Name: escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology
Uploaded: 2019-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Författarna vill erkänna Dr Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher, och Tony Turretto för teknisk support, Wesley Kao, Layne Williams, och Christopher Hight för bra diskussioner. Författarna erkänner också finansiellt stöd från Bill och Linda Frost fonden, Center för applikationer inom bioteknikens Chevron bioteknik tillämpas Endowment forskningsbidrag, Cal Poly forskning, Scholarly och kreativa aktiviteter Grant Program (RSCA 2017), och National Science Foundation (NSF-1708919). MZL erkänner California State University Graduate bidraget. MCJ erkänner den armén forskning Office W911NF-16-1-0372, beviljar National Science Foundation MCB-1413563 och MCB-1716766, de flygvapen forskning laboratorium Center av Excellence Grant FA8650-15-2-5518, Defense Threat minskning byrån bidraget HDTRA1-15-10052/P00001, David och Lucile Packard Foundation, programmet Camille Dreyfus lärare-forskare, Institutionen för energi BER Grant DE-SC0018249, den mänskliga gränser Naturvetenskapsprogrammet (RGP0015/2017), DOE Joint Genome Institute ETOP bidraget, och Chicago biomedicinsk konsortiet med stöd från Searle fonderna på the Chicago Community Trust för stöd.

1. Media förberedelse och celltillväxt
<ol><li>
Dag 1
	<ol>
<li>Strimma E. coli BL21*(DE3) celler från en glycerol lager på en LB agarplattan och Inkubera under minst 18 timmar vid 37 ° C.</li>
		<li>Förbereda 50 mL LB media och autoklav lösningen på en flytande cykel under 30 minuter vid 121 ° C. Förvara i rumstemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dag 2
	<ol>
<li>Förbereda 750 mL 2 x YTP media och 250 mL 0,4 M D-glukos lösning som beskrivs i den kompletterande infor...

Cellfria proteinsyntesen har vuxit fram som en kraftfull och möjliggörande teknik för en mängd tillämpningar som sträcker sig från biomanufacturing till prototyper av biokemiska system. Bredden av program stöds av kapaciteten att övervaka, manipulera och öka cellulära maskineriet i realtid. Trots den växande effekten av denna plattform teknik, bred anpassning har varit långsam på grund av tekniska nyanser i genomförandet av metoder. Genom denna insats vill vi att enkelhet och tydlighet för att upprätta d...

Cellfria Protein syntes (CFPS) har vuxit fram som en teknik som har låst upp ett antal nya möjligheter för proteinproduktion, Funktionsgenomik, metabola engineering och mer inom de senaste 50 år1,2. CFPS jämfört med standard i vivo protein uttryck plattformar, och ger tre viktiga fördelar: 1) cell-fri natur av plattformen möjliggör produktion av proteiner som skulle vara potentiellt giftiga eller utländska till cell3,4 ,5,6. (2) inaktivering av genomisk DNA och införandet av en mall DNA kodning av gene(s) av intresse kanalisera all den systemiska energin inom reaktionen till produktionen av proteinernas av intresse. och 3) öppna karaktär av plattformen ger användaren möjlighet att ändra och övervaka reaktion villkor och sammansättning i realtid7,8. Denna direkta tillgång till reaktionen stöder augmentation av biologiska system med utökade kemier och redox förutsättningar för produktion av nya proteiner och trimning av metaboliska processer2,9, 10. direkt tillgång tillåter även användaren att kombinera CFPS reaktionen med aktivitet-analyser i ett singel-pot system för snabbare design-build-test cykler11. Kapacitet att utföra CFPS reaktionen i liten volym droppar eller på papper-baserade enheter ytterligare stöder hög genomströmning discovery ansträngningar och prototyper12,13,14,15 ,16. Grund av dessa fördelar och den plug and play typ av systemet, har CFPS unikt möjliggjort en mängd biotekniska tillämpningar såsom produktion av proteiner som är svåra att solubly express i vivo17, 18,19,20, upptäckt av sjukdom21,22,23, på efterfrågan biomanufacturing18,24 ,25,26,27, och utbildning28,29, varav alla Visa flexibilitet och nyttan av cellfria plattformen.
CFPS system kan genereras från en mängd rå lysates från båda prokaryota och eukaryota cellinjer. Detta möjliggör olika alternativ i systemet för val, som alla har för- och nackdelar beroende på tillämpningen av intresse. CFPS system varierar också kraftigt i förberedelsetid, kostnader och produktivitet. Mest utnyttjas vanligen cell extrakt produceras från vetegroddar, kanin retikulocyter, insekt celler och Escherichia coli celler, med den sistnämnda är den mest kostnadseffektiva hittills samtidigt som det producerar högsta volymetriska avkastningarna av protein30 . Medan andra CFPS system kan vara fördelaktiga för deras medfödda posttranslationella modifieringen maskiner, framväxande program med hjälp av E. coli-baserade maskiner ska kunna överbrygga klyftan genom att generera anläggningsvis fosforyleras och Glykosylerat proteiner på efterfrågan31,32,33,34,35.
CFPS reaktioner kan köras i antingen batch, kontinuerlig-exchange cellfria (CECF) eller kontinuerlig flöde cell-fri (CFCF) format. Det batch-formatet är ett slutet system vars reaktion livstid är begränsad på grund av minskande mängder reaktanterna och ansamling av inhiberande biprodukter av reaktionen. CECF och CFCF metoder öka livslängden av reaktionen och resultera därmed i ökat volymetriska protein avkastning jämfört med batch reaktionen. Detta åstadkoms genom att låta biprodukter av proteinsyntesen ska tas bort från reaktionskärlet medan nya reaktanterna levereras under hela den reaktion2. När det gäller CFCF, kan proteinet av intresse också tas bort från reaktionskammaren, medan i CECF, proteinet av intresse förblir i reaktionskammaren består av en halvgenomträngligt membran36,37. Dessa metoder är särskilt värdefullt att övervinna dåliga volymetriska avkastningarna av svårt-att-express proteiner av intresse38,39,40,41,42, 43. Utmaningarna i genomförandet av de CECF och CFCF strategier är att 1) medan de resulterar i effektivare användning av den bio maskinen ansvarar för transkription och translation, de kräver framför allt större mängder reagens som ökar totalkostnad och 2) de kräver mer komplex reaktion uppställningar och specialutrustning jämfört med de batch format44. För att säkerställa tillgänglighet för nya användare, beskrivs protokoll som häri fokus på batch format på reaktion volymer av 15 µL med specifika rekommendationer för att öka volymen reaktion till milliliter skalan.
De metoder som presenteras häri aktivera icke-experter med grundläggande laboratorium färdigheter (t.ex. studenter) att genomföra celltillväxt, extrahera förberedelse och batch-format reaktion setup för en E. coli-baserat CFPS system. Detta tillvägagångssätt är kostnadseffektiv jämfört med kommersiellt tillgängliga kit utan att offra lättheten av kit-baserade reaktion setup. Dessutom kan detta tillvägagångssätt program i laboratorium och i fält. När man beslutar att genomföra CFPS, bör nya användare grundligt utvärdera effekten av konventionell protein uttryck system för start investeringar, eftersom CFPS inte kanske är överlägsen i varje fall. CFPS metoderna som beskrivs här möjligt för användaren att direkt genomföra en mängd olika tillämpningar, inklusive Funktionsgenomik, hög genomströmning provning, produktion av proteiner som är svårlösta för i vivo uttryck, samt fältet applikationer inklusive biosensorer och utbildningspaket för syntetisk biologi. Ytterligare applikationer såsom metabola engineering, trimning av protein uttryck villkor, sjukdom upptäckt och skala upp med CECF eller CFCF metoder är fortfarande möjligt men kan kräva erfarenhet med CFPS plattform för vidare modifiering av reaktion villkor. Våra metoder kombinera tillväxt i berikade media och förbryllad kolvar, med relativt snabba och reproducerbara metoder för cellys genom ultraljudsbehandling, följt av en förenklad CFPS reaktion installation som använder optimerade premixer45. Medan de cellulära tillväxt metoderna har blivit något standardiserat inom fältet, varierar metoder för cellen lysis kraftigt. Utöver ultraljudsbehandling inkluderar vanliga lysis metoder utnyttjandet av en fransk press, en Homogenisatorer, pärla visparna, eller lysozym och andra biokemiska och fysiska störningar metoder46,47,48, 49. med våra metoder, ca 2 mL av rå cell extrakt erhålls per 1 L av celler. Denna kvantitet av cell extrakt kan stödja fyra hundra 15 µL CFPS reaktioner, varje producerande ~ 900 µg/mL reporter sfGFP protein från den mall plasmiden pJL1-sfGFP. Denna metod kostar $ 0,021/µg av sfGFP produceras ($.019/µL av reaktion), exklusive kostnader för arbetskraft och utrustning (kompletterande figur1). Start från scratch, denna metod kan genomföras på 4 dagar av en enda person och upprepa CFPS reaktioner kan slutföras inom timmar (figur 1). Protokollet kan dessutom skalas upp i volym för större partier av REAGENSBEREDNING att passa användarens behov. Ännu viktigare, kan det protokoll som presenteras här genomföras genom laboratoriet utbildade icke-experter såsom studenter, eftersom det kräver endast grundläggande laboratorium färdigheter. De förfaranden som beskrivs nedan, och medföljande videon har utvecklats speciellt för att förbättra tillgängligheten av E. coli CFPS plattform för bred användning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">12795027</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60353-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P9791-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">KOH</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IPTG</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(OAc)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tris(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DTT</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">tRNA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Folinic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NTPs</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Oxalic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NAD</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CoA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PEP</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NH4(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">02180595.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(Glu)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Spermidine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Molecular Grade Water</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Aspartic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Valine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Alanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Arginine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Asparagine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Glycine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Histadine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Proline</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Serine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tyrosine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ultrasonic Processor</td>
			<td style="width:145px;">QSonica</td>
			<td style="width:123px;">Q125-230V/50Hz</td>
			<td>3.175 mm diameter probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1L Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microfuge 20</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cytation 5</td>
			<td style="width:145px;">BioTek</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Strep-Tactin XT Starter Kit</td>
			<td style="width:145px;">IBA</td>
			<td style="width:123px;">2-4998-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">pJL1-sfGFP</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:145px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Under de senaste 50 åren, har Cell-Free Protein syntes (CFPS) framträtt som en kraftfull teknik för att utnyttja den transkriptionell och translationell kapaciteten hos celler i ett provrör. Genom att undanröja behovet av att upprätthålla livskraften i cellen, och genom att eliminera cellulära barriären, har CFPS varit grundläggande för nya tillämpningar inom biomanufacturing av traditionellt utmanande proteiner, samt applikationer i rapid prototyping för metaboliska teknik och funktionsgenomik. Våra metoder för att implementera en E. coli-baserad plattform som CFPS ge nya användare åtkomst till många av dessa program. Här, beskriver vi metoder för att förbereda extrakt med hjälp av berikade media, förbryllad kolvar och en reproducerbar metod för avstämbara ultraljudsbehandling-baserade cellys. Detta extrakt kan sedan användas för proteinuttryck kan producera 900 µg/mL eller mer av super mapp grönt fluorescerande protein (sfGFP) i bara 5 h från experiment till dataanalys, med tanke på att lämpliga reagens bestånd har upprättats i förväg. Beräknad start kostar att erhålla reagenser $4.500 som kommer att stödja tusentals reaktioner till en beräknad kostnad av $0,021 per µg av protein som produceras eller $0,019 per µL av reaktion. Dessutom spegel protein uttryck metoderna användarvänlighet reaktion setup sett i kommersiellt tillgängliga system på grund av optimering av reagens premixer, till en bråkdel av kostnaden. För att möjliggöra för användaren att utnyttja flexibiliteten i CFPS plattformen för breda program, har vi identifierat en mängd olika aspekter av den plattform som kan vara trimmad och optimerad beroende på tillgängliga resurser och protein uttryck utfallen önskas.

Vi har lagt fram en ultraljudsbehandling-baserade E. coli extrahera förberedelse protokoll som kan kompletteras under en fyra dagars span, med figur 1 visar den processuella fördelningen över varje dag. Det finns formbarhet med steg som kan genomföras på varje dag med olika pausa punkter, men vi har funnit detta arbetsflöde ska vara den mest effektiva att utföra. Dessutom är både cell pellets (steg 1.3.18) och fullt beredd extrakt (steg 2.10...

Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-baserade Cell-Free proteinsyntes: protokoll för en robust, flexibel och lättillgänglig plattform teknik

Detta protokoll uppgifter om åtgärder, kostnader och utrustning krävs för att generera E. coli-baserade cell extrakt och genomföra in vitro- proteinsyntes reaktioner inom 4 dagar eller mindre. För att utnyttja flexibiliteten i denna plattform för bred applikationer, diskutera vi reaktionsbetingelser som kan anpassas och optimeras.

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Detta protokoll förenklar och förtydligar metoderna för att implementera själv re-protein syntes av icke-experter. Förbättrad tillgång till dessa metoder kommer att bidra till att avmarknadsföra plattformen och den breda uppsättning program som den möjliggör. De viktigaste fördelarna med denna teknik är hastigheten, kostnadseffektivitet, och den enkla reaktion som inrättats jämfört med andra själv re-protein syntes plattformar.Vår plattform kan möjliggöra ett antal tillämpningar inklusive funktionell genomik, hythopertesting, biosensorer, pedagogiska kit, och med mindre ändringar, metabolisk teknik och genkod expansion. Medan denna teknik kräver endast grundläggande laboratorium utbildning, nya användare bör planera att bekanta sig med tekniker som ultraljudsbehandling för framgångsrik körning av protokollet. För att börja detta förfarande förbereda alla medier och kultur E.coli celler som beskrivs i textprotokollet.Placera en en liter centrifug flaska i ett isvattenbad. När kulturerna OD600 når 3,0, häll cellkulturen i den kylda flaskan. Med hjälp av en dubbel balk balans, tillsätt vatten till en andra en liter centrifug flaska tills den väger samma som den första för att skapa en balans för centrifug.Efter förkylning centrifugen till fyra grader Celsius, centrifug flaskorna på 5, 000 g och vid 10 grader Celsius i 10 minuter för att pelleta cellerna. Efter detta häller du långsamt av och gör sig av med supernatanten. Placera cellpelleten på is.Med hjälp av en steril spatel skrapa cell pelleten ur centrifug flaskan och överföra den till en kall, 50 milliliter koniska rör. Tillsätt 30 milliliter kall S30-buffert kompletterad med två millimolar DTT och återanvänd pelleten genom att virvla i korta skurar med viloperioder på is tills pelleten är helt återanvänds utan bitar. Efter detta, använd ytterligare 50 millimeter koniska röret fyllt med vatten som en balans till centrifug provet vid 5, 000 g och 10 grader Celsius i 10 minuter.Häll av och gör dig av med supernatanten. Resuspend pelleten med 20 till 25 milliliter kall S30 buffert. Centrifugera vid 5, 000 g och vid 10 grader Celsius i 10 minuter.Häll ut och gör sig av med supernatanten. Lägg sedan till 30 milliliter S30-buffert och återanvänd pelleten med hjälp av en virvel som tidigare beskrivits. Ställ ut tre pre-vägda, kalla, 50 milliliter koniska rör.Med hjälp av en serologisk pipettfyllmedel med en steril pipett, alikvot tio 10 milliliter pellet suspension i varje rör. Centrifugera alla rör med hjälp av lämpliga saldon efter behov vid 5, 000 g och 10 grader Celsius i 10 minuter. Efter detta, häll ut och kassera supernatanterna.Torka försiktigt insidan av varje rör och lock med en ren vävnad för att ta bort åtkomstbufferten, samtidigt som du ser till att undvika att röra pelleten. Med hjälp av en analytisk balans, reweigh rören och rapportera den slutliga pellet vikt för varje rör. Till att börja, tillsätt en milliliter kall S30 buffert med 2 millimolar DTT per ett gram cellmassa till varje pellet.Använd en virvel för att återanvända pelletsen som tidigare beskrivits. Överför sedan 1,4 milliliter av varje återsuspenderade pellet i separata 1,5 milliliter Microcentrifugrör. Placera ett rör i ett isvattenbad i en bägare och placera sonikersonden så att den inte vidröra bottnar eller sidor av röret.Sonikera röret med amplituden inställd på 50%i 45 sekunder, följt av 59 sekunders vila. Se till att stänga och invertera rören under avtperioderna. Omedelbart efter ultraljudsbehandling är klar, lägga till 4,5 mikroliter av en molar DTT i lysate.Invertera röret flera gånger för att blanda och sedan placera den på is. Upprepa denna process, sonikera och lägga till DTT för varje rör av återanvända celler. Centrifugera proverna vid 18, 000 g och fyra grader Celsius i 10 minuter.Efter detta, pipettera varje supernatant i en ny 1,5 milliliter Microcentrifug röret, lämnar några supernatant bakom att säkerställa pelleten inte störs. Ta slangarna av supernatant till skakplattformen på en inkubator och inkubera dem i 37 grader Celsius med skakningar vid 250 RPM i 60 minuter. Detta är avrinningsreaktionen.Sedan centrifugerna proverna vid 10, 000 g och vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Ta bort varje supernatant utan att störa pelleten överföra dem till nya rör. Skapa många 100 microliter alikvoter av extraktet för lagring.Först, tina lösning A, lösning B, DNA-mallen, BL21DE3-extraktet, T7 RNA Polymeras, och en alikvot av molekylärt kvalitet vatten på is. Därefter märka den nödvändiga mängden Microcentrifugrör som behövs för CFPS-reaktionen. Blanda varje reagens genom pipettering eller virvelning, tillsätt sedan lösningen till den märkta reaktionsröret, se till att inte vortexa cellextraktet utan istället invertera röret för att blanda.Se till att den slutliga reaktionen är väl blandad och kombinera till en enda 15 microliter pärla i botten av varje rör. Inkubera varje reaktion utan att skaka vid 37 grader Celsius i fyra timmar, eller vid 30 grader Celsius över natten. Till att börja med, erhålla en 96 väl platta och ladda 48 mikroliter av 0,05 molar HEPES vid pH 8 i varje väl behövs för kvantifiering.Därefter avlägsnar du reaktionsrören från inkubatorn. Blanda varje reaktion genom pipettering upp och ner och överför två mikroliter av varje reaktion i brunnarna som innehåller HEPES. Blanda varje brunn genom pipettering upp och ner.Efter alla reaktioner är laddade och blandade, ladda plattan i en fluorometer och mäta SFGFP slutpunkt lysrör med hjälp av en excitation våg längd på 485 nanometer och ett utsläpp våglängd på 510 nanometer. Använd en tidigare genererad standardkurva för att bestämma koncentrationen av supermappad GFP från den erhållna lysrörsavläsningen. I denna studie, en ultraljudsbehandling baserade E.coli extrakt preparat undersöks.Cellpellets och cellextrakt är stabila vid negativa 80 grader Celsius i minst ett år. Dessutom, cellextraktet kan genomgå minst fem frys-tina cykler utan en betydande förlust av produktivitet. Vissa steg inom detta protokoll kan varieras utan nackdel för systemets totala produktivitet.Framför allt kan celler skördas inom intervallet 2,7 till 4,0 optisk densitet vid 600 nanometer utan någon signifikant effekt på cellextraktsproduktiviteten. Mall-DNA-kvalitet är dock en källa till batch-till-batch-variabilitet som påverkar volymetriska avkastningen av CFPS-reaktionen. Detta löses genom att rena DNA:t via ett Midi eller Maxiprep följt av ett extra DNA-rensningssteg.Reaktionskärlet påverkar också volymetriska avkastningar av CFPS-reaktionen. En ökning av ytan till volymförhållandet, resulterar i högre volymetrisk avkastning. För att optimera volymetrisk avkastning av CFPS-reaktionen och för att minska cellextraktet batch-till-batch-variabilitet, bör en magnesiumtitrering utföras för varje ny extraktberedning.För cellextrakt som består av 30 milligram per milliliter totalt protein, den optimala magnesiumkoncentrationen och extraktvolymen för att minimera reagensanvändningen och maximera volymetrisk avkastning är 10 millimolar respektive fem mikroliter. Genom att variera reaktionsskalan kan användarna fullfölja metoder som sträcker sig från screening med hög genomströmning till större skaluttryck av ett målprotein. Denna teknik ger två viktiga fördelar, först skärmar proteinprodukter snabbare, och för det andra syntetiserar det svårt att uttrycka proteiner.Exempel är proteiner som är cytotoxiska eller kräver oxiderande förhållanden för sin funktion. Som vid alla laboratorieprocedurer ska alla reagenser behandlas med försiktighet. Dessutom bör centrifuger alltid vara balanserade och hörselskydd bör användas under ultraljudsbehandling.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Particles without a Box: Brush-first Synthesis of Photodegradable PEG Star Polymers under Ambient Conditions

Partiklar utan Box: Brush-första syntes av fotodegraderbara PEG Star Polymers under normala förhållanden

Convenient methods for the rapid, parallel synthesis of diversely functionalized nanoparticles will enable discovery of novel formulations for drug ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Syntes och karakterisering av funktionaliserad metal-organic frame

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis of Poly(N-isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Synthesis of PolyN-isopropylacrylamide Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Syntes av poly (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels för Anisotrop Thermo-respons och organofil / Hydrofil lastkapacitet

Janus microparticles are compartmentalized particles with differing molecular structures and/or functionality on each of their two sides. Because of this ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntes och karakterisering av Supramolekylära Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntesen av protein biokonjugat<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimid Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

NMR-spektroskopi som ett kraftfullt verktyg för snabb utvärdering av lipidprofilen av fiskolja kosttillskott

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Syntesen av Core-shell Lanthanide-dopade uppkonvertering nanokristaller för cellulära applikationer

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

Chemical Synthesis of Porous Barium Titanate Thin Film and Thermal Stabilization of Ferroelectric Phase by Porosity-Induced Strain

Kemisk syntes av porösa Barium Titanate tunn Film och termisk stabilisering av ferroelektrisk fas av porositet-inducerad stam

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

Syntesen av ett Thiol byggblock för kristallisation av en halvledande Gyroidal metall-svavel-ram

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Beredning av Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 pärlor för Protein rening

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...