Name: escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology
Uploaded: 2019-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Forfattere ønsker å erkjenne Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher, og Tony Turretto kundestøtte, Wesley Kao, Layne Williams og Christopher Hight for nyttig diskusjoner. Forfatterne også erkjenner finansiering støtte fra Bill og Linda Frost fondet, senter for programmer i Bioteknologis Chevron bioteknologi brukt legat forskningsstipend, Cal Poly forskning, Scholarly og kreative aktiviteter Grant Program (RSCA 2017), og National Science Foundation (NSF-1708919). MZL erkjenner California State University Graduate stipendet. MCJ erkjenner den Army Research Office W911NF-16-1-0372, gir National Science Foundation kalt MCB-1413563, kalt MCB-1716766 og den Luftforsvaret forskning laboratorium Center for Excellence Grant FA8650-15-2-5518, forsvar trussel reduksjon Agency stipendet HDTRA1-15-10052/P00001, David and Lucile Packard Foundation, Camille Dreyfus lærer-forsker programmet, Institutt for energi BER Grant DE-SC0018249, programmet for menneskelig grenser Science (RGP0015/2017), DOE Joint Genome Institute ETOP Grant, og Chicago biomedisinsk konsortiet med støtte fra Searle midlene i Chicago samfunnet Trust for støtte.

1. Media forberedelse og cellevekst
<ol><li>
Dag 1
	<ol>
<li>Strek E. coli BL21*(DE3) celler fra en glyserol lager på en LB agar plate og ruge minst 18 h på 37 ° C.</li>
		<li>Forbered 50 mL av LB media og autoklav løsningen på en flytende syklus i 30 min på 121 ° C. Lagre ved romtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dag 2
	<ol>
<li>Forberede 750 mL av 2 x YTP media og 250 mL 0,4 M D-glukose løsning som beskrevet i tilleggsinformasjon.</li>
		<li>Hell 2 x YTP media i en ...

Cellen gratis proteinsyntese har dukket opp som en kraftig og aktivere teknologi for en rekke applikasjoner, fra biomanufacturing til rask prototyping biokjemiske systemer. Bredden av programmer støttes av evnen til å overvåke, manipulere og øke cellulære maskiner i sanntid. Til tross for den voksende effekten av denne plattform-teknologi, bred tilpasning har vært langsom på grunn av tekniske nyansene i gjennomføringen av metodene. Gjennom dette arbeidet, som mål å tilby enkelhet og klarhet for å etablere denn...

Cellen gratis Protein syntese (CFPS) har dukket opp som en teknologi som har låst opp en rekke nye muligheter for protein produksjon, funksjonell genomforskning, metabolske engineering og mer i de siste 50 år1,2. Sammenlignet med standard i vivo protein uttrykk plattformer, CFPS gir tre viktige fordeler: 1) cellen-fri natur plattformen gjør produksjonen av proteiner som ville være potensielt giftig eller utenlandske til celle3,4 ,5,6; 2) inaktivering av genomisk DNA og innføring av en mal DNA koding gene(s) rundt kanalen alle systemisk energien i reaksjonen til produksjon av protein(s) steder. og 3) den åpne naturen plattformen gjør det mulig å endre og overvåke reaksjonen forhold og komposisjon i sanntid7,8. Denne direkte tilgang til reaksjonen støtter augmentation av biologiske systemer med utvidet kjemikalier og redoks forholdene for produksjon av romanen proteiner og tuning av metabolske prosesser2,9, 10. direkte tilgang gir også brukeren å kombinere CFPS reaksjon med aktivitet analyser i et enkelt-potten system for rask utformingen-bygge-test sykluser11. Kapasitet til å utføre CFPS reaksjonen i små dråper eller på papir-baserte enheter videre støtter høy gjennomstrømming oppdagelsen innsats og rask prototyping12,13,14,15 ,16. Disse fordelene og plug and play natur systemet, CFPS har unikt aktivert en rekke bioteknologi programmer som produksjonen av proteiner som er vanskelige å solubly express i vivo17, 18,19,20, påvisning av sykdom21,22,23, på etterspørsel biomanufacturing18,24 ,25,26,27, og utdanning28,29, som viser fleksibilitet og nytten av celle-fri plattformen.
CFPS systemer kan genereres fra en rekke råolje lysates fra både prokaryotic og eukaryotic linjer. Dette gir forskjellige alternativer i systemet av valg, hver har fordeler og ulemper avhengig av anvendelsen av interesse. CFPS systemer også variere i Forberedelsestid, kostnader og produktivitet. De benyttes vanligvis celle ekstrakter produseres fra hvetespirer, kanin retikulocytt, insekt celler og Escherichia coli celler, sistnevnte er den mest kostnadseffektive hittil mens de høyeste volumetriske gir protein30 . Mens andre CFPS systemer kan være fordelaktig for medfødte post-translasjonell modifikasjon maskiner, nye programmer ved hjelp av E. coli-baserte maskiner kan bygge bro ved å generere site-specifically fosforylert og Glycosylated proteiner på etterspørsel,31,,32,,33,,34,,35.
CFPS reaksjoner kan kjøres i enten bakst, kontinuerlig-utveksling celle-free (CECF) eller kontinuerlig flyt celle-fritt (CFCF) format. Batch-format er et lukket system som reaksjon levetid er begrenset på grunn av avtagende mengder reaktantene og akkumulering av hemmende biprodukter av reaksjonen. CECF og CFCF øke levetiden til reaksjonen og føre dermed til økt volumetriske protein gir sammenlignet med satsvise reaksjonen. Dette gjøres ved at biprodukter av proteinsyntese fjernes fra reaksjonen fartøyet mens nye reaktantene leveres i løpet av reaksjon2. Når det gjelder CFCF, kan protein rundt også fjernes fra reaksjon kammer, i CECF, protein av interesse i reaksjon kammeret består av et halvt gjennomtrengelig membran36,37. Disse metodene er spesielt nyttig i å overvinne dårlig volumetriske gir vanskelig-å-uttrykker proteiner av interesse38,39,40,41,42, 43. Utfordringene med å implementere CECF og CFCF tilnærminger er at 1) mens de resultere i mer effektiv bruk av bio maskiner ansvarlig for transkripsjon og oversettelse, de krever spesielt større mengder reagenser som øker totalkostnad og 2) de krever mer komplekse reaksjon oppsett og spesialisert utstyr forhold til satsvise format44. For å sikre tilgjengelighet for nye brukere, beskrevet protokollene heri fokus på batch-format på reaksjon mengder 15 µL med konkrete anbefalinger for å øke volumet reaksjon til milliliter skala.
Metodene presenteres her at ikke-eksperter med grunnleggende laboratorium ferdigheter (for eksempel studentene) kan implementere cellevekst, ekstra forberedelse og satsvis format reaksjon installasjon for en E. coli-basert CFPS system. Denne tilnærmingen er kostnadseffektiv sammenlignet kommersielt tilgjengelig kits uten å ofre enkel kit-baserte reaksjon oppsett. Videre lar denne tilnærmingen programmer i laboratoriet, og i feltet. Når beslutter å implementere CFPS, bør nye brukere grundig vurdere effekten av konvensjonelle protein uttrykk for oppstart investeringer, som CFPS ikke kan bli bedre i alle tilfeller. CFPS metodene beskrevet her at brukeren direkte implementere en rekke programmer, inkludert funksjonell genomforskning, høy gjennomstrømming testing, produksjonen av proteiner som er vanskelige for i vivo uttrykk, i tillegg til feltet programmer inkludert biosensors og pedagogisk kits for syntetisk biologi. Tilleggsprogrammer som metabolske engineering, tuning av protein uttrykk forhold, sykdom gjenkjenning og skalere opp bruke CECF eller CFCF er fortsatt mulig, men kan kreve erfaring med CFPS plattform for videre modifikasjon av reaksjon forhold. Våre metoder kombinere vekst i beriket media og forvirret flasker, med relativt rask og reproduserbar metoder for cellen lysis gjennom sonication, etterfulgt av en forenklet CFPS reaksjon oppsett som utnytter optimalisert premixes45. Mens metodene mobilnettet vekst har blitt noe standardisert innen dette feltet, varierer metoder for cellen lysis mye. I tillegg til sonication omfatter felles lysis metoder bruk av en fransk trykk, en homogenizer, perle beaters, eller lysozyme og andre biokjemiske og fysiske avbrudd metoder46,47,48, 49. bruke våre metoder, ca 2 mL olje celle pakke hentes per 1 L celler. Dette antallet av cellen ekstrakt kan støtte fire hundre 15 µL CFPS reaksjoner, hver produserende ~ 900 µg/mL reporter sfGFP protein fra malen plasmider pJL1-sfGFP. Denne metoden koster $0.021/µg av sfGFP produsert ($.019/µL av reaksjonen), unntatt arbeidskraft og utstyret (supplerende figur 1). Denne metoden starter fra scratch, kan implementeres i 4 dager ved en enkelt person, og gjenta CFPS reaksjoner kan fullføres innen timer (figur 1). I tillegg kan protokollen skaleres i volumet for større batcher av forberedelse av reagenser etter brukerens behov. Viktigere, kan protokollen presenteres her implementeres av laboratoriet trent ikke-eksperter som studenter, som det bare krever grunnleggende laboratorium ferdigheter. Fremgangsmåtene nedenfor og på videoen har blitt spesielt utviklet for å forbedre tilgjengeligheten av E. coli CFPS plattform for bred bruk.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">12795027</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60353-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P9791-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">KOH</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IPTG</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(OAc)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tris(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DTT</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">tRNA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Folinic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NTPs</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Oxalic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NAD</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CoA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PEP</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NH4(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">02180595.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(Glu)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Spermidine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Molecular Grade Water</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Aspartic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Valine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Alanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Arginine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Asparagine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Glycine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Histadine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Proline</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Serine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tyrosine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ultrasonic Processor</td>
			<td style="width:145px;">QSonica</td>
			<td style="width:123px;">Q125-230V/50Hz</td>
			<td>3.175 mm diameter probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1L Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microfuge 20</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cytation 5</td>
			<td style="width:145px;">BioTek</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Strep-Tactin XT Starter Kit</td>
			<td style="width:145px;">IBA</td>
			<td style="width:123px;">2-4998-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">pJL1-sfGFP</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:145px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over de siste 50 årene, Cell-Free Protein syntese (CFPS) har dukket opp som en kraftig teknologi for å utnytte av transcriptional og translasjonsforskning antall celler i et reagensrør. Obviating behovet for å opprettholde levedyktigheten til cellen, og eliminere mobilnettet barrieren, er CFPS fundamentet til emerging programmer i biomanufacturing av tradisjonelt utfordrende proteiner, samt programmer i rapid prototyping for Metabolsk engineering og funksjonell genomforskning. Våre metoder for å implementere en E. coli-basert CFPS plattform at nye brukere tilgang til mange av disse programmene. Her beskriver vi metoder for å forberede pakke ved bruk av beriket medier, forbløffe flasker og en reproduserbar metode for tunable sonication-baserte celle lysis. Dette ekstrakt kan deretter brukes til protein uttrykk kan produsere 900 µg/mL eller flere super mappen grønne fluorescerende protein (sfGFP) i bare 5 timer fra experimental oppsettet til dataanalyse, gitt at riktig reagens aksjer er utarbeidet på forhånd. Anslått oppstart prisen for innhenting reagenser er $4500 som vil opprettholde tusenvis av reaksjoner til en estimert kostnad på $0.021 per µg protein produsert eller $0.019 per µL av reaksjonen. I tillegg speilet metodene protein uttrykk enkel reaksjon oppsettet i kommersielt tilgjengelige systemer på grunn av optimalisering av reagens pre mikser, til en brøkdel av prisen. For å aktivere brukeren å utnytte CFPS plattformen bred Søknadsfrist fleksibel natur, har vi identifisert en rekke aspekter av plattformen som kan innstilt og optimalisert avhengig av tilgjengelige ressurser og protein uttrykk utfall ønsket.

Vi har presentert en sonication-baserte E. coli ekstrakt forberedelse protokoll som kan gjennomføres over en firedagers, med figur 1 demonstrere fremgangsmåter for nedbryting over hver dag. Det er malleability til fremgangsmåten som kan gjennomføres på hver dag med ulike pause poeng, men vi har funnet denne arbeidsflyten til å være den mest effektive kjøre. I tillegg både celle pellets (trinn 1.3.18) og fullt forberedt ekstrakt (trinn 2.10) ...

Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-basert Cell-Free proteinsyntese: protokoller for en robust, fleksibel og tilgjengelig plattform-teknologi

Denne protokollen detaljer trinn, kostnader, og nødvendig å generere E. coliutstyr-basert celle ekstrakter og implementere i vitro protein syntese reaksjoner innen 4 dager eller mindre. For å utnytte denne plattformen bred Søknadsfrist fleksibel natur, diskutere vi reaksjonen forhold som kan tilpasses og optimalisert.

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Denne protokollen forenkler og klargjør metodene for å implementere selvreproteinsyntese av ikke-eksperter. Forbedret tilgang til disse metodene vil bidra til å demarketize plattformen og det brede settet av programmer som den muliggjør. De viktigste fordelene med denne teknikken er hastigheten, kostnadseffektiviteten og brukervennligheten satt opp sammenlignet med andre selvreproteinsynteseplattformer.Vår plattform kan muliggjøre en rekke bruksområder, inkludert funksjonell genomikk, hythopertesting, biosensorer, pedagogiske sett, og med mindre modifikasjoner, metabolsk engineering og genetisk kodeutvidelse. Selv om denne teknikken bare krever grunnleggende laboratorieopplæring, bør nye brukere planlegge å gjøre seg kjent med teknikker som sonikering for vellykket gjennomføring av protokollen. For å starte denne prosedyren forberede alle medier og kultur E.coli celler som beskrevet i tekstprotokollen.Legg en en liter sentrifugeflaske i et isvannbad. Når kulturene OD600 når 3,0, hell cellekulturen i den kjølte flasken. Ved hjelp av en dobbel strålebalanse, tilsett vann til en annen en liter sentrifugeflaske til den veier det samme som den første for å skape en balanse for sentrifugen.Etter forhåndskjøling av sentrifugen til fire grader Celsius, sentrifuger flaskene ved 5, 000 g og ved 10 grader Celsius i 10 minutter for å pellet cellene. Etter dette, hell sakte av og kast overnatanten. Plasser cellepelleten på isen.Bruk en steril slikkepott skrape cellepellet ut av sentrifugeflasken og overføre den til et kaldt, 50 milliliter konisk rør. Tilsett 30 milliliter kald S30 buffer supplert med to millimolar DTT og resuspend pellet ved vortexing i korte utbrudd med hvileperioder på is til pellet er helt resuspended uten biter. Etter dette, bruk en annen 50 millimeter konisk rør fylt med vann som en balanse for å sentrifuge prøven på 5, 000 g og 10 grader Celsius i 10 minutter.Hell av og kast overnatanten. Resuspend pellet med 20 til 25 milliliter kald S30 buffer. Sentrifuge ved 5, 000 g og ved 10 grader Celsius i 10 minutter.Hell ut og kast overnatanten. Deretter legger du til 30 milliliter S30-buffer og bruker pelleten på nytt ved hjelp av en virvel som tidligere beskrevet. Sett ut tre pre-veid, kald, 50 milliliter koniske rør.Ved hjelp av et serologisk pipettefyll med en steril pipette, aliquot ti 10 milliliter pellet suspensjon i hvert rør. Sentrifuge alle rørene ved hjelp av passende balanserer etter behov ved 5, 000 g og 10 grader Celsius i 10 minutter. Etter dette, hell ut og kast supernativa.Tørk forsiktig av innsiden av hvert rør og hette med et rent vev for å fjerne tilgangsbufferen, samtidig som du må unngå å berøre pelleten. Ved hjelp av en analytisk balanse, reweigh rørene og rapportere den endelige pellet vekt for hvert rør. Til å begynne, legg til en milliliter kald S30 buffer med 2 millimolar DTT per ett gram cellemasse til hver pellet.Bruk en virvel til å gjenbruke pellets som tidligere beskrevet. Deretter overfører du 1,4 milliliter av hver gjenbrukt pellet til separate 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Plasser ett rør i et isvannbad i et beger og plasser sonicator-sonden slik at den ikke berører bunnene eller sidene av røret.Sonicate røret med amplituden satt til 50%for 45 sekunder, etterfulgt av 59 sekunder hvile. Pass på å lukke og invertere rørene i av-periodene. Umiddelbart etter at sonikering er fullført, legg til 4,5 mikroliter av en molar DTT i lysatet.Inverter røret flere ganger for å blande og legg det deretter på is. Gjenta denne prosessen, sonikere og legge til DTT for hvert rør av resuspended celler. Sentrifuger prøvene ved 18, 000 g og fire grader Celsius i 10 minutter.Etter dette, pipette hver supernatant i en ny 1,5 milliliter Microcentrifuge rør, forlater noen supernatant bak for å sikre pellet ikke er forstyrret. Ta rørene av supernatant til risting plattform av en inkubator og inkubere dem på 37 grader Celsius med risting på 250 RPM i 60 minutter. Dette er avrenningsreaksjonen.Deretter sentrifugere prøvene på 10.000 g og ved fire grader Celsius i 10 minutter. Fjern hver supernatant uten å forstyrre pellet overføre dem til nye rør. Lag mange 100 mikroliter aliquots av ekstraktet for lagring.Først tine løsning A, løsning B, DNA-malen, BL21DE3 ekstrakt, T7 RNA Polymerase, og en aliquot av molekylært vann på is. Deretter merker du den nødvendige mengden mikrocentrifugerør som trengs for CFPS-reaksjonen. Bland hver reagens ved å pipettering eller vortexing, og legg deretter løsningen til det merkede reaksjonsrøret, og pass på å ikke virvle celleekstraktet, men i stedet invertere røret for å blande.Sørg for at den endelige reaksjonen er godt blandet og kombineres i en enkelt 15 mikroliter perle nederst på hvert rør. Inkuber hver reaksjon uten å riste ved 37 grader Celsius i fire timer, eller ved 30 grader Celsius over natten. Til å begynne med må du få en 96 brønnplate og laste 48 mikroliter på 0,05 molar HEPES ved pH 8 inn i hver brønn som trengs for kvantifisering.Deretter fjerner du reaksjonsrørene fra inkubatoren. Bland hver reaksjon ved å pipetter opp og ned og overfør to mikroliter av hver reaksjon inn i brønnene som inneholder HEPES. Bland hver brønn ved å pipetter opp og ned.Etter at alle reaksjonene er lastet og blandet, last platen inn i et fluorometer og mål SFGFP endepunkt fluorescerende ved hjelp av en eksitasjon bølgelengde på 485 nanometer og en utslipp bølgelengde på 510 nanometer. Bruk en tidligere generert standardkurve for å bestemme konsentrasjonen av superfoldet GFP fra den oppnådde fluorescerende avlesningen. I denne studien undersøkes et sonikeringsbasert E.coli ekstraktpreparat.Cellepellets og celleekstrakt er stabile ved negative 80 grader Celsius i minst et år. I tillegg kan celleekstraktet gjennomgå minst fem fryse-tine sykluser uten et betydelig tap av produktivitet. Noen trinn i denne protokollen kan varieres uten skade på systemets generelle produktivitet.Spesielt kan celler høstes innenfor området 2,7 til 4,0 optisk tetthet ved 600 nanometer uten en betydelig effekt på celleekstraktproduktiviteten. Mal-DNA-kvalitet er imidlertid en kilde til batch-to-batch-variasjon som påvirker volumetriske utbytter av CFPS-reaksjonen. Dette løses ved å rense DNA via en Midi eller Maxiprep etterfulgt av et ekstra DNA opprydding trinn.Reaksjonsbeholderen påvirker også volumetriske utbytter av CFPS-reaksjonen. En økning i overflateareal til volumforhold, resulterer i høyere volumetriske utbytter. For å optimalisere volumetriske utbytter av CFPS-reaksjonen og for å redusere celleekstrakt batch-til-batch-variasjon, bør en magnesiumtitrering utføres for hvert nytt ekstraktpreparat.For celleekstrakter som består av 30 milligram per milliliter totalt protein, er den optimale magnesiumkonsentrasjonen og ekstraktvolumet for å minimere reagensbruk og maksimere volumetrisk utbytte henholdsvis 10 millimolar og fem mikroliter. Ved å variere reaksjonsskalaen kan brukerne forfølge metoder som spenner fra høy gjennomstrømningsscreening til større uttrykk for et målprotein. Denne teknikken gir to viktige fordeler, først det skjermer proteinprodukter raskere, og for det andre syntetiserer det vanskelig å uttrykke proteiner.Eksempler inkluderer proteiner som er cytotoksiske eller krever oksiderende forhold for deres funksjon. Som med enhver laboratorieprosedyre, bør alle reagenser behandles med forsiktighet. I tillegg bør sentrifuger alltid balanseres og ørebeskyttelse bør brukes under sonikering.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Particles without a Box: Brush-first Synthesis of Photodegradable PEG Star Polymers under Ambient Conditions

Partikler uten en boks: Brush-første Syntese av Fotonedbrytbar PEG-stjerners Polymers under omgivelsene

Convenient methods for the rapid, parallel synthesis of diversely functionalized nanoparticles will enable discovery of novel formulations for drug ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Syntese og karakterisering av funksjon Metal-organisk Rammeverk

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis of Poly(N-isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Synthesis of PolyN-isopropylacrylamide Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Syntese av poly (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-respons og Organofilt / Hydrofilt Laster Capability

Janus microparticles are compartmentalized particles with differing molecular structures and/or functionality on each of their two sides. Because of this ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntese og karakterisering av supra Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese av Protein Bioconjugates<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimide kjemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

NMR spektroskopi som et robust verktøy for rask evaluering av Lipid profil av fiskeolje kosttilskudd

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Syntese av Core-shell transisjonsmetall-dopet Upconversion nanokrystaller for mobil-programmer

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

Chemical Synthesis of Porous Barium Titanate Thin Film and Thermal Stabilization of Ferroelectric Phase by Porosity-Induced Strain

Syntese av porøse Barium Titanate tynn Film og termisk stabilisering av Ferroelectric fase av porøsitet-indusert stamme

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

Syntese av en Thiol byggestein for krystallisering av en Semiconducting Gyroidal Metal-svovel-ramme

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Utarbeidelse av Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 perler for Protein rensing

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...