Name: escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology
Uploaded: 2019-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Авторы хотели бы признать д-р Дженнифер VanderKelen, Андреа Лаубшер и Тони Turretto технической поддержки, Уэсли Kao, Layne Уильямс и Кристофер Hight полезные обсуждения. Авторы также признают финансовой поддержки от Билла и Линда Фрост фонд, центр для приложений в биотехнологии в Chevron биотехнологии применяются исследовательский фонд Грант, Cal Поли исследовательских, научных и творческой деятельности грантовой программы (RSCA 2017), и Национальный научный фонд (NSF-1708919). MZL признает Калифорнийский государственный университет выпускников Грант. MCJ признает армии исследований бюро W911NF-16-1-0372, Национальный научный фонд предоставляет MCB-1413563 и MCB-1716766, военно-воздушные силы исследований лаборатории центра передового опыта Грант FA8650-15-2-5518, обороны угрозы сокращения агентства грант HDTRA1-15-10052/P00001, Дэвида и Люсиль Пакард, Camille Дрейфус преподаватель стипендиат программы, Департамент из энергии BER Грант де SC0018249, человека границ научной программы (RGP0015/2017), Грант ЭТОП DOE Объединенный институт генома, и Чикаго биомедицинских консорциум с поддержкой от Searle фондов в Чикаго доверия сообщества для поддержки.

1. средства массовой информации подготовка и рост клеток
<ol><li>
1 день
	<ol>
<li>Полоска E. coli BL21*(DE3) клетки от глицерина складе на плиту LB агар и проинкубируйте по крайней мере в 18 ч при 37 ° C.</li>
		<li>Подготовка 50 мл LB СМИ и автоклав решение на жидких цикла в течение 30 мин при температ?...

Синтез белков, клеток бесплатно стала мощной и благоприятных технологий для различных приложений, начиная от biomanufacturing быстрое прототипирование биохимических систем. Спектру приложений поддерживают способность контролировать, управлять и увеличить клеточными в режиме реального вре?...

Бесплатный мобильный синтез белка (СЛТ) стала технология, которая разблокирована ряд новых возможностей для производства белка, функциональной геномики, метаболический инжиниринг и более в течение последних 50 лет1,2. По сравнению с стандартным в vivo белка выражение платформ, СЛТ предоставляет три основных преимущества: 1) клетки бесплатный характер платформы позволяет производство белков, которые бы потенциально токсичных или иностранных в ячейке3,4 ,5,6; 2) инактивации геномной ДНК и внедрение шаблона ДНК кодирования gene(s) интерес канал все системные энергии в рамках реакции на производство белки интерес; и 3) открытый характер платформы позволяет пользователю изменять и контролировать условия реакции и композиции в режиме реального времени7,,8. Такой непосредственный доступ к реакции поддерживает увеличение биологических систем с расширенной химия и окислительно-восстановительных условий для производства новых белков и тюнинг метаболических процессов2,9, 10. прямого доступа также позволяет пользователю комбинировать СЛТ реакции с анализов деятельности в системе одного горшок для более быстрого дизайн строить тест циклов11. Способность выполнять СЛТ реакции в малый объем капли или устройств на базе бумаги далее поддерживает усилия обнаружения высокой пропускной способностью и быстрое прототипирование12,13,14,15 ,16. В результате эти преимущества и подключи и играй характер системы, СЛТ однозначно включен разнообразные применения биотехнологии такие как производство белков, которые трудно solubly Экспресс в vivo17, 18,19,20, обнаружение заболевания21,22,23, по требованию biomanufacturing18,24 ,25,26,27и образование28,29, все из которых проявить гибкость и полезность платформы клетки бесплатно.
СЛТ систем могут быть сгенерированы из различных сырой лизатов от обеих линий клеток прокариот и эукариот. Это позволяет для различных вариантов в системе выбор, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки в зависимости от интереса. СЛТ систем также различаются по времени приготовления, стоимости и производительности. Наиболее часто используются ячейки, что экстракты производятся из зародышей пшеницы, кролик ретикулоцитов, насекомое клетки и клетки Escherichia coli , с бытием наиболее экономически эффективных на сегодняшний день при производстве высокий объемный урожайность белка30 . В то время как другие СЛТ системы может быть выгодным для их врожденной столб-поступательные изменения техники, новых приложений с помощью кишечной палочки-на основе техники способны преодолеть разрыв, создавая site-specifically фосфорилированных и гликозилированного белков на спрос31,,3233,34,35.
СЛТ реакции могут выполняться в любом пакете, непрерывный обмен клетки бесплатно (CECF) или непрерывный поток свободных клеток (CFCF) форматы. Формат пакета является закрытой системой, время жизни которого реакции ограничена из-за уменьшения количества реактивов и накопление ингибирующее побочные реакции. Методы CECF и CFCF увеличить время жизни реакции и тем самым привести к повышенной объемной белка урожай по сравнению с пакетной реакции. Это достигается путем предоставления побочных продуктов синтеза белка необходимо удалить из реакции судна, в то время как новые реактивы поставляются в ходе реакции2. В случае CFCF протеин интереса также могут быть удалены из реакционной камеры, в то время как в CECF, протеин интереса остается в реакционной камере, состоящая из36,полупроницаемой мембраны37. Эти методы являются особенно ценными в преодолении бедных объемные урожайности трудно Экспресс белков интерес38,39,40,,4142, 43. Проблемы в реализации CECF и CFCF подходов, что 1) в то время как они приводят к более эффективному использованию механизма био ответственных за транскрипции и трансляции, они требуют особенно больших количеств реагентов, что увеличивает общую стоимость и 2) они требуют более сложных установок реакции и специализированного оборудования, по сравнению с пакетный формат44. Чтобы обеспечить доступность для новых пользователей, протоколы описаного фокус на пакетный формат в реакционных объемов 15 мкл с конкретными рекомендациями для увеличения объема реакции на миллилитр масштаба.
Представленные здесь методы позволяют реализовать рост клеток, извлекать подготовки и пакетная установка реакции формат для е. coliнеспециалистов с основных лабораторных навыков (например, студентов)-на основе системы СЛТ. Этот подход является экономически эффективным по сравнению с коммерчески доступные наборы без ущерба для легкости установки комплекта основе реакции. Кроме того этот подход позволяет приложениям в лаборатории и на местах. При принятии решения о реализации СЛТ, новых пользователей следует тщательно оценить эффективность системах выражения протеина обычных для запуска инвестиций, поскольку СЛТ не могут быть выше в каждом конкретном случае. Описанные здесь методы СЛТ позволяют пользователю напрямую реализовать целый ряд приложений, в том числе функциональной геномики, испытания, производство белков, которые являются неразрешимыми в vivo выражение, а также поле высокой пропускной способности приложения, включая биодатчики и учебных комплектов для синтетической биологии. Дополнительные приложения, такие как метаболический инжиниринг, тюнинг белка выражение условий, обнаружение заболеваний, и масштабирования с помощью методов CECF или CFCF по-прежнему возможны, но может потребовать опыта с платформой СЛТ для дальнейшего изменения реакции условий. Наши методы сочетают в себе рост обогащенного СМИ и озадачен колбы, с относительно быстрым и воспроизводимые методами лизис клеток через sonication, а затем упрощенной установки реакции СЛТ, которая использует оптимизированные премиксы45. Хотя методы клеточного роста стали несколько стандартизированы в этой области, методы для лизиса клеток варьируются в широких пределах. В дополнение к sonication общие лизис методы включают использование французской прессе, гомогенизатор, шарик загонщиков, или лизоцима и другие биохимические и физические нарушения методы46,47,48, 49. с помощью наших методов, примерно 2 мл экстракт сырой клетки получены на 1 Л клеток. Это количество клеток экстракт может поддерживать четыре сотни 15 мкл СЛТ реакции, каждый производства ~ 900 мкг/мл репортер sfGFP белка из шаблона плазмида pJL1-sfGFP. Этот метод по цене $ 0,021/мкг производства sfGFP ($.019/мкл реакции), за исключением стоимости труда и оборудования (Дополнительные рис. 1). Начиная с нуля, этот метод может быть реализован в течение 4 дней одного человека и повторять что СЛТ реакции может быть завершена в течение часов (рис. 1). Кроме того протокол может масштабироваться объема для больших партий реагента подготовки в соответствии с потребностями пользователя. Важно протокола, представленные здесь может быть реализован специалистами лаборатории обучены не-такие как студентов, как он только требует основных лабораторных навыков. Процедуры, описанные ниже и сопровождающие видео были разработаны специально для повышения доступности E. coli СЛТ платформы для широкого использования.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">12795027</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60353-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P9791-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">KOH</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IPTG</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(OAc)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tris(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DTT</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">tRNA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Folinic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NTPs</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Oxalic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NAD</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CoA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PEP</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NH4(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">02180595.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(Glu)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Spermidine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Molecular Grade Water</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Aspartic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Valine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Alanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Arginine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Asparagine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Glycine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Histadine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Proline</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Serine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tyrosine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ultrasonic Processor</td>
			<td style="width:145px;">QSonica</td>
			<td style="width:123px;">Q125-230V/50Hz</td>
			<td>3.175 mm diameter probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1L Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microfuge 20</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cytation 5</td>
			<td style="width:145px;">BioTek</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Strep-Tactin XT Starter Kit</td>
			<td style="width:145px;">IBA</td>
			<td style="width:123px;">2-4998-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">pJL1-sfGFP</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:145px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

За последние 50 лет свободных клеток синтез белка (СЛТ) стала мощной технологии осваивать транскрипционный анализ и трансляционная потенциала клеток в пробирке. Устраняя необходимость поддержания жизнеспособности клетки и устраняя сотовой барьер СЛТ был основополагающим для новых приложений в biomanufacturing традиционно сложных белков, а также приложений в быстрого прототипирования для Метаболический инжиниринг и функциональной геномики. Наши методы для реализации E. coli-платформе СЛТ позволяют новым пользователям для доступа к многим из этих приложений. Здесь мы описываем методы для подготовки экстракт обогащенного СМИ, недоумение колбы и воспроизводимый метод лизис перестраиваемый на основе sonication клеток. Этот экстракт может затем использоваться для выражения протеина, способных производить 900 мкг/мл или более супер папку зеленого флуоресцентного белка (sfGFP) в как раз 5 h от экспериментальной установки для анализа данных, учитывая, что соответствующий реагент запасы были подготовлены заранее. По оценкам запуска получения реагентов стоит $4500, которая будет поддерживать тысячи реакций по ориентировочной цене $0.021 за мкг белка, произведенного или $0.019 за мкл реакции. Кроме того методы выражения протеина зеркало легкость установки реакции, видели в коммерчески доступных систем за счет оптимизации готовые смеси реагентов, на долю от стоимости. Чтобы разрешить пользователю использовать гибкий характер СЛТ платформы для широкого применения, мы определили целый ряд аспектов платформы, которые могут быть настроены и оптимизированы в зависимости от имеющихся ресурсов и результатов выражения протеина желаемого.

Мы представили на основе sonication E. coli экстракт подготовки протокола, который может быть завершен в течение четырех дней, с Рисунок 1 демонстрирует процедурные разбивка на каждый день. Есть податливость шаги, которые могут быть завершены в каждый ден?...

Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Кишечная палочка-синтез белка на основе свободных клеток: протоколы для технологии, надежные, гибкие и доступные платформы

Этот протокол подробно шаги, расходы и оборудование, необходимое для создания E. coli-на основе клеточных экстрактов и реализовать в vitro реакции синтеза белка в течение 4 дней или меньше. Чтобы использовать гибкий характер этой платформы для широкого применения, мы обсуждаем условий реакции, которые могут быть адаптированы и оптимизированы.

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Этот протокол упрощает и уточняет методы реализации синтеза самобелк неэкспертами. Улучшение доступа к этим методам поможет демаркетизировать платформу и широкий набор приложений, которые она позволяет. Основными преимуществами этой техники являются скорость, рентабельность и простота реакции, настроенная по сравнению с другими платформами синтеза повторного белка.Наша платформа может включить ряд приложений, включая функциональную геномику, hythopertesting, биосенсоры, образовательные наборы, и с незначительными изменениями, метаболической инженерии и расширения генетического кода. Хотя этот метод требует только базовой лабораторной подготовки, новые пользователи должны планировать, чтобы ознакомиться с методами, как sonication для успешного выполнения протокола. Для начала этой процедуры подготовить все средства массовой информации и культуры E.coli клетки, как указано в текстовом протоколе.Поместите одну литровую бутылку центрифуги в ванну с ледяной водой. После того, как культуры OD600 достигает 3,0, залить клеточной культуры в охлажденной бутылке. Используя двойной баланс пучка, добавьте воду во вторую бутылку центрифуги на один литр, пока она не весит так же, как первая, чтобы создать баланс для центрифуги.После предварительного охлаждения центрифуги до четырех градусов по Цельсию, центрифуга бутылки на 5000 г и при 10 градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы гранулировать клетки. После этого, медленно слить и избавиться от супернатанта. Поместите гранулы клетки на лед.С помощью стерильного шпателя выскаблить гранулы клетки из бутылки центрифуги и передать его в холодную, 50 миллилитров конической трубки. Добавьте 30 миллилитров холодного буфера S30, дополненных двумя миллимолярной DTT и повторно посовестите гранулы вихрем короткими очередями с периодами отдыха на льду до тех пор, пока гранулы полностью не будут перерасходоваться без кусков. После этого используйте еще 50-миллиметровую коническую трубку, наполненную водой, в качестве баланса для центрифуги образца при 5 000 г и 10 градусах по Цельсию в течение 10 минут.Слейте и избавиться от супернатанта. Переусердуйте гранулы с 20 до 25 миллилитров холодного буфера S30. Центрифуга при 5 000 г и при 10 градусах Цельсия в течение 10 минут.Вылейте и избавиться от супернатанта. Затем добавьте 30 миллилитров буфера S30 и повторно посовелите гранулы с помощью вихря, как описано ранее. Установите три предварительно взвешенных, холодных, 50 миллилитров конических труб.Используя серологический наполнитель пипетки со стерильной пипеткой, aliquot десять 10 миллилитров гранул подвески в каждой трубке. Центрифуга всех труб, используя соответствующие балансы по мере необходимости на 5000 г и 10 градусов по Цельсию в течение 10 минут. После этого вылить и избавиться от супернатантов.Тщательно протрите внутри каждой трубки и крышка с чистой тканью, чтобы удалить буфер доступа, убедившись, что избежать прикосновения гранулы. Используя аналитический баланс, переутомлите трубки и сообщите об окончательном весе гранул для каждой трубки. Для начала добавьте один миллилитр холодного буфера S30 с 2 миллимолярными DTT на один грамм клеточной массы к каждой грануле.Используйте вихрь для повторного перерасхода гранул, как описано ранее. Затем перенесите 1,4 миллилитров каждой повторной гранулы в отдельные 1,5 миллилитровые трубки Microcentrifuge. Поместите одну трубку в ледяную водяную ванну в стакан и распоисните зонд sonicator таким образом, чтобы он не касался дна или сторон трубки.Sonicate трубки с амплитудой установлен на 50% в течение 45 секунд, а затем 59 секунд отдыха. Убедившись, чтобы закрыть и инвертировать трубы во время от периодов. Сразу же после того, как sonication завершена, добавить 4,5 микролитров одного молара DTT в лизат.Переверните трубку несколько раз, чтобы смешать, а затем поместить его на лед. Повторите этот процесс, sonicating и добавление DTT для каждой трубки повторного перерасхода клеток. Центрифуга образцов при 18 000 г и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут.После этого, пипетка каждый супернатант в новый 1,5 миллилитр Microcentrifuge трубки, оставляя некоторые supernatant позади, чтобы обеспечить гранулы не нарушается. Возьмите трубки супернатанта на дрожание платформы инкубатора и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию с встряхивания при 250 об/мин в течение 60 минут. Это реакция на второй этап.Затем центрифугировать образцы на 10 000 г и при четырех градусах По Цельсию в течение 10 минут. Удалите каждый супернатант, не нарушая гранулы передачи их в новые трубы. Создайте много 100 микролитров алицитов экстракта для хранения.Во-первых, раствор оттепели A, раствор B, шаблон ДНК, экстракт BL21DE3, T7 РНК-полимераза и алицит молекулярной воды на льду. Затем наклеить необходимое количество микроцентрифугных трубок, необходимых для реакции CFPS. Смешайте каждый реагент путем трубопроводов или вихрей, затем добавьте раствор в помеченную реакционной трубку, убедившись, что не вихрь экстракт клетки, но вместо инвертировать трубку, чтобы смешать.Убедитесь, что окончательная реакция хорошо смешана и объединить в один 15 микролитер шарик в нижней части каждой трубки. Инкубировать каждую реакцию, не встряхивая при 37 градусах по Цельсию в течение четырех часов, или при 30 градусах по Цельсию в одночасье. Для начала, получить 96 пластины и загрузить 48 микролитров 0,05 молар HEPES при рН 8 в каждый колодец, необходимый для количественной оценки.Затем удалите реакционной трубки из инкубатора. Смешайте каждую реакцию, трубя вверх и вниз, и перенесите два микролитров каждой реакции в скважины, содержащие HEPES. Смешайте каждый колодец, трубя вверх и вниз.После того, как все реакции загружаются и смешиваются, загрузите пластину в флуорометр и измерьте флуоресцентные лампы конечной точки SFGFP, используя волну возбуждения длиной 485 нанометров и длиной волны выбросов 510 нанометров. Используйте ранее сгенерированную стандартную кривую для определения концентрации сверхкратного GFP от полученных люминесцентных показаний. В этом исследовании, sonication основе E.coli экстракт подготовки расследуется.Клеточные гранулы и клеточный экстракт стабильны при отрицательных 80 градусах по Цельсию, по крайней мере, год. Кроме того, экстракт клетки может пройти по крайней мере пять циклов замораживания оттепели без значительной потери производительности. Некоторые шаги в рамках этого протокола могут быть разнообразны без ущерба для общей производительности системы.В частности, клетки могут быть собраны в диапазоне от 2,7 до 4,0 оптической плотности на 600 нанометров без существенного влияния на продуктивность экстракта клеток. Тем не менее, качество ДНК шаблона является источником вариативности от партии к партии, что влияет на объемные урожаи реакции CFPS. Это решается путем очистки ДНК с помощью Midi или Maxiprep следуют дополнительные МЕРЫ по очистке ДНК.Реакционной сосуд также влияет на объемные урожаи реакции CFPS. Увеличение площади поверхности к соотношению объема, приводит к более высокой объемной урожайности. Для оптимизации объемных урожаев реакции CFPS и снижения вариативности партии экстракта клетки к партии для каждого нового препарата экстракта необходимо выполнять титрование магния.Для клеточных экстрактов, состоящих из 30 миллиграммов на миллилитр общего белка, оптимальная концентрация магния и объем экстракта для минимизации использования реагентов и максимизации объемной урожайности составляет 10 миллимолейных и пять микролитров соответственно. Изменяя шкалу реакции, пользователи могут использовать методы, начиная от высокой пропускной способности скрининга в более широком масштабе выражения целевого белка. Этот метод обеспечивает два ключевых преимущества, во-первых, он проверяет белковые продукты быстрее, а во-вторых, он синтезирует трудно выразить белков.Примеры включают белки, которые являются цитотоксическими или требуют окисления условий для их функции. Как и в любой лабораторной процедуре, ко всем реагентам следует относиться с осторожностью. Кроме того, центрифуги всегда должны быть сбалансированы и защита уха должны быть использованы во время sonication.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Particles without a Box: Brush-first Synthesis of Photodegradable PEG Star Polymers under Ambient Conditions

Частицы без коробки: Щетка-первая Синтез фотодеградируемое ПЭГ Star полимеров в условиях окружающей среды

Convenient methods for the rapid, parallel synthesis of diversely functionalized nanoparticles will enable discovery of novel formulations for drug ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Синтеза и характеристики функционализированным Металл-органические каркасы

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis of Poly(N-isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Synthesis of PolyN-isopropylacrylamide Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Синтез поли (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels для анизотропного Thermo-отзывчивость и органофильные / гидрофильных Возможность загрузки

Janus microparticles are compartmentalized particles with differing molecular structures and/or functionality on each of their two sides. Because of this ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Синтез и характеристика супрамолекулярных коллоидов

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Синтез белка биоконъюгатов<em&gt; с помощью</em&gt; Цистеин-малеимид химии

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

Спектроскопия ЯМР как надежный инструмент для быстрой оценки липидного профиля рыбьего жира добавки

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Синтез ядро оболочка легированный лантаноиды Upconversion нанокристаллов для сотовых приложений

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

Chemical Synthesis of Porous Barium Titanate Thin Film and Thermal Stabilization of Ferroelectric Phase by Porosity-Induced Strain

Химический синтез пористых бария титаната тонкой пленки и тепловой стабилизации сегнетоэлектрических фазы, пористость индуцированной штамм

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

Синтез тиоловых строительный блок для кристаллизации основ полупроводниковой Gyroidal металл серы

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Подготовка Poly(pentafluorophenyl acrylate) функционализированных SiO2 бусины очищение протеина

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...