Name: escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology
Uploaded: 2019-02-25T12:30:00
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저자 박사 제니퍼 VanderKelen, 안드레아 Laubscher, 및 기술 지원에 대 한 토니 Turretto, 웨슬리 Kao, Layne 윌리엄스, 그리고 유용한 토론에 대 한 크리스토퍼 Hight를 인정 하 고 싶습니다. 저자는 또한 자금 빌과 린다 리 펀드, 생명 공학의 쉐 브 론 생명 공학 적용 연구 기금 그랜트, 칼 폴 리 연구, Scholarly, 및 창조적인 활동 그랜트 프로그램 (RSCA 2017), 응용 프로그램에 대 한 센터에서 지원을 인정합니다 그리고 국립 과학 재단 (NSF-1708919). MZL은 캘리포니아 주립 대학 대학원 부여 인정합니다. MCJ는 육군 연구 사무실 W911NF-16-1-0372 인정, 국립 과학 재단 부여 MCB 1413563 및 MCB 1716766는 공군 연구 실험실 센터 우수 그랜트 FA8650-15-2-5518, 방위 위협 감소 기관 보조금 HDTRA1-15-10052/P00001, 데이빗과 루 패 커드 재단, 카밀 드레퓌스 교사 학자 프로그램의 에너지 BER 그랜트 드-SC0018249, 인간 프론티어 과학 프로그램 (RGP0015/2017), 미상 합동 게놈 연구소 ETOP 그랜트, 부서 및 Searle 자금 시카고 커뮤니티 트러스트 지원에 대 한 지원으로 시카고 생명 컨소시엄.

1. 미디어 준비 및 세포 성장
<ol><li>
주 1
	<ol>
<li>글리세롤에서 행진 대장균 BL21*(DE3) 셀 파운드 한 천 격판덮개에 재고 및 적어도 18 h 37 ° c.에 품 어</li>
		<li>121 ° c.에 30 분 동안 액체 주기 파운드 미디어와 고압 솔루션 50 mL를 준비 실내 온도에 상점.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
주 2
	<ol>
<li>추가 정보에 설명 된 대로 2 x YTP 미디어와 0.4 M D-포도 당 솔루션의 250 mL 750 mL를 준비 ?...

셀 무료 단백질 합성 응용 프로그램 biomanufacturing에서 생화학 시스템의 신속한 프로토 타입에 이르기까지 다양 한 강력 하 고 사용 기술로 떠오르고 있다. 애플 리 케이 션의 광범위 한 모니터링 하 고 조작 하 고, 실시간으로 세포질 기계 장치를 보강 하는 능력에 의해 지원 됩니다. 이 플랫폼 기술의 확대 영향에도 불구 하 고 광범위 한 적응 남아 있다 메서드의 구현에서 기술적인 뉘앙스로 인해 ?...

셀 무료 단백질 합성 (CFPS) 등에 대 한 단백질 생산, 기능 유전체학, 대사 공학, 지난 50 년1,2내에서 새로운 기회의 번호를 잠금 해제는 기술로 떠오르고 있다. 표준 vivo에서 단백질 식 플랫폼에 비해, CFPS 세 가지 주요 이점을 제공 합니다: 1) 플랫폼의 셀 무료 자연 수는 잠재적으로 독성 또는 셀3,4 외국 것 단백질의 생산 ,,56; 2) 게놈 DNA의 비활성화 및 서식 파일의 gene(s)를 인코딩 하는 DNA의 소개의;는 protein(s)의 생산에 대 한 반응 내에서 조직의 에너지의 모든 채널 그리고 3) 플랫폼의 오픈 자연 수정 하 고 반응 조건 및 실시간7,8구성 모니터링 사용자 수 있습니다. 반응에 대 한이 직접 액세스 지원 확장 된 화학 및 산화 환 원 조건 새로운 단백질의 생산 및 대사 과정2,9, 의 튜닝에 대 한 생물 학적 시스템의 확대 10. 또한 수 있습니다 더 빠른 디자인-빌드-테스트11주기 위한 단일 포트 시스템에 CFPS 반응 활동 분석 실험을 결합 하 여 사용자를 직접. 작은 볼륨 방울 CFPS 반응을 수행 또는 종이 기반 장치에 더 높은 처리량 검색 노력을 지원 및 신속한 프로토 타입12,,1314,15 용량 ,16. 이러한 장점와 시스템의 플러그 앤 플레이 성격, CFPS 고유 어렵다 녹 표현 vivo에서단백질의 생산 등 생명 공학 응용 프로그램의 다양 한 활성화는17, 18,,1920, 질병21,,2223, 수요 biomanufacturing18,24 의 검출 25,,2627및 교육28,29, 유연성과 셀 무료 플랫폼의 유틸리티 모두 보기.
CFPS 시스템 모두 간결한과 진 핵 세포 라인에서 원유 lysates의 다양 한에서 생성할 수 있습니다. 다양 한 옵션 선택, 시스템에서 각각의 장점과 단점의 응용 프로그램에 따라 수 있습니다. CFPS 시스템 또한 준비 시간, 비용 및 생산성에 크게 다릅니다. 가장은 일반적으로 활용 하는 세포 추출 물 밀 세균, 토끼 reticulocyte, 곤충 세포, 및 후자 되 단백질30의 가장 높은 체적 수확량을 생산 하는 동안 날짜를 가장 비용 효율적인 대장균 세포에서 생산 됩니다. . 다른 CFPS 시스템 될 수 있지만 그들의 타고 난 포스트 번역 상 수정 기계에 대 한 유리한, 신흥 대장균을 사용 하 여 응용 프로그램-기반된 기계 site-specifically phosphorylated 생성 하 여 격차를 해소 수 있다 고 수요31,32,33,,3435당화 단백질.
CFPS 반응 중 일괄 처리, 연속 교환 셀 프리 (CECF) 또는 연속 흐름 셀 무료 (CFCF) 형식에서에서 실행할 수 있습니다. 일괄 처리 형식은 닫힌된 시스템 반응 수명이 감소 양의 반응 및 반응의 억제 부산물의 축적으로 인해 제한 됩니다. CECF 및 CFCF 메서드는 반응의 수명을 늘릴를 그로 인하여 증가 체적 단백질 수율 일괄 처리 반응에 비해. 이것은 새로운 반응 반응2과정을 통해 제공 하는 동안 반응 용기에서 제거할 단백질 합성의 부산물을 함으로써 수행 됩니다. CFCF, 경우 관심의 단백질은 또한 CECF, 반 투과성 막36,37의 구성 하는 반응 챔버에 관심이 남아의 단백질에에서 반응 약 실에서 제거할 수 있습니다. 이러한 메서드는 관심38,39,40,,4142, 표현 하기 어려운 단백질의 가난한 체적 수확량을 극복에서 특히 귀중 한 43. CECF 및 CFCF 접근을 구현 과제는 1) 동안 그들은 결과 바이오 기계 전사 및 번역에 대 한 책임을 더 효율적으로 사용, 그들은 특히 2 및 전반적인 비용을 증가 시 약의 대량 필요) 그들은 더 복잡 한 반응 설정 및 배치 형식44에 비해 특수 장비 필요 합니다. 새 사용자에 대 한 접근성을 보장 하기 위해 프로토콜 설명 여기 반응이 볼륨 증가 밀리 리터 규모 반응 볼륨에 대 한 특정 권장 사항을 15 µ L의 배치 형식에 초점.
여기에 소개 하는 방법을 구현 세포 성장, 준비, 추출 및 형식 반응 설치는 대장균에 대 한 일괄 (학부 학생) 등 기본적인 실험실 기술 전문가 들은 활성화-CFPS 시스템을 기반으로. 이 방법은 반응 키트 기반 설치의 용이성을 희생 하지 않고 상업적으로 사용 가능한 키트에 비해 비용 효과적입니다. 또한,이 방법을 통해 응용 프로그램에서에서 실험실 그리고 분야에서. CFPS를 구현 하도록 결정, CFPS 모든 경우에 우수한 되지 않을 수도 있습니다 새로운 사용자 시작 투자에 대 한 기존의 단백질 표정 시스템의 효능을 평가 철저 하 게 해야 합니다. 여기에 설명 된 CFPS 메서드는 사용자가 직접 구현 하는 다양 한 응용 프로그램, 기능 유전체학, 높은 처리량 테스트, vivo에서 식 필드에 대 세공 되지 않은 단백질의 생산을 포함 하 여를 사용합니다 바이오 센서 및 합성 생물학에 대 한 교육 키트를 포함 하 여 응용 프로그램. 대사 공학 같은 추가 응용 프로그램 단백질 식 조건, 질병 탐지, 및 확장을 사용 하 여 CECF 또는 CFCF 메서드가 여전히 가능 하지만 반응의 추가 수정에 대 한 CFPS 플랫폼 경험을 해야 튜닝 조건입니다. 우리의 방법을 상대적으로 신속 하 고 재현성 쥡니다, 최적화 된 예비 배합 물45를 사용 하는 간소화 된 CFPS 반응 설치 다음을 통해 세포 세포의 용 해 방법 풍부한 미디어 및 당황 하 게 플라스 크, 성장에 결합 되어 있습니다. 세포 성장 방법이이 분야 내에서 다소 표준화 되, 하는 동안 세포 세포의 용 해 방법 넓게 변화 한다. 쥡니다, 뿐만 아니라 일반적인 세포의 용 해 방법 포함 프랑스 언론 활용, 한 균질 화기, 비드 고물 차, 또는 lysozyme 다른 생 화 학적 및 물리적 중단 방법46,47,48, 49. 조 세포 추출 물의 약 2 mL 셀의 1 L 당 가져온 우리의 방법을 사용 하 여. 이 양의 세포 추출 물 4 백을 지원할 수 있습니다 15 µ L CFPS 반응, 각 생산 ~ 900 µ g/mL 템플릿 플라스 미드 pJL1-sfGFP에서 기자 sfGFP 단백질의. 이 방법은 비용 $0.021 / µ g의 sfGFP 제작 ($.019 / µ L의 반응), 노동 및 장비 (보충 그림 1)의 비용을 제외 하 고. 처음부터 시작,이 방법은 한 사람에 의해 4 일에 구현할 수 있다 고 CFPS 반응 시간 (그림 1) 내에서 완료 될 수 있다 반복 합니다. 또한, 프로토콜 사용자의 요구에 맞게 시 약 준비의 큰 배치에 대 한 볼륨 확장할 수 있습니다. 중요 한 것은, 여기에 제시 된 프로토콜만 기본적인 실험실 기술을 필요로 실험실 훈련 비-학부 학생 등 전문가 의해 구현할 수 있습니다. 아래에서 설명 하는 절차와 함께 비디오 특별히 개발 되었습니다 광범위 한 사용에 대 한 대장균 CFPS 플랫폼의 접근성을 개선 하기 위해.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">12795027</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60353-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P9791-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">KOH</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IPTG</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(OAc)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tris(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DTT</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">tRNA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Folinic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NTPs</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Oxalic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NAD</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CoA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PEP</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NH4(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">02180595.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(Glu)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Spermidine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Molecular Grade Water</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Aspartic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Valine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Alanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Arginine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Asparagine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Glycine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Histadine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Proline</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Serine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tyrosine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ultrasonic Processor</td>
			<td style="width:145px;">QSonica</td>
			<td style="width:123px;">Q125-230V/50Hz</td>
			<td>3.175 mm diameter probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1L Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microfuge 20</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cytation 5</td>
			<td style="width:145px;">BioTek</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Strep-Tactin XT Starter Kit</td>
			<td style="width:145px;">IBA</td>
			<td style="width:123px;">2-4998-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">pJL1-sfGFP</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:145px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

지난 50 년 동안 셀 무료 단백질 합성 (CFPS)는 시험관 내에서 셀의 transcriptional 변환 용량을 활용 하는 강력한 기술으로 떠오르고 있다. 고, 세포의 생존 능력을 유지 하는 필요를 만듦으로써 세포 장벽을 제거 함으로써, CFPS 되었습니다 전통적으로 도전 단백질의 biomanufacturing에 신흥 응용 프로그램 뿐만 아니라 응용 프로그램에 기초에 대 한 신속한 프로토 타입 대사 공학 및 기능 유전체학 대장균을 구현 하기 위한 우리의 방법-CFPS 플랫폼을 기반으로 새 사용자가 이러한 응용 프로그램의 대부분을 액세스할 수 허용. 여기, 우리는 풍부한 미디어, 당황 하 고 플라스 크와 가변 쥡니다 기반 세포 세포의 용 해의 재현 방법을 통해 추출 준비 하는 방법을 설명 합니다. 그 적절 한 시 약 주식 미리 준비 된이 추출 다음 단백질 발현 데이터 분석, 실험적인 체제에서 단지 5 h에서 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP)의 900 µ g/mL 이상의 생산 능력에 대 한 사용할 수 있습니다. 시 약의 예상된 시작 비용 $4500 단백질 생산의 µ g 당 0.021 달러 또는 $0.019 반응의 µ L 당 예상 비용 반응의 수천을 유지할 것입니다. 또한, 단백질 식 방법 거울 최적화 시 사전 믹스, 비용의 일부분에서의 상용 시스템에서 본 반응 설치의 용이성. 광범위 한 응용 프로그램에 대 한 CFPS 플랫폼의 유연한 특성을 활용 하 여 사용자 수 있도록, 다양 한 조정 하 고 사용할 수 있는 리소스와 단백질 식 결과 따라 최적화 될 수 있는 플랫폼의 측면 확인 했습니다. 원하는.

우리 쥡니다 기반 대장균 추출 제시 준비 프로토콜을 매일 절차 분석을 보여주는 그림 1 4 일 기간 동안 완료 될 수 있다. 가 단성 다양 한 일시 중지 포인트, 매일에 완료할 수 있는 단계에 있다 하지만 우리이 워크플로 실행에 가장 효과적인 것으로 나타났습니다. 또한, 셀 펠 릿 (단계 1.3.18)와 완벽 하 게 준비 된 추출 (단계 2.10)는 안정-80 ° C에...

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Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

대장균-셀 무료 단백질 합성 기반: 강력 하 고 유연 하며 액세스할 수 있는 플랫폼 기술에 대 한 프로토콜

이 프로토콜 세부 단계, 비용, 그리고 대장균을 생성 하는 데 필요한 장비-셀 추출 물 및 단백질 합성 반응을 시험관에서 4 일 안에 구현. 광범위 한 응용 프로그램에 대 한이 플랫폼의 유연한 특성을 활용 하 여 우리는 적응 되 고 최적화 될 수 있는 반응 조건 논의.

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

이 프로토콜은 비 전문가에 의한 자기 단백질 합성을 구현하는 방법을 단순화하고 명확히합니다. 이러한 방법에 대한 액세스가 개선되면 플랫폼과 이를 가능하게 하는 광범위한 응용 프로그램 집합의 비장화에 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 속도, 비용 효율성 및 다른 자기 단백질 합성 플랫폼에 비해 설정 된 반응의 용이성입니다.당사의 플랫폼은 기능성 유전체학, 하이토퍼테스트, 바이오 센서, 교육 키트, 사소한 수정, 신진 대사 엔지니어링 및 유전 코드 확장을 포함한 다양한 응용 프로그램을 가능하게 할 수 있습니다. 이 기술은 기본적인 실험실 교육만 필요하지만, 새로운 사용자는 프로토콜의 성공적인 실행을 위해 초음파 처리와 같은 기술에 익숙해할 계획입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 미디어 및 배양 E.coli 세포를 준비합니다.1리터 원심분리기 병을 얼음 수조에 넣습니다. 배양 OD600이 3.0에 도달하면 세포 배양을 차가운 병에 붓습니다. 이중 빔 밸런스를 사용하여 첫 번째 리터 원심분리기 병에 물을 추가하여 원심분리기의 균형을 만듭니다.원심분리기를 섭씨 4도로 미리 냉각한 후 병을 5, 000g, 섭씨 10도에서 10°C로 원심분리하여 세포를 펠릿합니다. 그 후, 천천히 부어 상체를 처분. 세포 펠릿을 얼음 위에 놓습니다.멸균 주걱을 사용하여 원심분리기 병에서 세포 펠릿을 긁어 내고 감기, 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮춥습니다. 2밀리머 DTT로 보충된 30밀리리터의 콜드 S30 버퍼를 추가하고 펠릿이 덩어리없이 완전히 다시 중단될 때까지 얼음에 휴식 기간이 있는 짧은 버스트에서 펠릿을 재연합니다. 그 후, 물로 채워진 또 다른 50mm 원심관을 사용하여 샘플을 원심분리하여 샘플을 5, 000g 및 10도에서 10분간 사용합니다.부어 서상체를 폐기. 차가운 S30 버퍼의 20 ~ 25 밀리리터로 펠릿을 다시 중단합니다. 원심분리기 는 5, 000g, 섭씨 10도에서 10분 동안.부어 서퍼를 폐기하십시오. 그런 다음 S30 버퍼의 30 밀리리터를 추가하고 이전에 설명한 바와 같이 소용돌이를 사용하여 펠릿을 다시 중단합니다. 3 개의 미리 계량, 차가운, 50 밀리 리터 원추형 튜브를 설정합니다.멸균 파이펫이 있는 세로지학적 파이펫 필러를 사용하여 각 튜브에 펠릿 서스펜션 10밀리리터10밀리리터를 표시합니다. 필요에 따라 적절한 균형을 사용하여 모든 튜브를 원심 분리하여 5, 000g 및 섭씨 10도에서 10분 동안 사용할 수 있습니다. 그 후, 부어 초월체를 폐기.각 튜브의 내부를 깨끗한 조직으로 조심스럽게 닦아 접근 버퍼를 제거하는 동시에 펠릿을 만지지 않도록하십시오. 분석 균형을 사용하여 튜브의 무게를 재측정하고 각 튜브의 최종 펠릿 무게를 보고합니다. 시작하려면 각 펠릿에 1 그램의 세포 질량 당 2 밀리모어 DTT가있는 차가운 S30 버퍼 1 밀리리터를 추가하십시오.소용돌이를 사용하여 이전에 설명된 바와 같이 펠릿을 재일시 중단하십시오. 그런 다음 각 재중단 된 펠릿의 1.4 밀리리터를 별도의 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 옮기십시오. 한 튜브를 비커에 얼음 수조에 넣고 튜브의 바닥이나 측면을 만지지 않도록 초음파 프로브를 배치합니다.진폭이 45초 동안 50%로 설정된 후 59초의 휴식으로 튜브를 초음파 처리합니다. 오프 기간 동안 튜브를 닫고 반전해야합니다. 초음파 처리가 완료된 직후, 한 개의 어금니 DTT의 4.5 마이크로리터를 lysate에 추가합니다.튜브를 여러 번 반전하여 혼합한 다음 얼음 위에 놓습니다. 이 과정을 반복하여 각 재중단 된 셀 튜브에 대해 DTT를 초음파 화하고 추가합니다. 18, 000g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다.그 후, 파이펫은 각각 새로운 1.5 밀리리터 미세 센심분리기 튜브로 되어 펠릿이 방해받지 않도록 일부 상퍼를 남겨두고 있습니다. 상체관을 인큐베이터의 흔들리는 플랫폼으로 가져가서 섭씨 37도에서 60분 동안 250RPM에서 흔들어 배양합니다. 이것은 런오프 반응입니다.그런 다음 샘플을 10, 000g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 새로운 튜브로 전송하는 펠릿을 방해하지 않고 각 상체를 제거합니다. 저장을 위해 추출의 많은 100 마이크로 리터 알리쿼트를 만듭니다.첫째, 해동 용액 A, 용액 B, DNA 템플릿, BL21DE3 추출물, T7 RNA 폴리머라제, 및 얼음에 분자 등급물의 알리쿼트. 다음으로 CFPS 반응에 필요한 양의 미세 원심 분리튜브에 라벨을 부착합니다. 각 시약을 파이펫팅이나 소용돌이로 섞은 다음 라벨이 부착된 반응 튜브에 용액을 추가하여 세포 추출물을 소용돌이치지 말고 튜브를 혼합하는 대신 반전하십시오.최종 반응이 잘 혼합되어 있는지 확인하고 각 튜브의 하단에 있는 단일 15 마이크로리터 비드로 결합합니다. 각 반응을 섭씨 37도에서 4시간 동안 또는 하룻밤 사이에 섭씨 30도에서 흔들지 않고 배양합니다. 시작하려면, 96 웰 플레이트를 얻고 정량화에 필요한 각 우물에 pH 8에서 0.05 어금반 HEPES의 48 마이크로 리터를로드합니다.다음으로, 인큐베이터에서 반응 튜브를 제거합니다. 각 반응을 위아래로 배관하여 혼합하고 각 반응의 두 마이크로리터를 HEPES를 포함하는 우물로 옮킨다. 위아래로 파이프를 통해 각 잘 섞는다.모든 반응이 적재되고 혼합된 후, 플레이트를 형광계에 적재하고 485나노미터의 내분 파장과 510나노미터의 방출 파장을 사용하여 SFGFP 종점 형광을 측정한다. 이전에 생성된 표준 곡선을 사용하여 얻어진 형광소 판독값으로부터 초폴더GFP의 농도를 결정합니다. 이 연구에서는 초음파 처리 기반의 대장균 추출물 제제를 조사합니다.세포 펠릿과 세포 추출물은 적어도 1 년 동안 음수 80도에서 안정적입니다. 또한, 세포 추출물은 생산성의 상당한 손실없이 적어도 5 개의 동결 해동 주기를 겪을 수 있습니다. 이 프로토콜 내의 일부 단계는 시스템의 전반적인 생산성에 해를 주지 않으면서 다양할 수 있습니다.특히, 세포는 세포 추출물 생산성에 큰 영향을 미치지 않고 600나노미터에서 2.7 내지 4.0 광밀도범위 내에서 수확될 수 있다. 그러나, 템플릿 DNA 품질은 CFPS 반응의 체적 수율에 영향을 미치는 배치 대 배치 가변성의 원천입니다. 이것은 추가 DNA 정화 단계 뒤에 미디 또는 맥시프를 통해 DNA를 정화하여 해결됩니다.반응 용기는 또한 CFPS 반응의 체적 수율에 영향을 미칩니다. 표면적대 체적 비율이 증가하면 체적 수율이 높아진다. CFPS 반응의 체적 수율을 최적화하고 세포 추출물 배치 대 배치 가변성을 줄이기 위해 각 새로운 추출물 준비에 대해 마그네슘 티티네이션을 수행해야 합니다.밀리리터 총 단백질당 30밀리그램으로 구성된 세포 추출물의 경우, 시약 사용을 최소화하고 체피 수율을 최대화하기 위한 최적의 마그네슘 농도 및 추출물 량은 각각 10밀리몰러와 5마이크로리터입니다. 반응 규모를 변화시킴으로써, 사용자는 높은 처리량 스크리닝에서 표적 단백질의 더 큰 규모의 발현에 이르는 방법을 추구할 수 있다. 이 기술은 두 가지 주요 장점을 제공, 먼저 그것은 단백질 제품을 보다 빠르게 화면, 둘째, 그것은 단백질을 표현 하기 어려운 합성.예를 들면 세포 독성 또는 그들의 기능에 대 한 산화 조건을 필요로 하는 단백질을 포함. 모든 실험실 절차와 마찬가지로 모든 시약은 주의해서 처리되어야 합니다. 또한 원심 분리기는 항상 균형을 유지해야하며 초음파 처리 중에 귀 보호기능을 사용해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Particles without a Box: Brush-first Synthesis of Photodegradable PEG Star Polymers under Ambient Conditions

상자없이 입자 : 주위 조건에서 광분해 성 고분자 PEG 브러쉬 최초의 합성

Convenient methods for the rapid, parallel synthesis of diversely functionalized nanoparticles will enable discovery of novel formulations for drug ...

연구

화학

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

기능화의 합성 및 특성 금속 - 유기 프레임 워크

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis of Poly(N-isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Synthesis of PolyN-isopropylacrylamide Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

폴리의 합성 (<em&gt; N</em&gt; 이소 프로필 아크릴 아미드) 이방성 열 응답 성 및 유기화 / 친수성로드 기능에 대한 야누스 Microhydrogels

Janus microparticles are compartmentalized particles with differing molecular structures and/or functionality on each of their two sides. Because of this ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

생선 기름 보충제의 지질 프로필의 신속한 평가를위한 강력한 도구로 NMR 분광학

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

코어-쉘 란타넘족 실수로 업 나노 세포 응용 프로그램의 합성

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

Chemical Synthesis of Porous Barium Titanate Thin Film and Thermal Stabilization of Ferroelectric Phase by Porosity-Induced Strain

바 륨 다공성 타이타늄 박막 및 다공성 유도 된 긴장에 의해 Ferroelectric 단계의 열 안정화의 화학 합성

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

반도체 Gyroidal 금속-황 프레임 워크의 결정 화에 대 한 Thiol 빌딩 블록의 합성

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

단백질 정화에 대 한 Poly(pentafluorophenyl acrylate) 기능성 SiO2 구슬의 준비

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...