Name: escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology
Uploaded: 2019-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Autores desean reconocer la Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher y Tony Turretto para soporte técnico, Wesley Kao, Layne Williams y Christopher Hight para discusiones útiles. Autores también reconocen apoyo de la Bill y Linda helada fondo, centro para aplicaciones en biotecnología Chevron Biotecnología aplicada investigación dotación beca investigación de Cal Poly, estudiante y programa de actividades creativas (RSCA 2017), la financiación y la National Science Foundation (NSF-1708919). MZL reconoce la subvención graduado del Universidad del estado de California. MCJ reconoce el ejército investigación oficina W911NF-16-1-0372, National Science Foundation otorga MCB-1413563 y MCB-1716766, la fuerza aérea de investigación laboratorio de centro de excelencia Grant FA8650-15-2-5518, la concesión de la Agencia de defensa amenaza reducción HDTRA1-15-10052/P00001, el David y Lucile Packard Foundation, el programa del erudito profesor Camille Dreyfus, el Departamento de energía BER Grant DE-SC0018249, el programa científico de fronteras humanas (RGP0015/2017), la concesión ETOP DOE Instituto genoma, y el consorcio biomédico de Chicago con el apoyo de los fondos de Searle en Chicago Community Trust para apoyo.

1. los medios preparación y crecimiento de la célula
<ol><li>
Día 1
	<ol>
<li>Las células de e. coli BL21*(DE3) racha de un glicerol acción sobre una placa de agar LB e incuban durante al menos 18 h a 37 ° C.</li>
		<li>Preparar 50 mL de medio LB y autoclave la solución en un ciclo líquido durante 30 min a 121 ° C. Almacenar a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Día 2
	<ol>
<li>Preparar 750 mL de 2 medios de x YTP y 250 mL de solución 0,4 de M D-glucosa co...

Síntesis de proteínas libres de células se ha convertido en una tecnología potente y propicia para una gran variedad de aplicaciones que van desde comercializa para prototipado rápido de sistemas bioquímicos. La amplitud de aplicaciones es compatible con la capacidad para controlar, manipular y aumentar la maquinaria celular en tiempo real. A pesar del creciente impacto de esta tecnología de plataforma, adaptación amplia ha sido lento debido a matices técnicos en la aplicación de los métodos. A través de este...

Síntesis de proteína sin células (PFC) ha emergido como una tecnología que ha abierto un número de nuevas oportunidades para la producción de proteínas, genómica funcional, ingeniería metabólica y más en los últimos 50 años1,2. En comparación con el estándar en vivo plataformas de expresión de la proteína, PFC proporciona tres ventajas fundamentales: 1) la naturaleza libre de la plataforma permite la producción de proteínas que serían potencialmente tóxicas o ajenas a la célula3,4 ,5,6; 2) inactivación de la DNA genomic y la introducción de una plantilla de DNA que codifican los genes de interés canalizar toda la energía sistémica dentro de la reacción a la producción de la proteína de interés; y 3) el carácter abierto de la plataforma permite al usuario modificar y supervisar las condiciones de reacción y composición en tiempo real7,8. Este acceso directo a la reacción es compatible con el aumento de los sistemas biológicos químicos ampliados y condiciones redox para la producción de nuevas proteínas y la afinación de procesos metabólicos2,9, 10. directa acceso también permite al usuario combinar la reacción de PFC con ensayos de actividad en un sistema del solo-pot para ciclos de diseño-construcción-prueba más rápida11. La capacidad para realizar la reacción de PFC en gotas de pequeño volumen o en los dispositivos basados en papel más apoya esfuerzos de descubrimiento de alto rendimiento y prototipado rápido12,13,14,15 ,16. Como resultado de estas ventajas y la naturaleza de listo del sistema, PFC únicamente ha permitido una variedad de aplicaciones de la biotecnología como la producción de proteínas que son difíciles de expresar soluble en vivo17, 18,19,20, detección de la enfermedad21,22,23, en demanda de biofabricación de18,24 ,25,26,27y educación28,29, todos los cuales muestran la flexibilidad y la utilidad de la plataforma libre de células.
Sistemas de PFC pueden ser generados desde una gran variedad de lisados crudos de ambas variedades de células procariotas y eucariotas. Esto permite diversas opciones en el sistema de elección, cada uno de los cuales tiene ventajas y desventajas dependiendo de la aplicación de interés. Sistemas de PFC también varían mucho en productividad, costo y tiempo de preparación. Los más comúnmente utilizan celular se producen extractos de germen de trigo, reticulocitos de conejo, células de los insectos y células de Escherichia coli , siendo esta última la más rentable hasta la fecha mientras que produce los mayores rendimientos volumétricos de la proteína30 . Mientras otros sistemas de PFC pueden ser ventajosos para su maquinaria de modificación poste-de translación innata, surgiendo aplicaciones utilizando e. coli-maquinaria base son capaces de cerrar la brecha mediante la generación de site-specifically fosforilada y proteínas glicosiladas en demanda31,32,33,34,35.
Reacciones de PFC se pueden ejecutar en cualquier lote, continuo intercambio sin células (CECF) o flujo continuo sin células (CFCF) formatos. El formato por lotes es un sistema cerrado cuya reacción es limitada debido a la disminución de cantidades de reactivos y la acumulación de subproductos inhibitorios de la reacción. Métodos CECF y CFCF aumentan la vida útil de la reacción y así dar lugar a rendimientos volumétricos creciente de la proteína en comparación con la reacción de lote. Esto se logra permitiendo que los subproductos de la síntesis de la proteína debe sacar el recipiente de la reacción mientras que nuevos reactivos se suministran en el transcurso de la reacción2. En el caso de CFCF, la proteína de interés también puede removerse de la cámara de reacción, mientras que en la CECF, la proteína de interés permanece en la cámara de reacción compuesta por una membrana semipermeable36,37. Estos métodos son especialmente valiosos para superar los bajos rendimientos volumétricos de difícil-a-expresan proteínas de interés38,39,40,41,42, 43. Los desafíos en la implementación de los enfoques CECF y CFCF son 1) mientras que resultan en un uso más eficiente de la maquinaria de la bio responsable de la transcripción y traducción, que requieren en particular grandes cantidades de reactivos que aumenta el costo general y 2) requieren más complejas configuraciones de reacción y equipo especializado en comparación con el formato de lote44. Con el fin de garantizar la accesibilidad para los nuevos usuarios, los protocolos describen foco en el formato por lotes en volúmenes de reacción de 15 μl con recomendaciones específicas para aumentar el volumen de reacción a la escala de mililitro.
Los métodos presentados en este documento permiten no expertos con habilidades básicas de laboratorio (como estudiantes) para implementar el crecimiento celular, preparación del extracto y formato reacción configuración de lote para una e. coli-basado sistema de PFC. Este enfoque es rentable en comparación con los kits disponibles en el mercado sin sacrificar la facilidad de la instalación de reacción basado en el kit. Además, este enfoque permite a las aplicaciones en el laboratorio y en el campo. Cuando se decide implementar PFC, nuevos usuarios completamente deben evaluar la eficacia de los sistemas de expresión de la proteína convencional para la inversión de arranque, como PFC no puede ser superior en todos los casos. Los métodos de PFC aquí descritos permiten al usuario aplicar directamente una variedad de aplicaciones, incluyendo la genómica funcional, la producción de proteínas que son insuperables para expresión en vivo , así como campo de prueba de alto rendimiento aplicaciones como biosensores y kits educativos para la biología sintética. Aplicaciones adicionales tales como la ingeniería metabólica, de las condiciones de expresión de la proteína, detección de enfermedades y escalado utilizando métodos CECF o CFCF siguen siendo posibles pero pueden requerir experiencia con la plataforma de PFC más modificación de la reacción condiciones. Nuestros métodos de combinan crecimiento en medios enriquecidos y el desconcertado, con métodos relativamente rápidos y reproducibles de lisis celular mediante sonicación, seguido por una configuración simplificada de reacción de PFC que utiliza mezclas optimizadas45. Mientras que los métodos de crecimiento celular han convertido en algo estandarizados dentro de este campo, métodos de lisis celular varían ampliamente. Además de sonicación, métodos de lisis comunes incluyen la utilización de una prensa francesa, un homogeneizador, batidores de grano, o lisozima y otras perturbaciones bioquímicas y físicas métodos46,47,48, 49. nuestros métodos, se obtienen aproximadamente 2 mL de extracto crudo de la célula por 1 L de las células. Esta cantidad de extracto celular puede soportar 400 15 μl PFC reacciones, cada producción ~ 900 μg/mL de proteína de sfGFP de reportero de la plantilla de plásmido pJL1-sfGFP. Este método cuesta $ 0,021/μg de sfGFP producido ($.019/μl de reacción), excluyendo el costo de mano de obra y equipo (suplementario Figura 1). A partir de cero, este método puede aplicarse en 4 días por una sola persona y repetir reacciones PFC pueden completarse dentro de las horas (figura 1). Además, el protocolo puede ser aumentado en volumen para lotes más grandes de preparación de los reactivos para satisfacer las necesidades del usuario. Lo importante es el protocolo que presentamos se puede implementar laboratorio entrenado no expertos como estudiantes, ya que sólo requiere conocimientos básicos de laboratorio. Los procedimientos descritos a continuación y el video que lo acompaña han sido desarrollados específicamente para mejorar la accesibilidad de la plataforma de PFC de e. coli de amplio uso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">12795027</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60353-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P9791-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">KOH</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IPTG</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(OAc)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tris(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DTT</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">tRNA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Folinic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NTPs</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Oxalic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NAD</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CoA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PEP</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NH4(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">02180595.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(Glu)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Spermidine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Molecular Grade Water</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Aspartic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Valine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Alanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Arginine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Asparagine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Glycine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Histadine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Proline</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Serine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tyrosine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ultrasonic Processor</td>
			<td style="width:145px;">QSonica</td>
			<td style="width:123px;">Q125-230V/50Hz</td>
			<td>3.175 mm diameter probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1L Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microfuge 20</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cytation 5</td>
			<td style="width:145px;">BioTek</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Strep-Tactin XT Starter Kit</td>
			<td style="width:145px;">IBA</td>
			<td style="width:123px;">2-4998-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">pJL1-sfGFP</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:145px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

En los últimos 50 años, síntesis de proteínas libres de células (CFPA) ha emergido como una potente tecnología para aprovechar la capacidad transcripcional y traduccional de células dentro de un tubo de ensayo. Obviando la necesidad de mantener la viabilidad de la célula y eliminando la barrera celular, PFC ha sido fundamental para aplicaciones emergentes en biofabricación de proteínas tradicionalmente difíciles, así como aplicaciones de prototipado rápido para Ingeniería Metabólica y genómica funcional. Nuestros métodos para la implementación de un e. coli-basado PFC plataforma permiten a los usuarios nuevos para acceder a muchas de estas aplicaciones. Aquí, se describen métodos para preparar extracto mediante el uso de medios enriquecidos, frascos desconcertados y un método reproducible de lisis celular armonioso basado en baño de ultrasonidos. Este extracto puede utilizarse para expresión de proteínas capaces de producir 900 μg/mL o más de proteína fluorescente verde super carpeta (sfGFP) en apenas 5 h de la disposición experimental para análisis de datos, dado que las existencias de reactivos apropiados han sido preparadas de antemano. El costo estimado de inicio de obtención de reactivos es de $4.500 que se sostienen miles de reacciones a un costo estimado de $0,021 por μg de proteína producida o $0,019 por μl de reacción. Además, los métodos de expresión de la proteína reflejan la facilidad de la instalación de reacción en sistemas comercialmente disponibles debido a la optimización de reactivos Premezclados, a una fracción del costo. Con el fin de que el usuario pueda aprovechar la naturaleza flexible de la plataforma de PFC para aplicaciones generales, hemos identificado una gran variedad de aspectos de la plataforma que puede ser afinado y optimizado dependiendo de los recursos disponibles y los resultados de la expresión de la proteína deseada.

Hemos presentado una sonicación basado en e. coli extracto protocolo de preparación que puede completarse en un lapso de cuatro días, con la figura 1 demuestra la ruptura procesal más cada día. Hay maleabilidad a los pasos que se pueden realizar en cada día con varios puntos de pausa, pero hemos encontrado este flujo de trabajo para ser el más eficaz ejecutar. Además, los gránulos de la célula (paso 1.3.18) y extracto completamente preparad...

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Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-base libres de células síntesis de la proteína: protocolos para una tecnología de plataforma robusta, flexible y accesible

Este protocolo detalla los pasos, costos y equipamiento necesario para generar e. coli-basado en extractos celulares e implementar en vitro reacciones de la síntesis de proteína dentro de 4 días o menos. Para aprovechar la naturaleza flexible de esta plataforma para aplicaciones generales, se discuten las condiciones de reacción que pueden ser adaptadas y optimizadas.

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Este protocolo simplifica y aclara los métodos para implementar la síntesis de auto-proteínas por parte de no expertos. El acceso mejorado a estos métodos ayudará a desmarketizar la plataforma y el amplio conjunto de aplicaciones que permite. Las principales ventajas de esta técnica son la velocidad, la rentabilidad y la facilidad de configuración de la reacción en comparación con otras plataformas de síntesis autoprotecica.Nuestra plataforma puede permitir una serie de aplicaciones que incluyen genómica funcional, hithopertesting, biosensores, kits educativos, y con pequeñas modificaciones, ingeniería metabólica y expansión de código genético. Si bien esta técnica sólo requiere formación básica de laboratorio, los nuevos usuarios deben planear familiarizarse con técnicas como la sonicación para la ejecución exitosa del protocolo. Para comenzar este procedimiento prepare todas las células E.coli de medios y cultivos como se describe en el protocolo de texto.Coloque una botella centrífuga de un litro en un baño de agua helada. Una vez que los cultivos OD600 alcanzan 3.0, verter el cultivo celular en la botella refrigerada. Usando un balance de doble haz, agregue agua a una segunda botella centrífuga de un litro hasta que pese lo mismo que la primera para crear una balanza para la centrífuga.Después de pre-enfriar la centrífuga a cuatro grados Celsius, centrifugar las botellas a 5.000 g y a 10 grados Celsius durante 10 minutos para peletizar las células. Después de esto, vierta lentamente y deseche el sobrenadante. Coloque el pellet celular sobre hielo.Usando una espátula estéril raspa el pellet celular de la botella centrífuga y transfiéralo a un tubo cónico frío de 50 mililitros. Añadir 30 mililitros de tampón S30 frío complementado con dos TDT milimolares y resuspend el pellet por vórtice en ráfagas cortas con períodos de descanso sobre hielo hasta que el pellet se resuspende completamente sin trozos. Después de esto, utilice otro tubo cónico de 50 milímetros lleno de agua como equilibrio para centrifugar la muestra a 5.000 g y 10 grados Celsius durante 10 minutos.Vierta y deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet con 20 a 25 mililitros de tampón S30 frío. Centrifugar a 5.000 g y a 10 grados centígrados durante 10 minutos.Vierta y deseche el sobrenadante. A continuación, agregue 30 mililitros de tampón S30 y resusppend el pellet utilizando un vórtice como se describió anteriormente. Establezca tres tubos cónicos prepesados, fríos y de 50 mililitros.Utilizando un relleno de pipeta serológica con una pipeta estéril, aliquot diez 10 mililitros de suspensión de pellets en cada tubo. Centrifugar todos los tubos utilizando las balanzas adecuadas según sea necesario a 5.000 g y 10 grados Celsius durante 10 minutos. Después de esto, vierta y deseche los sobrenadantes.Limpie cuidadosamente el interior de cada tubo y la tapa con un tejido limpio para extraer el tampón de acceso, mientras se asegura de evitar tocar el pellet. Usando un balance analítico, reequilibra los tubos e informe del peso final del pellet para cada tubo. Para comenzar, agregue un mililitro de tampón S30 frío con 2 TDT milimétricas por un gramo de masa celular a cada pellet.Utilice un vórtice para resuspender los pellets como se describió anteriormente. A continuación, transfiera 1,4 mililitros de cada pellet resuspendido a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros separados. Coloque un tubo en un baño de agua helada en un vaso de precipitados y coloque la sonda sonicador de manera que no toque los fondos o los lados del tubo.Sonicar el tubo con la amplitud establecida en 50% durante 45 segundos, seguido de 59 segundos de descanso. Asegúrese de cerrar e invertir los tubos durante los períodos de apagado. Inmediatamente después de que se complete la sonicación, agregue 4,5 microlitros de una TDT molar en el licato.Invierta el tubo varias veces para mezclarlo y luego colóquelo sobre hielo. Repita este proceso, sonicando y añadiendo TDT para cada tubo de células resuspendidas. Centrifugar las muestras a 18.000 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Después de esto, pipetear cada sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, dejando algún sobrenadante para asegurar que el pellet no se moleste. Lleve los tubos de sobrenadante a la plataforma de agitación de una incubadora e incubarlos a 37 grados centígrados con temblores a 250 RPM durante 60 minutos. Esta es la reacción de eslorción.Luego, centrifuga las muestras a 10.000 g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Retire cada sobrenadante sin alterar el pellet transfiriéndolos a nuevos tubos. Cree muchas 100 alícuotas de microlitros del extracto para su almacenamiento.En primer lugar, descongelar la solución A, la solución B, la plantilla de ADN, el extracto BL21DE3, la ARN polimerasa T7 y una alícuota de agua de grado molecular sobre hielo. A continuación, etiquete la cantidad necesaria de tubos de microcentrífuga necesarios para la reacción CFPS. Mezclar cada reactivo por pipeteo o vórtice, luego añadir la solución al tubo de reacción etiquetado, asegurándose de no vórtice el extracto de la célula, sino invertir el tubo para mezclar.Asegúrese de que la reacción final esté bien mezclada y combínela en un solo cordón de 15 microlitrotros en la parte inferior de cada tubo. Incubar cada reacción sin temblar a 37 grados centígrados durante cuatro horas, o a 30 grados centígrados durante la noche. Para empezar, obtener una placa de 96 pozos y cargar 48 microlitros de 0,05 HEPES molares a pH 8 en cada pozo necesario para la cuantificación.A continuación, retire los tubos de reacción de la incubadora. Mezclar cada reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo y transferir dos microlitros de cada reacción a los pozos que contienen HEPES. Mezcle cada pozo pipeteando hacia arriba y hacia abajo.Después de cargar y mezclar todas las reacciones, cargue la placa en un fluorómetro y mida los fluorescentes de punto final SFGFP utilizando una longitud de onda de excitación de 485 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 510 nanómetros. Utilice una curva estándar generada previamente para determinar la concentración de GFP supercarpeta a partir de la lectura de fluorescentes obtenidos. En este estudio, se investiga una preparación de extracto de E.coli basada en sonicación.Pellets celulares y extracto de células son estables en 80 grados Celsius negativos durante al menos un año. Además, el extracto de célula puede sufrir al menos cinco ciclos de congelación-descongelación sin una pérdida significativa de productividad. Algunos pasos dentro de este protocolo pueden variar sin perjuicio de la productividad general del sistema.Más notablemente, las células se pueden cosechar dentro del rango de 2.7 a 4.0 densidad óptica a 600 nanómetros sin un efecto significativo en la productividad del extracto celular. Sin embargo, la calidad del ADN de la plantilla es una fuente de variabilidad de lote a lote que afecta los rendimientos volumétricos de la reacción CFPS. Esto se resuelve purificando el ADN a través de un Midi o Maxiprep seguido de un paso adicional de limpieza de ADN.El recipiente de reacción también afecta los rendimientos volumétricos de la reacción CFPS. Un aumento en la relación superficie-volumen, resulta en mayores rendimientos volumétricos. Para optimizar los rendimientos volumétricos de la reacción CFPS y reducir la variabilidad de lote a lote del extracto de célula, se debe realizar una valoración de magnesio para cada nueva preparación de extracto.Para extractos celulares compuestos de 30 miligramos por mililitro de proteína total, la concentración óptima de magnesio y el volumen de extracto para minimizar el uso de reactivos y maximizar el rendimiento volumétrico es de 10 milimolar y cinco microlitros respectivamente. Al variar la escala de reacción, los usuarios pueden buscar métodos que van desde el cribado de alto rendimiento hasta expresiones a mayor escala de una proteína de destino. Esta técnica proporciona dos ventajas clave, primero examina los productos proteicos más rápidamente, y en segundo lugar, sintetiza proteínas difíciles de expresar.Algunos ejemplos son las proteínas que son citotóxicas o requieren condiciones oxidantes para su función. Al igual que con cualquier procedimiento de laboratorio, todos los reactivos deben tratarse con precaución. Además, las centrífugas siempre deben estar equilibradas y se debe utilizar protección para los oídos durante la sonicación.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Particles without a Box: Brush-first Synthesis of Photodegradable PEG Star Polymers under Ambient Conditions

Partículas sin caja: Cepillo-primero Síntesis de fotodegradables PEG estrellas Polímeros bajo Condiciones Ambientales

Convenient methods for the rapid, parallel synthesis of diversely functionalized nanoparticles will enable discovery of novel formulations for drug ...

Investigación

Química

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Marcos de síntesis y caracterización de funcionalizado metal-orgánico

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis of Poly(N-isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Synthesis of PolyN-isopropylacrylamide Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Síntesis de Poli (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels para anisotrópico Thermo-respuesta y la organófila / hidrofílico La capacidad de carga

Janus microparticles are compartmentalized particles with differing molecular structures and/or functionality on each of their two sides. Because of this ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Síntesis y caracterización de supramoleculares Coloides

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Síntesis de Proteínas bioconjugados<em&gt; vía</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

Espectroscopía de RMN como una herramienta robusta para la Evaluación Rápida del perfil lipídico de los suplementos de aceite de pescado

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Síntesis de Core-shell dopados con lantánidos Upconversion nanocristales para aplicaciones celulares

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

Chemical Synthesis of Porous Barium Titanate Thin Film and Thermal Stabilization of Ferroelectric Phase by Porosity-Induced Strain

Síntesis química de película delgada de titanato de bario poroso y estabilización térmica de la fase ferroeléctrica por tensión inducida por la porosidad

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

Síntesis de un componente tiol para la cristalización de un semiconductor marco Gyroidal Metal-azufre

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparación de Poly(pentafluorophenyl acrylate) funcionalizados SiO2 cuentas para purificación de proteínas

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...