Name: escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology
Uploaded: 2019-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Autores gostaria de reconhecer o Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher e Tony Turretto para suporte técnico, Wesley Kao, Layne Williams e Christopher Hight para debates úteis. Os autores reconhecem também apoio financeiro do Bill e fundo de Frost Linda, centro para aplicações em Chevron biotecnologia aplicada pesquisa Endowment Grant da biotecnologia, Cal Poly pesquisa, publicações e programa de concessão de actividades criativas (2017 RSCA), e a National Science Foundation (NSF-1708919). MZL reconhece a Califórnia estado Universidade pós-graduação Grant. MCJ reconhece o escritório da pesquisa da exército W911NF-16-1-0372, National Science Foundation concede MCB-1413563 e MCB-1716766, a força aérea pesquisa laboratório centro de excelência Grant FA8650-15-2-5518, a concessão de agência de redução de ameaça de defesa HDTRA1-15-10052/P00001, o David e Lucile Packard Foundation, o programa de professor erudito Camille Dreyfus, o departamento de energia BER Grant DE-SC0018249, o programa de ciência humana fronteiras (RGP0015/2017), a concessão ETOP DOE Joint Genome Institute, e o consórcio biomédica de Chicago com o apoio dos fundos Searle no Chicago comunidade Trust para apoio.

1. meios preparação e crescimento celular
<ol><li>
Dia 1
	<ol>
<li>Células de Escherichia coli BL21*(DE3) raia de glicerol um estoque em uma placa de ágar LB e incubam durante pelo menos 18 h a 37 ° C.</li>
		<li>Prepara-se 50 mL de LB mídia e autoclave a solução em um ciclo de líquido por 30 min a 121 ° C. Armazenar em temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dia 2
	<ol>
<li>Prepare 750 mL de 2 x YTP mídia e 250 mL de solução de 0,4 M D-glicose como descrita...

Síntese de proteína sem célula tem emergido como uma tecnologia poderosa e propício para uma variedade de aplicações que vão desde biomanufacturing para prototipagem rápida de sistemas bioquímicos. A gama de aplicativos é compatível com a capacidade de monitorar, manipular e aumentar a maquinaria celular em tempo real. Apesar do impacto em expansão desta tecnologia de plataforma, manteve-se ampla adaptação lento devido a nuances técnicas na implementação dos métodos. Através desse esforço, pretendemos...

Síntese de proteína sem célula (CFPS) surgiu como uma tecnologia que desbloqueou uma série de novas oportunidades para a produção de proteína, genómica funcional, engenharia metabólica e muito mais no âmbito do último 50 anos1,2. Comparado ao padrão na vivo plataformas de expressão de proteínas, CFPS fornece três vantagens principais: 1) a natureza sem célula da plataforma permite a produção de proteínas que seriam potencialmente tóxicos ou estrangeiros para a célula3,4 ,5,6; 2) inativação do DNA genômico e a introdução de um modelo de DNA os genes de interesse de codificação canalizar toda a energia sistêmica dentro da reação para a produção das somáticas de interesse; e 3) a natureza aberta da plataforma permite ao usuário modificar e monitorar as condições da reação e a composição em tempo real7,8. Esse acesso direto para a reação suporta o aumento dos sistemas biológicos com químicos expandidos e redox as condições para a produção de novas proteínas e a otimização de processos metabólicos2,9, 10. direto acesso também permite ao usuário combinar a reação CFPS com ensaios de atividade em um sistema de single-pote para teste de compilação de projeto mais rápido ciclos de11. A capacidade de realizar a reação de CFPS em gotas de pequeno volume ou em dispositivos baseados em papel mais suporta os esforços de descoberta do elevado-throughput e prototipagem rápida12,13,14,15 ,16. Como resultado destas vantagens e da natureza de plug and play do sistema, CFPS excepcionalmente permitiu uma variedade de aplicações da biotecnologia tais como a produção de proteínas que são difíceis de solubly expresso na vivo17, 18,19,20, detecção de22,doença21,23, na demanda biomanufacturing18,24 ,25,26,27e educação28,29, os quais mostram a flexibilidade e a utilidade da plataforma livre de célula.
Sistemas CFPS podem ser gerados a partir de uma variedade de bruto lysates de ambas as linhas de células procariotas e eucariotas. Isto permite diversas opções no sistema de escolha, cada uma delas tem vantagens e desvantagens, dependendo da aplicação de juros. Sistemas CFPS também variam muito em produtividade, custo e tempo de preparação. Os mais comumente utilizaram célula extratos são produzidos a partir de células de Escherichia coli , sendo o último mais cost-effective para data ao produzir no mais alto rendimento volumétrico da proteína30, Reticulócito coelho, células de inseto e germe de trigo . Enquanto outros sistemas CFPS podem ser vantajosos para suas máquinas de modificação pós-traducional inata, emergentes aplicações usando o Escherichia coli-baseado em máquinas são capazes de preencher a lacuna, gerando site-specifically fosforilada e glicosilados proteínas na demanda31,32,33,34,35.
Reações de CFPS podem ser executadas em qualquer lote, troca contínua sem célula (CECF) ou fluxo contínuo sem célula (CFCF) formatos. O formato do lote é um sistema fechado, cujo tempo de vida de reação é limitado devido à diminuição de quantidades de reagentes e o acúmulo de subprodutos inibitórios da reação. CECF CFCF métodos aumentam o tempo de vida da reação e, assim, resultam em aumento volumétrico proteína rendimentos em comparação com a reação do lote. Isso é realizado, permitindo que os subprodutos da síntese de proteínas deve ser retirado da embarcação da reação, enquanto novos reagentes são fornecidos durante todo o curso da reação2. No caso de CFCF, a proteína de interesse também pode ser removida da câmara de reação, enquanto no CECF, a proteína de interesse permanece na câmara de reação, composto de uma membrana semi-permeável36,37. Esses métodos são especialmente valiosos na superação pobre rendimento volumétrico de difícil-para-expressam proteínas de interesse38,39,40,41,42, 43. Os desafios na implementação das abordagens CECF e CFCF são que 1) enquanto eles resultam em um uso mais eficiente da maquinaria bio responsável pela transcrição e tradução, necessitam de ser notavelmente maiores quantidades de reagentes que aumenta o custo geral e 2) Eles exigem mais complexa reação de configurações e equipamentos especializados em comparação com o formato de lote44. Para assegurar a acessibilidade para usuários novos, os protocolos descritos foco sobre o formato do lote em volumes de reação de 15 µ l com recomendações específicas para aumentar o volume de reação para a escala de mililitro.
Os métodos aqui apresentados permitem que não-especialistas com habilidades básicas de laboratório (tais como estudantes de graduação) para implementar o crescimento celular, extrair a preparação e instalação de reação de formato de lote para uma Escherichia coli-CFPS sistema baseado. Esta abordagem é rentável em comparação aos kits comercialmente disponíveis sem sacrificar a facilidade de instalação baseado no kit de reação. Além disso, essa abordagem permite que os aplicativos no laboratório e no campo. Ao decidir implementar CFPS, novos usuários devem avaliar cuidadosamente a eficácia dos sistemas de expressão da proteína convencional para investimento de inicialização, como CFPS não pode ser superior em todos os casos. Os métodos CFPS descritos aqui permitem ao usuário diretamente implementar uma variedade de aplicações, incluindo genômica funcional, alta produtividade, a produção de proteínas que são intratáveis por expressão em vivo , bem como campo de teste aplicações, incluindo biosensores e kits educativos para biologia sintética. Aplicações adicionais, tais como a engenharia metabólica, ajuste das condições de expressão de proteínas, doença detecção e aumentar usando métodos CECF ou CFCF ainda são possíveis, mas podem exigir a experiência com a plataforma CFPS de modificações adicionais de reação condições. Nossos métodos combinam crescimento em meios enriquecidos e frascos perplexos, com métodos relativamente rápidos e reprodutíveis de lise celular através de sonication, seguido de uma configuração simplificada de reação CFPS que utiliza premixes otimizado45. Enquanto os métodos de crescimento celular tem tornar-se um pouco padronizados dentro deste campo, métodos para lise celular variam amplamente. Além de sonication, métodos comuns de Lise incluem a utilização de uma imprensa francesa, um homogenizador, batedores do grânulo, ou lisozima e outras perturbações físicas e bioquímicas métodos46,,47,48, 49. usando nossos métodos, cerca de 2 mL de extrato bruto de celular são obtidos por 1 L de células. Esta quantidade de extrato celular pode oferecer suporte a quatrocentos 15 reações de CFPS µ l, cada produção ~ 900 µ g/mL de proteína de sfGFP repórter do modelo do plasmídeo pJL1-sfGFP. Esse método custa $0,021 / µ g de sfGFP produzido ($.019 / µ l de reação), excluindo o custo de mão de obra e equipamentos (Supplemental Figura 1). A partir do zero, este método pode ser implementado em 4 dias por uma única pessoa e repita as reações CFPS podem ser concluídas dentro de horas (Figura 1). Além disso, o protocolo pode ser escalado em volume para lotes maiores de preparação dos reagentes para atender às necessidades do usuário. Importante, o protocolo aqui apresentado pode ser implementado pelo laboratório treinado não-especialistas como alunos de graduação, pois só requer habilidades básicas de laboratório. Os procedimentos descritos abaixo e o de acompanhamento foram especificamente desenvolvidos para melhorar a acessibilidade da plataforma CFPS Escherichia coli para uso amplo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">12795027</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60353-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P9791-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">KOH</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IPTG</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(OAc)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tris(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DTT</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">tRNA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Folinic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NTPs</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Oxalic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NAD</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CoA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PEP</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NH4(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">02180595.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(Glu)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Spermidine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Molecular Grade Water</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Aspartic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Valine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Alanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Arginine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Asparagine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Glycine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Histadine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Proline</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Serine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tyrosine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ultrasonic Processor</td>
			<td style="width:145px;">QSonica</td>
			<td style="width:123px;">Q125-230V/50Hz</td>
			<td>3.175 mm diameter probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1L Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microfuge 20</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cytation 5</td>
			<td style="width:145px;">BioTek</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Strep-Tactin XT Starter Kit</td>
			<td style="width:145px;">IBA</td>
			<td style="width:123px;">2-4998-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">pJL1-sfGFP</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:145px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Nos últimos 50 anos, a síntese de proteína sem célula (CFPS) emergiu como uma poderosa tecnologia para aproveitar a capacidade transcricional e translacional de células dentro de um tubo de ensaio. Por obviating a necessidade de manter a viabilidade da célula e eliminando a barreira celular, CFPS tem sido fundamental para aplicações emergentes em biomanufacturing de proteínas tradicionalmente desafiadores, bem como aplicações em prototipagem rápida para engenharia metabólica e genômica funcional. Nossos métodos para implementar um Escherichia coli-baseado em plataforma CFPS permitir que novos usuários acessar muitos desses aplicativos. Aqui, descrevemos os métodos para preparar o extrato com o uso de meios enriquecidos, frascos perplexos e um método reprodutível de lise celular baseado em sonication ajustáveis. Este extrato pode ser usado na expressão de proteínas capaz de produzir 900 µ g/mL ou mais de proteína fluorescente verde super pasta (sfGFP) em apenas 5 h de instalação experimental para análise de dados, dado que os estoques de reagentes apropriados foram preparados antecipadamente. O custo estimado de inicialização de obtenção de reagentes é $4.500 que sustentarão milhares de reações em um custo estimado de US $0,021 por µ g de proteína produzida ou $0,019 por µ l de reação. Além disso, os métodos de expressão de proteínas espelham a facilidade da instalação do reação vista em sistemas comercialmente disponíveis devido à otimização de misturas prévias de reagente, em uma fração do custo. A fim de habilitar o usuário alavancar a natureza flexível da plataforma para aplicações de amplas CFPS, nós identificamos uma variedade de aspectos da plataforma que pode ser ajustado e otimizado dependendo dos recursos disponíveis e os resultados da expressão da proteína desejado.

Apresentamos uma base sonication Escherichia coli extrato de protocolo de preparação que pode ser concluído em um período de quatro dias, com a Figura 1 , demonstrando o esgotamento processual ao longo de cada dia. Há maleabilidade para as etapas que podem ser concluídas em cada dia com vários pontos de pausando, mas encontrámos este fluxo de trabalho para ser o mais eficaz executar. Além disso, ambas as pelotas de célula (etapa 1.3.18) e t...

Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-baseado sem célula de síntese de proteínas: protocolos para uma tecnologia de plataforma robusta, flexível e acessível

Este protocolo detalha as etapas, custos e equipamentos necessários para gerar Escherichia coli-com base em extratos de células e implementar em vitro reações de síntese de proteínas dentro de 4 dias ou menos. Para aproveitar a natureza flexível desta plataforma para aplicações de amplas, podemos discutir as condições de reação que podem ser adaptadas e otimizadas.

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Este protocolo simplifica e esclarece os métodos de implementação da síntese de auto-proteína por não especialistas. O acesso aprimorado a esses métodos ajudará a desmarketizar a plataforma e o amplo conjunto de aplicativos que ela permite. As principais vantagens dessa técnica são a velocidade, o custo-efetividade e a facilidade de reação configurada em comparação com outras plataformas de síntese de auto-proteína.Nossa plataforma pode habilitar uma série de aplicações, incluindo genômica funcional, higominagem, biosensores, kits educacionais e com pequenas modificações, engenharia metabólica e expansão de código genético. Embora essa técnica exija apenas treinamento laboratorial básico, novos usuários devem se familiarizar com técnicas como a sônica para execução bem sucedida do protocolo. Para iniciar este procedimento prepare todas as células de mídia e cultura E.coli, conforme descrito no protocolo de texto.Coloque uma garrafa de centrífugas de um litro em um banho de água gelada. Uma vez que as culturas OD600 atinjam 3.0, despeje a cultura celular na garrafa gelada. Usando um equilíbrio de feixe duplo, adicione água a uma segunda garrafa de centrífugas de um litro até que ele pese o mesmo que o primeiro para criar um equilíbrio para a centrífuga.Depois de pré-resfriamento da centrífuga a quatro graus Celsius, centrifugar as garrafas a 5.000 g e a 10 graus Celsius por 10 minutos para pelotar as células. Depois disso, despeje lentamente e elimine o supernaspe. Coloque a pelota de célula no gelo.Usando uma espátula estéril raspe a pelota celular da garrafa centrífuga e transfira-a para um tubo cônico frio de 50 mililitros. Adicione 30 mililitros de tampão S30 frio suplementado com dois mililitros DTT e resuspenda a pelota por vórtice em rajadas curtas com períodos de descanso no gelo até que a pelota esteja totalmente ressuspendida sem pedaços. Depois disso, use outro tubo cônico de 50 milímetros cheio de água como equilíbrio para centrifugar a amostra a 5.000 g e 10 graus Celsius por 10 minutos.Despeje e elimine o supernatante. Resuspene a pelota com 20 a 25 mililitros de tampão S30 frio. Centrífuga a 5.000 g e a 10 graus Celsius por 10 minutos.Despeje e elimine o supernatante. Em seguida, adicione 30 mililitros de tampão S30 e resuspense a pelota usando um vórtice como descrito anteriormente. Coloque três tubos cônicos pré-pesados, frios, 50 mililitros.Utilizando um enchimento de pipeta sorológico com uma pipeta estéril, aliquot dez 10 mililitros de suspensão de pelotas em cada tubo. Centrifugar todos os tubos usando saldos apropriados conforme necessário a 5.000 g e 10 graus Celsius por 10 minutos. Depois disso, despeje e elimine os supernantes.Limpe cuidadosamente o interior de cada tubo e tampa com um tecido limpo para remover o tampão de acesso, certificando-se de evitar tocar na pelota. Utilizando um equilíbrio analítico, ressunam os tubos e relatam o peso final da pelota para cada tubo. Para começar, adicione um mililitro de tampão S30 frio com 2 mililitros DTT por um grama de massa celular a cada pelota.Use um vórtice para resuspensar as pelotas como descrito anteriormente. Em seguida, transfira 1,4 mililitros de cada pelota resuspended em tubos de microcentrifuge separados de 1,5 mililitro. Coloque um tubo em um banho de água gelada em um béquer e posicione a sonda sonicator de tal forma que não toque na parte inferior ou nas laterais do tubo.Sonicar o tubo com a amplitude fixada em 50% durante 45 segundos, seguido por 59 segundos de descanso. Certificando-se de fechar e inverter os tubos durante os períodos de folga. Imediatamente após a sônicação estiver completa, adicione 4,5 microliters de um DTT molar no lise.Inverta o tubo várias vezes para misturar e, em seguida, colocá-lo no gelo. Repita este processo, sonicando e adicionando DTT para cada tubo de células resuspended. Centrifugar as amostras a 18.000 g e 4 graus Celsius por 10 minutos.Depois disso, pipeta cada supernacido em um novo tubo de microcentrifuge de 1,5 mililitro, deixando alguns supernadíferos para trás para garantir que a pelota não seja perturbada. Leve os tubos de supernaspe para a plataforma de agitação de uma incubadora e incuba-os a 37 graus Celsius com agitação a 250 RPM por 60 minutos. Esta é a reação do segundo turno.Em seguida, centrifugar as amostras a 10.000 g e a quatro graus Celsius por 10 minutos. Remova cada supernante sem perturbar a pelota transferindo-os para novos tubos. Crie muitas alíquotas de 100 microliter do extrato para armazenamento.Primeiro, descongelar a solução A, solução B, o modelo de DNA, o extrato BL21DE3, T7 RNA Polymerase, e uma alíquota de água de grau molecular no gelo. Em seguida, rotule a quantidade necessária de tubos de microcentrifuuge necessários para a reação do CFPS. Misture cada reagente por pipetação ou vórtice, em seguida, adicione a solução ao tubo de reação rotulado, certificando-se de não vórtice do extrato celular, mas, em vez disso, inverter o tubo para misturar.Certifique-se de que a reação final está bem misturada e combine em uma única conta de 15 microliter na parte inferior de cada tubo. Incubar cada reação sem tremer a 37 graus Celsius por quatro horas, ou a 30 graus Celsius durante a noite. Para começar, obtenha uma placa de 96 poços e carregue 48 microliters de 0,05 molar HEPES em pH 8 em cada poço necessário para quantificação.Em seguida, remova os tubos de reação da incubadora. Misture cada reação ao subir e descer e transfira dois microliters de cada reação para os poços que contêm HEPES. Misture cada poço por pipetting para cima e para baixo.Depois de todas as reações serem carregadas e misturadas, carregue a placa em um fluorômetro e meça os fluorescentes de ponto final SFGFP usando um comprimento de onda de excitação de 485 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 510 nanômetros. Use uma curva padrão gerada anteriormente para determinar a concentração de GFP superpastado a partir da leitura fluorescente obtida. Neste estudo, é investigada uma preparação de extrato de E.coli baseada em sônica.As pelotas celulares e o extrato celular estão estáveis a 80 graus Celsius negativos por pelo menos um ano. Além disso, o extrato celular pode sofrer pelo menos cinco ciclos de congelamento sem uma perda significativa de produtividade. Algumas etapas dentro deste protocolo podem ser variadas sem prejuízo da produtividade geral do sistema.Mais notavelmente, as células podem ser colhidas dentro da faixa de 2,7 a 4,0 densidade óptica a 600 nanômetros sem um efeito significativo na produtividade do extrato celular. No entanto, a qualidade do DNA do modelo é uma fonte de variabilidade em lote a lote que impacta os rendimentos volumosos da reação cfps. Isso é resolvido purificando o DNA através de um Midi ou Maxiprep seguido de uma etapa adicional de limpeza de DNA.O vaso de reação também impacta os rendimentos volumosos da reação do CFPS. Um aumento na relação superfície/volume resulta em maiores rendimentos volumosos. Para otimizar os rendimentos volumosos da reação do CFPS e reduzir a variabilidade do extrato celular em lote, deve-se realizar uma titulação de magnésio para cada nova preparação do extrato.Para extratos celulares compostos por 30 miligramas por proteína total mililitro, a concentração ideal de magnésio e o volume de extrato para minimizar o uso de reagentes e maximizar o rendimento volumoso é de 10 mililitros e cinco microliters, respectivamente. Ao variar a escala de reação, os usuários podem buscar métodos que vão desde a triagem de alto rendimento até expressões em escala maior de uma proteína alvo. Esta técnica fornece duas vantagens fundamentais, primeiro ele tela produtos proteicos mais rapidamente, e segundo, sintetiza proteínas difíceis de expressar.Exemplos incluem proteínas que são citotóxicas ou requerem condições oxidantes para sua função. Como em qualquer procedimento laboratorial, todos os reagentes devem ser tratados com cautela. Além disso, as centrífugas devem ser sempre equilibradas e a proteção do ouvido deve ser usada durante a sônicação.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Particles without a Box: Brush-first Synthesis of Photodegradable PEG Star Polymers under Ambient Conditions

Partículas sem Box: Brush-primeiro Síntese de fotodegradáveis ​​PEG Estrelas Polímeros em condições ambientais

Convenient methods for the rapid, parallel synthesis of diversely functionalized nanoparticles will enable discovery of novel formulations for drug ...

Química

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Síntese e caracterização de funcionalizados metal-organic frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis of Poly(N-isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Synthesis of PolyN-isopropylacrylamide Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Síntese de Poli (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels para anisotrópica Thermo-resposta e Organophilic / Carregando Capability hidrofílico

Janus microparticles are compartmentalized particles with differing molecular structures and/or functionality on each of their two sides. Because of this ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Síntese e Caracterização de Supramoleculares Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Síntese de Bioconjugados de proteínas<em&gt; via</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

Espectroscopia de RMN como uma ferramenta robusta para a avaliação rápida do perfil lipídico do óleo de peixes suplementa

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Síntese de Core-shell Lanthanide dopados com nanocristais de Upconversion para aplicativos de celulares

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

Chemical Synthesis of Porous Barium Titanate Thin Film and Thermal Stabilization of Ferroelectric Phase by Porosity-Induced Strain

Síntese química de película fina de titanato de bário porosa e estabilização térmica da fase ferroelétrica pela tensão induzida pela porosidade

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

Síntese de um Bloco de Construção Tiol para a Cristalização de uma Estrutura Semicondutora de Metal-Enxofre com Geometria Giroidal

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparação de Poly(pentafluorophenyl acrylate) acrescida SiO2 grânulos para purificação de proteínas

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...