quattro ore o a 30 gradi Celsius durante la notte. Per iniziare, ottenere una piastra di pozzo 96 e caricare 48 microlitri di HEPES molare 0,05 a pH 8 in ogni pozzo necessario per la quantificazione.Quindi, rimuovere i tubi di reazione dall'incubatore. Mescolare ogni reazione tubazione su e giù e trasferire due microlitri di ciascuna reazione nei pozzi contenenti HEPES. Mescolare ogni bene pipettando su e giù.Dopo che tutte le reazioni sono state caricate e mescolate, caricare la piastra in un fluorometro e misurare le fluorescenti del punto finale SFGFP utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 510 nanometri. Utilizzare una curva standard generata in precedenza per determinare la concentrazione di GFP superfoldered dalla lettura fluorescente ottenuta. In questo studio viene studiata una preparazione dell'estratto di E.coli basata sulla sonicazione.Pellet cellulari ed estratto cellulare sono stabili a -80 gradi Celsius per almeno un anno. Inoltre, l'estratto cellulare può subire almeno cinque cicli di congelamento-scongelamento senza una significativa perdita di produttività. Alcuni passaggi all'interno di questo protocollo possono essere variati senza pregiudicare la produttività complessiva del sistema.In particolare, le cellule possono essere raccolte nell'intervallo da 2,7 a 4,0 densità ottica a 600 nanometri senza un effetto significativo sulla produttività dell'estratto cellulare. Tuttavia, la qualità del DNA modello è una fonte di variabilità da lotto a lotto che influisce sulle rese volumetriche della reazione CFPS. Questo si risolve purificando il DNA attraverso un Midi o Maxiprep seguito da un ulteriore passaggio di pulizia del DNA.Il recipiente di reazione influisce anche sulle rese volumetriche della reazione CFPS. Un aumento del rapporto superficie/volume, si traduce in rese volumetriche più elevate. Per ottimizzare le rese volumetriche della reazione CFPS e ridurre la variabilità da lotto a lotto dell'estratto cellulare, è necessario eseguire una titolazione di magnesio per ogni nuova preparazione dell'estratto.Per gli estratti cellulari composti da 30 milligrammi per proteina totale millilitro, la concentrazione ottimale di magnesio e il volume di estratto per ridurre al minimo l'uso di reagenti e massimizzare la resa volumetrica è rispettivamente di 10 millimolare e cinque microlitri. Variando la scala di reazione, gli utenti possono perseguire metodi che vanno dallo screening ad alta produttività alle espressioni su larga scala di una proteina bersaglio. Questa tecnica offre due vantaggi chiave, prima scherma i prodotti proteici più rapidamente e, in secondo luogo, sintetizza proteine difficili da esprimere.Esempi includono proteine che sono citotossiche o richiedono condizioni ossidanti per la loro funzione. Come per qualsiasi procedura di laboratorio, tutti i reagenti devono essere trattati con cautela. Inoltre, le centrifughe devono sempre essere bilanciate e la protezione dell'orecchio deve essere utilizzata durante la sonicazione.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Particles without a Box: Brush-first Synthesis of Photodegradable PEG Star Polymers under Ambient Conditions

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Ricerca

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Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

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