Name: escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology
Uploaded: 2019-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Yazar Dr Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher ve Tony Turretto teknik destek için Wesley Kao, Layne Williams ve Christopher Hight yararlı tartışmalar için kabul etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca Bill ve Linda Frost Fonu, Merkezi biyoteknoloji'nın Chevron biyoteknoloji uygulanan araştırma bağış Grant, Cal Poly araştırma, Scholarly ve yaratıcı faaliyetleri hibe programı (RSCA 2017), uygulamalar için destek fon kabul ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF-1708919). MZL Kaliforniya Devlet Üniversitesi lisansüstü hibe eder. MCJ Ordu Araştırma Office W911NF-16-1-0372 kabul eder, Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB-1413563 ve MCB-1716766, Hava Kuvvetleri araştırma laboratuvarı Merkezi mükemmellik Grant FA8650-15-2-5518, savunma tehdit azaltma ajansı hibe HDTRA1-15-10052/P00001, David ve Lucile Packard Vakfı, Camille Dreyfus öğretmen-akademik Program bölümü, enerjisi BER Grant DE-SC0018249, insan sınır bilim programı (RGP0015/2017), DOE Joint genom Enstitüsü ETOP Grant ve Chicago Biyomedikal Konsorsiyumu Chicago toplum güven destek için Searle fon desteği ile.

1. medya hazırlanması ve hücre büyümesi
<ol><li>
Gün 1
	<ol>
<li>Bir gliserol çizgi E. coli BL21*(DE3) hücrelerden bir LB agar tabağa stok ve en az 18 h 37 ° C'de için kuluçkaya</li>
		<li>Bir sıvı döngüsü için 121 ° C'de 30 dk 50 mL LB medya ve otoklav çözüm hazırlamak Oda sıcaklığında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2. gün
	<ol>
<li>750 mL 2 x YTP medya ve 250 mL 0,4 M D-glukoz çözeltisi içinde ek bilgiler açıklandığı şekilde hazırlay...

Boş hücre protein sentezi çeşitli biomanufacturing biyokimyasal sistemleri hızlı prototipleme için değişen uygulamalar için güçlü ve etkinleştirme teknolojisi olarak ortaya çıkmıştır. Uygulamalar genişliğini izlemek, yönetmek ve gerçek zamanlı olarak hücresel makine çoğaltmak için kapasite tarafından desteklenmektedir. Bu platform teknolojisi genişleyen etkisi rağmen geniş adaptasyon kalmıştır yöntemleri uygulanması teknik nüanslar nedeniyle yavaş. Bu çaba ile biz bu teknoloji yeni...

Boş hücre Protein sentezi (CFPS) protein üretim, fonksiyonel genomik, metabolik Mühendisliği ve son 50 yıl1,2içinde daha fazlası için yeni fırsatlar bir dizi kilidi bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Standart vivo içinde protein ifade platformları için karşılaştırıldığında, CFPS üç önemli avantajlar sağlar: 1) platformu boş hücre doğa olası toksik veya dış hücre3,4 olurdu proteinleri sağlar ,5,6; 2) inactivation genomik DNA'ın ve bir şablon kodlama ilgi gene(s) DNA giriş tüm protein(s) üretimi için tepki ilgi içinde sistemik enerji kanal; ve 3) platformu açık yapısı değiştirin ve gerçek zamanlı7,8kompozisyon ve reaksiyon koşulları izlemek kullanıcı sağlar. Biyolojik sistemleri genişletilmiş kimyaları ve Redoks koşullarına roman proteinleri ve metabolik süreçleri2,9, ayarlama için büyütme tepki bu doğrudan erişimi destekler 10. doğrudan erişim de daha hızlı tasarım-yapı-test11döngüleri için bir tek-pot sisteminde CFPS reaksiyon etkinlik deneyleri ile birleştirmek kullanıcı sağlar. Küçük hacimli damlacıkları CFPS reaksiyonu gerçekleştirmek veya kağıt tabanlı cihazlarda daha fazla destekler yüksek üretilen iş bulma çabaları ve hızlı prototipleme12,13,14,15 kapasite ,16. Bu avantajları ve Tak ve Kullan doğa sisteminin bir sonucu olarak, CFPS gibi solubly hızlı vivo içindeiçinzor olan proteinleri biyoteknoloji uygulamaları çeşitli benzersiz olarak sağladı17, 18,19,20, hastalık21,22,23, isteğe bağlı biomanufacturing18,24 tespiti ,25,26,27ve göstermek tüm-in hangi esneklik ve yeni boş hücre platformu eğitim28,29,.
CFPS sistemleri hem prokaryotik ve ökaryotik hücre satırlarından ham lysates çeşitli oluşturulur. Bu seçim, sistemdeki farklı seçenekler her biri avantaj ve dezavantajları bağlı olarak faiz uygulanması vardır sağlar. CFPS sistemleri de hazırlık süresi, maliyet ve verimlilik büyük ölçüde değişir. En sık özleri buğday tohumu, tavşan Retikülosit, böcek hücreleri ve Escherichia coli hücreleri, ikinci en uygun maliyetli protein30 en hacimsel verimi üreten ise bugüne varlık ile üretilen hücre kullanılan . Diğer CFPS sistemleri onların doğuştan gelen translasyonel modifikasyon makine için avantajlı olabileceği gibi E. colikullanan uygulamalar ortaya-tabanlı makine site-specifically fosforile oluşturarak boşluğu edebiliyoruz ve glikozile proteinler talep31,32,33,34,35.
CFPS reaksiyonlar ya da toplu iş iş işlemde, sürekli değişimi-boş hücre (CECF) veya sürekli akış boş hücre (CFCF) biçimleri çalıştırabilirsiniz. Kapalı bir sistem olan reaksiyon ömür boyu azalan miktarda Reaktanları ve inhibitör yan reaksiyon birikimi nedeniyle sınırlıdır Toplu biçimidir. CECF ve CFCF yöntemleri tepki ömrünü artırmak ve böylece toplu tepki göre artan hacimsel protein verimleri neden. Bu yeni Reaktanları tepki2ders boyunca sağlanan süre tepki gemiden kaldırılacak protein sentezi yan sağlayarak gerçekleştirilir. CFCF söz konusu olduğunda, faiz protein tepki odasında CECF iken, protein yarı geçirgen membran36,37oluşan reaksiyon odasında faiz kalıntılarının da kaldırılabilir. Bu yöntemler özellikle zor express proteinler faiz38,39,40,41,42yoksul hacimsel verimi üstesinden değerlidir, 43. CECF ve CFCF yaklaşımlar uygulanmasında zorluklar 1) varken Onlar transkripsiyon ve translasyon için sorumlu biyo makinelerin daha verimli kullanılmasını sonucu, toplam maliyeti ve 2 artırır reaktifler özellikle büyük miktarda gerektirir vardır) Onlar daha karmaşık reaksiyon kurulumları ve özel ekipman için toplu iş biçimi44karşılaştırıldığında gerektirir. Yeni olan kullanıcılar için erişilebilirlik sağlamak için iletişim kuralları burada toplu biçimini mililitre ölçek tepki birime artırmak için özel öneriler ile 15 µL tepki hacimleri, odak nitelendirdi.
Burada sunulan yöntemleri sigara-uzmanlar (lisans öğrencisi gibi) temel laboratuvar becerileri ile hücre büyümesini uygulamak, hazırlık ayıklamak ve biçimi tepki Kur bir E. coliiçin toplu etkinleştirmek-tabanlı CFPS sistemi. Bu yaklaşım için piyasada kitleri tepki kiti tabanlı kurulum kolaylığı ödün vermeden uygun maliyetli karşılaştırılır. Ayrıca, bu yaklaşım uygulamaları laboratuvarında ve alan sağlar. CFPS her durumda üstün olmayabilir olarak CFPS uygulamaya karar verirken, yeni kullanıcılar başlangıç yatırım için geleneksel protein ifade sistemlerinin etkinliğini iyice değerlendirmelidir. CFPS yöntem tanımlamak burada doğrudan uygulayan uygulamaları, fonksiyonel genomik, test, alanının yanı sıra vivo içinde ifade için zorlu proteinleri yüksek üretilen iş de dahil olmak üzere çeşitli sağlamak biyosensörler ve sentetik Biyoloji eğitim setleri gibi uygulamalar. Metabolik Mühendisliği gibi ek uygulamalar protein ifade koşulları, hastalık algılama ve ölçek-up kullanarak CECF veya CFCF yöntemlerini hala mümkün ancak deneyim CFPS platformu ile daha fazla tepki değiştirilmesi için gerektirebilir ayarlama koşullar. Bizim yöntemleri hücre lizis sonication, en iyi duruma getirilmiş premiksler45kullanan bir basitleştirilmiş CFPS reaksiyon Kur tarafından takip aracılığıyla nispeten hızlı ve tekrarlanabilir yöntemleri ile zenginleştirilmiş medya ve şaşkın şişe, büyüme birleştirir. Hücresel büyüme yöntemleri biraz içinde bu alan standart haline iken, hücre lizis için yöntemleri büyük ölçüde değişmektedir. Sonication ek olarak, ortak lizis yöntemleri kullanımı bir Fransız basınında, bir homogenizer, boncuk Tokmaklar, veya lizozim ve diğer biyokimyasal ve fiziksel bozulma yöntemleri46,47,48, içerir. 49. bizim yöntemleri kullanarak, yaklaşık 2 mL ham hücre ekstresinin elde edilir hücre 1 L. Hücre özü bu miktarı dört yüz destekleyebilir 15 µL CFPS reaksiyonlar, her üreten ~ 900 µg/mL muhabir sfGFP protein şablon plazmid pJL1-sfGFP. Bu yöntem maliyeti $0.021/µg, üretilen sfGFP ($.019/µL, tepki), işgücü ve ekipman (tamamlayıcı şekil 1) maliyeti hariç. Sıfırdan başlayarak, bu yöntem 4 gün içinde tek bir kişi tarafından uygulanabilir ve CFPS reaksiyonlar (şekil 1) saat içinde tamamlanabilir yineleyin. Ayrıca, protokol birimdeki kullanıcı ihtiyaçlarına uygun reaktif hazırlık daha büyük toplu işlemler için ölçeklenebilir. Önemlisi, sadece temel laboratuvar becerileri gerektirir gibi burada sunulan Protokolü eğitim laboratuvarı sigara-uzmanlar gibi lisans öğrencileri tarafından uygulanabilir. Aşağıda açıklanan işlemler ve beraberindeki video E. coli CFPS platformu için geniş kullanım erişilebilirliğini geliştirmek için özel olarak geliştirilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">12795027</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">60353-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P9791-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">KOH</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IPTG</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(OAc)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tris(OAc)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DTT</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">tRNA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Folinic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NTPs</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Oxalic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NAD</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CoA</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PEP</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">K(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NH4(Glu)</td>
			<td style="width:145px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">02180595.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Mg(Glu)2</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Spermidine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Molecular Grade Water</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Aspartic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Valine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Alanine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Arginine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Asparagine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Glycine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Histadine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Proline</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Serine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L-Tyrosine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ultrasonic Processor</td>
			<td style="width:145px;">QSonica</td>
			<td style="width:123px;">Q125-230V/50Hz</td>
			<td>3.175 mm diameter probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1L Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microfuge 20</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cytation 5</td>
			<td style="width:145px;">BioTek</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Strep-Tactin XT Starter Kit</td>
			<td style="width:145px;">IBA</td>
			<td style="width:123px;">2-4998-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">pJL1-sfGFP</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:145px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Son 50 yılda, boş hücre Protein sentezi (CFPS) tüp bebek hücrelerde transkripsiyon ve çevirim kapasitesi koşum için güçlü bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Hücre canlılığı korumanıza gerek obviating tarafından ve hücresel bariyer ortadan kaldırarak CFPS hızlı prototipleme için geleneksel olarak zorlu proteinlerin biomanufacturing ortaya çıkan uygulamalarda yanı sıra uygulamaları temel olmuştur metabolik Mühendisliği ve fonksiyonel genomik. Bir E. coliuygulamak için bizim yöntemleri-tabanlı CFPS platformu bırakmak bu uygulamaların birçoğu erişmek yeni kullanıcı. Burada, özü zenginleştirilmiş medya, şaşkın şişeler ve akort sonication tabanlı hücre lizis tekrarlanabilir yöntemi kullanılarak hazırlamak için yöntemleri açıklanmaktadır. Uygun reaktif stokları önceden hazırlanmış göz önüne alındığında bu özü sonra protein ifade 900 µg/mL veya daha fazla süper klasör yeşil flüoresan protein (sfGFP) veri analizi, deneysel kurulum sadece 5 h üretebilen için kullanılabilir. Reaktifler elde etme tahmini başlangıç maliyeti 4500 $ $0.021 µg üretilen protein başına veya 0.019 $ µL tepki başına tahmini ücret karşılığında tepkiler binlerce sürdürmek olduğunu. Ayrıca, protein ifade yöntemleri piyasada bulunan sistemlerde reaktif öncesi karışımları, bir kısmını maliyeti duruma getirilmesi nedeniyle görülen tepki kurulum kolaylığı ayna. Geniş uygulamaları için CFPS platform esnek doğası kaldıraç sağlamak için biz bu şekilde ayarlanmış ve kullanılabilir kaynakları ve protein ifadesi sonuçlar bağlı olarak en iyi duruma getirilmiş platformu yönlerini çeşitli belirledik istenen.

Biz özü sonication tabanlı E. coli sundu dört gün span boyunca her gün üzerine yordam dökümü gösteren şekil 1 ile tamamlanabilir hazırlık protokolü. Her gün çeşitli duraklatma puan ile tamamlanabilir adımlara yumuşaklık, ama biz yürütmek en etkili olduğu için bu iş akışını bulduk. Ayrıca, hücre granül (Adım 1.3.18) ve tam olarak hazırlanan özü (Adım 2.10) en az bir yıl için kullanıcı her bir sonraki saat<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology at JoVE.com

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-boş hücre Protein sentezi dayalı: sağlam, esnek ve erişilebilir platform teknolojisi için iletişim kuralları

Bu iletişim kuralı adımları, maliyetleri ve ekipman E. colioluşturmak için gerekli ayrıntıları-hücre özleri dayalı ve 4 gün içinde veya daha az vitro protein sentez reaksiyonları uygulamak. Bu platformun geniş uygulamalar için esnek yapısı kullanabilmeniz için biz uyarlanmış ve en iyi duruma getirilmiş reaksiyon koşulları tartışıyorlar.

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Bu protokol, uzman olmayanların kendi kendine yeniden protein sentezini uygulama yöntemlerini basitleştirir ve açıklar. Bu yöntemlere daha iyi erişim, platformun ve sağladığı geniş uygulama kümesinin pazardan arındırılmasını sağlayacaktır. Bu tekniğin başlıca avantajları hız, maliyet-etkinlik ve reaksiyon kolaylığı diğer kendini yeniden protein sentezplatformları ile karşılaştırıldığında kurmak vardır.Platformumuz fonksiyonel genomik, hythopertesting, biyosensörler, eğitim kitleri ve küçük değişiklikler, metabolik mühendislik ve genetik kod genişletme dahil olmak üzere bir dizi uygulama sağlayabilir. Bu teknik sadece temel laboratuvar eğitimi gerektirir ken, yeni kullanıcılar protokolün başarılı bir şekilde yürütülmesi için sonication gibi teknikler kendilerini tanımak için plan gerekir. Bu yordamı başlatmak için metin protokolünde belirtildiği gibi tüm medya ve kültür E.coli hücreleri hazırlamak.Bir buzlu su banyosu içine bir litre santrifüj şişe yerleştirin. Bir kez kültürler OD600 3.0 ulaşır, soğutulmuş şişe içine hücre kültürü dökün. Bir çift ışın dengesi kullanarak, santrifüj için bir denge oluşturmak için ilk olarak aynı tartmak kadar ikinci bir litre santrifüj şişe su ekleyin.Santrifüjü dört santigrat dereceye kadar önceden soğuttuktan sonra, şişeleri 5, 000 g ve 10 santigrat derecede 10 derecede santrifüj edin ve hücreleri peletleyin. Bundan sonra, yavaş yavaş dökün ve supernatant atın. Hücre peletini buza yerleştirin.Steril bir spatula kullanarak santrifüj şişeden hücre pelet kazımak ve soğuk, 50 mililitrekonik tüp aktarın. İki milimolar DTT ile takviye soğuk S30 tampon 30 mililitre ekleyin ve pelet tamamen hiçbir parça ile resuspended kadar buz üzerinde dinlenme süreleri ile kısa patlamalar girdap tarafından pelet yeniden askıya. Bundan sonra, 10 dakika boyunca 5, 000 g ve 10 santigrat derece numune santrifüj için bir denge olarak su ile dolu başka bir 50 milimetre konik tüp kullanın.Dökün ve supernatant atın. 20 ila 25 mililitre soğuk S30 tamponu ile peleti yeniden askıya alın. Santrifüj 5, 000 g ve 10 santigrat derecede 10 dakika.Dökün ve supernatant atın. Daha sonra, 30 mililitre S30 arabelleği ekleyin ve daha önce açıklandığı gibi bir girdap kullanarak peleti yeniden askıya alın. Üç önceden tartılmış, soğuk, 50 mililitrekonik tüpler ayarlayın.Steril pipetli serolojik pipet dolgusu kullanarak, her tüpe on 10 mililitre pelet süspansiyon uyguluyor. 5, 000 g ve 10 santigrat derecede gerektiğinde uygun terazileri kullanarak tüm tüpleri 10 dakika santrifüj edin. Bundan sonra, dışarı dökün ve supernatants atın.Pelet dokunmaktan kaçınmak için emin yaparken, erişim tampon kaldırmak için temiz bir doku ile her tüp ve kap içinde dikkatlice silin. Analitik bir denge kullanarak, tüpleri yeniden tartar ve her tüp için son pelet ağırlığını rapor edin. Başlamak için, her pelet hücre kütlesinin bir gram başına 2 milimolar DTT ile soğuk S30 tampon bir mililitre ekleyin.Daha önce açıklandığı gibi peletleri yeniden askıya almak için bir girdap kullanın. Daha sonra her resuspended pelet 1.4 mililitre ayrı 1.5 mililitre Microcentrifuge tüpler içine aktarın. Bir tüpü bir kabın içinde buzlu su banyosuna yerleştirin ve tüpün altlarına veya kenarlarına değmeyecek şekilde sonicator sondasını yerleştirin.45 saniye boyunca %50 genlik seti ile tüpü sonicate, ardından 59 saniye dinlenme. Kapalı dönemlerde tüpleri kapatıp ters çevirdiğinden emin olun. Sonication tamamlandıktan hemen sonra, lysate içine bir azı dtt 4.5 mikrolitre ekleyin.Tüpü karıştırmak için birkaç kez ters çevirin ve sonra buz üzerine yerleştirin. Bu işlemi tekrarlayın, sonicating ve resuspended hücrelerin her tüp için DTT ekleyerek. 18, 000 g ve 4 santigrat derece 10 dakika boyunca örnekleri santrifüj.Bundan sonra, pipet her supernatant yeni bir 1.5 mililitre Mikrocentrifuge tüp içine, pelet rahatsız olmadığından emin olmak için arkasında bazı supernatant bırakarak. Bir kuvöz sallayarak platformuna supernatant tüpleri alın ve 60 dakika boyunca 250 RPM sallayarak 37 santigrat derece onları kuluçka. Bu ikinci tur tepkisi.Daha sonra, 10, 000 g ve 10 dakika boyunca dört santigrat derece de örnekleri santrifüj. Yeni tüpler e aktarılan pelet rahatsız etmeden her supernatant çıkarın. Depolama için ekstre birçok 100 mikrolitre aliquots oluşturun.İlk olarak, çözülme çözeltisi A, b çözeltisi, DNA şablonu, BL21DE3 özü, T7 RNA Polimeraz ve buz üzerinde moleküler sınıf su aliquot. Daha sonra, CFPS reaksiyonu için gerekli olan Mikrosentrifuge tüpleri gerekli miktarda etiket. Pipetleme veya girdap ile her reaktif karıştırın, sonra etiketli reaksiyon tüpü ne solüsyon ekleyin, hücre ekstresi girdap değil emin olun ama bunun yerine karıştırmak için tüp ters.Son reaksiyonun iyi bir şekilde karıştırıldığından emin olun ve her tüpün alt kısmında 15 mikrolitrelik tek bir boncuk halinde birleştirin. Her reaksiyonu 4 saat boyunca 37 derecede sitsimadan veya bir gecede 30 santigrat derecede inkübedin. Başlamak için, bir 96 iyi plaka almak ve 0.05 molar HEPES 48 mikrolitre pH 8 her iyi nicelleştirme için gerekli içine yükleyin.Daha sonra, reaksiyon tüplerini kuvözden çıkarın. Her reaksiyonu yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın ve her reaksiyonun iki mikrolitresini HEPES içeren kuyulara aktarın. Yukarı ve aşağı borulama her iyi karıştırın.Tüm reaksiyonlar yüklendikten ve karıştırıldıktan sonra plakayı bir florometreye yükleyin ve 485 nanometre uyarma dalga uzunluğu ve 510 nanometre lik emisyon dalga boyu kullanarak SFGFP uç noktası floresanlarını ölçün. Elde edilen floresan okumadan süper klasörlenmiş GFP konsantrasyonu belirlemek için önceden oluşturulmuş bir standart eğri kullanın. Bu çalışmada, bir sonication tabanlı E.coli ekstresi hazırlık araştırılmıştır.Hücre peletleri ve hücre ekstresi en az bir yıl boyunca negatif 80 santigrat derecede kararlıdır. Ayrıca, hücre ekstresi verimlilik önemli bir kaybı olmadan en az beş donma-çözülme döngüleri uğrayabilir. Bu protokoldeki bazı adımlar, sistemin genel üretkenliğine zarar vermeden çeşitli olabilir.En önemlisi, hücreler hücre ekstresi verimliliği üzerinde önemli bir etkisi olmadan 600 nanometre 2.7 ila 4.0 optik yoğunluk aralığında hasat edilebilir. Ancak, şablon DNA kalitesi CFPS reaksiyonunun hacimsel verimini etkileyen toplu iş-toplu değişkenlik kaynağıdır. Bu bir Midi veya Maxiprep ile DNA arındırıcı tarafından ek bir DNA temizleme adımı takip çözülür.Reaksiyon kabı cfps reaksiyonunun hacimsel verimini de etkiler. Yüzey alanından hacim oranına bir artış, daha yüksek hacimsel verim ile sonuçlanır. CFPS reaksiyonunun hacimsel verimini optimize etmek ve hücre ekstresinin toplu-toplu değişkenliğini azaltmak için, her yeni ekstre hazırlığı için bir magnezyum titrasyonu yapılmalıdır.Hücre ekstreleri mililitre toplam protein başına 30 miligram oluşan için, reaktif kullanımını en aza indirmek ve hacimsel verimi en üst düzeye çıkarmak için optimal magnezyum konsantrasyonu ve ekstresi hacmi sırasıyla 10 milimolar ve beş mikrolitre. Reaksiyon ölçeğini değiştirerek, kullanıcılar yüksek iş elde taramadan hedef proteinin daha büyük ölçekli ifadelerine kadar çeşitli yöntemler izleyebilirsiniz. Bu teknik iki temel avantaj sağlar, ilk protein ürünlerini daha hızlı bir şekilde teşler, ikincisi ise proteinleri ifade etmek zor sentezler.Örnekler sitotoksik veya işlevleri için oksitleyici koşullar gerektiren proteinler içerir. Herhangi bir laboratuvar prosedüründe olduğu gibi, tüm reaktifler dikkatli davranılmalıdır. Ayrıca, santrifüjler her zaman dengeli olmalı ve kulak koruma sonication sırasında kullanılmalıdır.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Particles without a Box: Brush-first Synthesis of Photodegradable PEG Star Polymers under Ambient Conditions

Koli olmadan Parçacıklar: Ortam Koşullarında fotoaynşmaya PEG Yıldız Polimerlerin Fırça-ilk Sentez

Convenient methods for the rapid, parallel synthesis of diversely functionalized nanoparticles will enable discovery of novel formulations for drug ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Fonksiyonlu Sentezi ve Karakterizasyonu Metal-organik Altyapıları

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis of Poly(N-isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Synthesis of PolyN-isopropylacrylamide Janus Microhydrogels for Anisotropic Thermo-responsiveness and Organophilic/Hydrophilic Loading Capability

Poli Sentezi (<em&gt; K</em&gt; -isopropylacrylamide) Yönbağımlı Termo yanıt ve organofilik / Hidrofilik Yükleme Kapasitesi için Janus Microhydrogels

Janus microparticles are compartmentalized particles with differing molecular structures and/or functionality on each of their two sides. Because of this ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Supramoleküler Kolloidlerin Sentezi ve Karakterizasyonu

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Protein Bioconjugatlar sentezi<em&gt; yoluyla</em&gt; Sistein-maleimid Kimya

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

Balık Yağı Takviyeler Lipid Profilinin Rapid Değerlendirilmesi için Sağlam Aracı Olarak NMR Spektroskopisi

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Çekirdek kabuğu Lanthanide katkılı Upconversion Nanocrystals hücresel uygulamalar için sentezi

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

Chemical Synthesis of Porous Barium Titanate Thin Film and Thermal Stabilization of Ferroelectric Phase by Porosity-Induced Strain

Kimyasal sentez gözenekli baryum Titanate ince Film ve Ferroelectric faz porozite indüklenen gerilim tarafından termal stabilizasyon

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

Bir yarıiletken Gyroidal Metal-kükürt çerçeve kristalleşme için Thiol yapı taşı sentezi

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 boncuk hazırlanması için Protein Saflaştırma

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...